普氏原羚SSR分子标记组合、引物组合、试剂盒和应用

普氏原羚ssr分子标记组合、引物组合、试剂盒和应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及普氏原羚ssr分子标记组合、引物组合、试剂盒和应用。


背景技术：

2.普氏原羚(procapraprzewalskii)，隶属偶蹄目，牛科，原羚属，是青藏高原特有动物，现在仅分布在青海湖周围区域，是青海海湖流域的旗舰物种，是我国一级重点保护野生动物。随着各种保护措施的实施和保护力度的加强，普氏原羚种群数量恢复较快，2022年5月青海省林业和草原局公布数据显示普氏原羚野外成年个体超过2800只。
3.简单重复序列(single sequence repeats,ssr)，也叫作微卫星(microsatellite)序列，是以1-6个核苷酸为重复单位，多次重复使之能产生串联重复序列，几乎存在于整个基因组，且不一样的等位基因间重复单元和重复次数的不同使其具有多态性。
4.目前，许多学者对普氏原羚的种群分布和种群数量、生境选择、采食对策和食性、受胁因素等开展了大量研究。也有学者采用线粒体分子标记开展普氏原羚种群遗传多样性研究。然而现有技术中并没有利用ssr标记对普氏原羚进行个体识别的相关报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供普氏原羚4碱基ssr分子标记组合、引物组合、试剂盒和应用，本发明基于普氏原羚全基因组测序数据开发多态性ssr标记，满足了普氏原羚个体识别需求。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了普氏原羚ssr分子标记组合，所述ssr分子标记组合包括pr-6、pr-7、pr-8、pr-10、pr-12、pr-14、pr-16、pr-22、pr-25、pr-26、pr-28、pr-30、pr-40、pr-42、pr-46、pr-53、pr-58、pr-63、pr-64、pr-65、pr-69、pr-71、pr-72、pr-85、pr-86、pr-97中的一种或几种；所述ssr标记依次由以下引物对扩增得到，所述引物对的序列如seq id no.1-2、seq id no.3-4、seq id no.5-6、seq id no.7-8、seq id no.9-10、seq idno.11-12、seq id no.13-14、seq id no.15-16、seq id no.17-18、seq id no.19-20、seq id no.21-22、seq id no.23-24、seq id no.25-26、seq id no.27-28、seq id no.29-30、seq id no.31-32、seq id no.33-34、seq id no.35-36、seq id no.37-38、seq id no.39-40、seq id no.41-42、seq no.43-44、seq id no.45-46、seq id no.47-48、seq id no.49-50、seq id no.51-52所示。
8.优选的，所述ssr分子标记组合为pr-6、pr-8、pr-12、pr-22、pr-25、pr-30、pr-40、pr-58、pr-63、pr-69、pr-71、pr-72、pr-85、pr-86和pr-97。
9.本发明还提供了普氏原羚ssr分子标记引物组合，包括以下任意一个或几个引物对，所述引物对的序列如seq id no.1-2、seq id no.3-4、seq id no.5-6、seq id no.7-8、
seq id no.9-10、seq id no.11-12、seq id no.13-14、seq id no.15-16、seq id no.17-18、seq id no.19-20、seq id no.21-22、seq id no.23-24、seq id no.25-26、seq id no.27-28、seq id no.29-30、seq id no.31-32、seq id no.33-34、seq id no.35-36、seq id no.37-38、seq id no.39-40、seq id no.41-42、seq no.43-44、seq id no.45-46、seq id no.47-48、seq id no.49-50、seq id no.51-52所示。
10.本发明还提供了一种识别普氏原羚个体的试剂盒，包括上述的ssr分子标记引物组合。
11.优选的，所述试剂盒还包括基因组提取试剂和pcr反应试剂。
12.优选的，所述试剂盒还包括毛细管电泳中的试剂。
13.本发明还提供了上述ssr分子标记引物组合，或上述的试剂盒在普氏原羚个体识别分析中的应用。
14.本发明还提供了上述ssr分子标记引物组合，或上述的试剂盒在普氏原羚群体遗传多样性检测中的应用。
15.本发明还提供了一种普氏原羚个体识别的方法，包括：提取普氏原羚样本的dna，以上述的引物分别对所述基因组dna进行pcr扩增，并进行毛细管电泳，确定上述ssr分子标记位点的基因型，进行个体识别；当所述ssr分子标记位点的基因型都相同或仅有一个位点上的一个基因型不同，则判定为同一个体。
16.优选的，所述样本包括粪便或组织。
17.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
18.本发明基于普氏原羚全基因组测序数据，进行ssr引物设计和ssr位点的筛选，得到的26对ssr引物能够稳定扩增出目标产物，且具有高度多态性，可用于普氏原羚群体遗传多样性检测、群体遗传结构分析、进化与亲缘关系研究。筛选得到的普氏原羚多态性ssr分子标记组合，可对普氏原羚进行个体识别，准确率高。
19.实验结果表明，本发明普氏原羚ssr分子标记组合可满足个体识别需求，对33份普氏原羚亚成体粪便样品个体识别，其来自24个不同个体，这与江西沟普氏原羚救护中心普氏原羚亚成体个数一致。
附图说明
20.图1为33份普氏原羚亚成体粪便样品；
21.图2为部分普氏原羚粪便样本基因组总dna琼脂糖凝胶电泳图；最左边为100bp的dna ladder(dye plus)(takara)，1-15为普氏原羚dna样品；
22.图3为15个普氏原羚样本26个ssr位点的等位基因频率；
23.图4为筛选用于个体识别的15个ssr位点的一致性概率；
24.图5为普氏原羚个体识别样本2501(a)、3201(b)、3203(c)、3306(d)的ssr位点毛细管电泳图。
具体实施方式
25.本发明提供了普氏原羚ssr分子标记组合，所述ssr分子标记组合包括pr-6、pr-7、pr-8、pr-10、pr-12、pr-14、pr-16、pr-22、pr-25、pr-26、pr-28、pr-30、pr-40、pr-42、pr-46、
pr-53、pr-58、pr-63、pr-64、pr-65、pr-69、pr-71、pr-72、pr-85、pr-86、pr-97中的一种或几种；所述ssr标记依次由以下引物对扩增得到，所述引物对的序列如seq id no.1-2、seq id no.3-4、seq id no.5-6、seq id no.7-8、seq id no.9-10、seq id no.11-12、seq id no.13-14、seq id no.15-16、seq id no.17-18、seq id no.19-20、seq id no.21-22、seq id no.23-24、seq id no.25-26、seq id no.27-28、seq id no.29-30、seq id no.31-32、seq id no.33-34、seq id no.35-36、seq id no.37-38、seq id no.39-40、seq id no.41-42、seq no.43-44、seq id no.45-46、seq id no.47-48、seq id no.49-50、seq id no.51-52所示。
26.在本发明中，所述ssr分子标记组合优选为pr-6、pr-8、pr-12、pr-22、pr-25、pr-30、pr-40、pr-58、pr-63、pr-69、pr-71、pr-72、pr-85、pr-86和pr-97。一致性概率检测结果显示上述15个ssr分子标记组合即可满足个体识别需求。
27.本发明还提供了普氏原羚ssr分子标记引物组合，包括以下任意一个或几个引物对，所述引物对的序列如seq id no.1-2、seq id no.3-4、seq id no.5-6、seq id no.7-8、seq id no.9-10、seq id no.11-12、seq id no.13-14、seq id no.15-16、seq id no.17-18、seq id no.19-20、seq id no.21-22、seq id no.23-24、seq id no.25-26、seq id no.27-28、seq id no.29-30、seq id no.31-32、seq id no.33-34、seq id no.35-36、seq id no.37-38、seq id no.39-40、seq id no.41-42、seq no.43-44、seq id no.45-46、seq id no.47-48、seq id no.49-50、seq id no.51-52所示。
28.每个位点的等位基因数量越多，群体多态性越丰富。本发明普氏原羚ssr分子标记引物组合扩增产物中一共检测出143个等位基因，等位基因数量从2(pr-97)～10(pr-14)不等。可见，本发明上述26个普氏原羚ssr分子标记引物组合，能够稳定扩增出目标产物，且具有高度多态性，可用于普氏原羚群体遗传多样性检测、群体遗传结构分析、进化与亲缘关系研究等。
29.本发明还提供了一种识别普氏原羚个体的试剂盒，包括上述的ssr分子标记引物组合。
30.本发明所述试剂盒还优选包括基因组提取试剂和pcr反应试剂。
31.本发明所述试剂盒还优选包括毛细管电泳中的试剂。
32.本发明还提供了上述ssr分子标记引物组合，或上述的试剂盒在普氏原羚个体识别分析中的应用。
33.本发明利用普氏原羚ssr分子标记组合中的15个位点对33份普氏原羚亚成体粪便样品个体识别，实验结果表明，33份普氏原羚亚成体粪便样品来自24个不同个体，这与江西沟普氏原羚救护中心普氏原羚亚成体个数一致。
34.本发明还提供了上述ssr分子标记引物组合，或上述的试剂盒在普氏原羚群体遗传多样性检测中的应用。
35.本发明上述26个普氏原羚ssr分子标记引物组合，能够稳定扩增出目标产物，且具有高度多态性，可用于普氏原羚群体遗传多样性检测、群体遗传结构分析、进化与亲缘关系研究等。
36.本发明还提供了一种普氏原羚个体识别的方法，包括：提取普氏原羚样本的dna，以上述的引物分别对所述基因组dna进行pcr扩增，并进行毛细管电泳，确定上述ssr分子标
记位点的基因型，进行个体识别；当所述ssr分子标记位点的基因型都相同或仅有一个位点上的一个基因型不同，则判定为同一个体。
37.本发明所述样本优选包括粪便或组织，更优选为粪便；所述组织更优选包括皮毛、肌肉、血液。
38.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
39.本发明实施例中所使用的实验样品、实验试剂、实验仪器与设备如下：
40.1、实验样品
41.多态性ssr位点筛选所用的15份普氏原羚粪便样品采自青海省海晏县、共和县和刚察县，野外采集到新鲜粪便样品后立即保存于液氮中，回到实验室后转移至-80℃冰箱保存，直至基因组总dna提取。
42.个体识别样品采自江西沟普氏原羚救护中心，2022年4月在救护中心采集普氏原羚亚成体粪便样品，连续采集4天，每天采集2次，以保证采集到所有普氏原羚亚成体的粪便样品。4天共采集到的33份亚成体粪便样品(如图1所示)。
43.2、实验试剂
44.qiaamp fast dna stool mini kit、takara ex taq hot start version、无水乙醇、100bp dna ladder、6
×
loading buffer、50
×
tae、琼脂糖、溴化乙锭(ethidiumbromide，eb)。
45.3、实验仪器与设备
46.abi 3730xl基因分析仪、abi veriti温度梯度pcr仪、nanodrop 2000c分光光度计、bio-rad电泳仪系统、bio-rad凝胶成像系统、密理博纯水系统、高速冷冻离心机、高压灭菌锅、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、漩涡振荡器、制冰机、恒温水浴锅、电子天平、eppendorf移液器、微波炉。
47.实施例1
48.普氏原羚粪便基因组总dna提取与检测
49.采用试剂盒法，所用试剂盒为qiaamp fast dna stool(51604)。
50.准备阶段确保缓冲aw1和缓冲aw2已经按照试剂盒标签上的说明准备。使用前将缓冲液混合均匀。如果在bufferasl或bufferal中有沉淀形成，在70℃水浴锅内加热至溶解。
51.(1)dna提取首先称取180～220mg粪便于2ml离心管置于冰上做预处理。
52.(2)向样品中加入1ml缓冲液inhibit ex buffer，间歇振荡涡旋1～2min至样品完全同质化。
53.(3)全速14000rpm离心1.5min，使粪便沉淀到离心管底部。
54.(4)取25μl蛋白酶k进入一个新的2ml微离心管。
55.(5)从第3步离心管中吸取600μl上清液于有蛋白酶k的2ml离心管中。
56.(6)加600μlbufferal涡旋15s，使溶液充分混合。
57.(7)70℃孵育10min，中途颠倒混匀1～2次，减少离心收集管盖上的液滴。放置到冰上冷却。
58.(8)在裂解液中加600μl预冷的无水乙醇溶液，涡旋混匀。减少离心收集管盖上的液滴。
59.(9)将上一步所得溶液取600μl加入到一个吸附柱中(吸附柱放入2ml收集管)。全速14000rpm离心1.5min，倒掉废液，把吸附柱放入新的收集管中。
60.(10)打开柱子的盖子，加入另外600μl的裂解液，全速14000rpm离心1.5min，倒掉废液，把吸附柱放入新的收集管中。
61.(11)重复上一步将第三份600μl的裂解液负载到柱子上。全速14000rpm离心1.5min，倒掉废液，将吸附柱放入新的收集管中。
62.(12)加入500μl bufferaw1到柱子中。盖紧离心管盖，全速14000rpm离心1.5min。将离心管取出，放入一新的2ml收集管中。丢弃旧收集管及其中液体。
63.(13)加入500μl bufferaw2到柱子中。盖紧离心管盖，以全速14000rpm离心3min。把离心管取出，放入新的2ml收集管中。丢弃旧收集管及其中液体。
64.(14)将离心管取出，放入新的2ml收集管中后以全速14000rpm离心3min。将柱子转移到新的1.5ml离心管中，小心加入200μlbufferate，室温下静置2min，全速14000rpm离心2min，把dna洗脱下来。将1.5ml离心管中的dna样品迅速放于-20℃冰箱。
65.dna提取完成后用nanodrop 2000c分光光度计检测dna浓度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，具体结果见图2和表1。
66.表1基因组总dna浓度检测结果
[0067][0068]
由图2可知，所提取的基因组总dna都有一条较亮的主带，说明dna质量较完整。由表1可知，普氏原羚基因组总dna浓度在2.6(样品3309)-57.7(样品3302)ng/μl之间，可以用于后续pcr实验。
[0069]
实施例2
[0070]
ssr引物初筛与多态性检测
[0071]
1、ssr选择与引物设计
[0072]
利用misa微卫星筛选软件扫描整个普氏原羚基因组，对重复序列为4-6bp，重复数大于8的ssr位点进行识别，共获得1632个满足条件的ssr位点。从重复单元为4bp，重复次数在10～70之间的ssr位点中，每条染色体随机选取5～6个位点，共计150个位点，利用ssr位点上下游序列，通过primer3软件进行引物设计。
[0073]
引物设计遵循以下原则：引物长度应为18-23bp；引物tm值应为55～63℃，最适温度59℃左右；正反引物的tm差≤5℃。
[0074]
在成功设计引物的137个位点中，每条染色体随机选择3～5个位点，共计100对引物，委托生工生物工程(上海)有限公司合成引物，用于后续pcr扩增。
[0075]
2、pcr扩增与特异性检测
[0076]
pcr反应体系(20μl)见表2，pcr扩增在abi veriti温度梯度pcr仪上进行，第一轮pcr扩增条件见表3。
[0077]
表2pcr反应体系(20μl)
[0078][0079]
表3pcr反应程序
[0080][0081]
将pcr扩增产物取3μl进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，220v电压15分钟，筛选能够进行特异性扩增的ssr位点。
[0082]
对扩增结果不理想的进行反应条件优化。对电泳结果出现条带较浅或者条带拖尾的情况，优化pcr扩增条件。当条带较浅时，循环数从35个循环增加到37个循环；出现电泳图条带拖尾的情况，提高退火温度，退火温度从60℃提高到63℃，如果出现多个条带，就证明该微卫星位点不具有特异性；没有条带出现时，降低退火温度，退火温度从60℃调整到57℃。有8个位点进行了pcr反应条件的优化(表4)。
[0083]
表4pcr反应程序件优化情况表
[0084][0085]
3、毛细管电泳多态性检测
[0086]
在15个个体中，选择3个dna模板对100个ssr位点进行pcr扩增，pcr产物经过琼脂糖凝胶电泳，从中筛选出特异性扩增ssr位点60个。
[0087]
用带荧光的接头引物和正向引物进行pcr扩增，扩增体系及条件同前。扩增产物在3037xl基因分析仪进行毛细管电泳检测多态性，具体步骤如下：
[0088]
(1)将hidi与500的内标按130：1混合，配成mix。
[0089]
(2)用96孔反应板进行分装mix，每个孔加入10μlmix。
[0090]
(3)在96孔板中加入0.5μl的pcr产物，开始离心，到4000rpm停止。
[0091]
(4)用金属浴加热器在95℃下加热5min，使混合板预变性，拿出后应立即放入-20℃。
[0092]
(5)冷却后拿出，4000rpm离心，解冻、混匀。
[0093]
(6)3037xl基因分析仪进行毛细管电泳。
[0094]
(7)获取下机结果并分析。
[0095]
毛细管电泳检测出26对多态性较高的引物，引物特征见表5。
[0096]
表526对高多态性ssr位点引物特征
[0097]
[0098][0099]
对26个多态性ssr位点进一步进行多态性分析。
[0100]
4、ssr位点多态性分析
[0101]
使用popgene1.31分别计算26对引物15个样本的等位基因数na、有效等位基因数ne、观测杂合度he和期望杂合度ho，使用powermarker3.25计算其多态性信息含量pic。利用分析软件powermarker3.25对26个ssr位点的多态性进行评估。具体结果见表6和图3。
[0102]
表6成功扩增的26对引物的多态性特征
[0103]
[0104][0105]
每个位点的等位基因数量越多，群体多态性越丰富。本发明26对引物的扩增产物中一共检测出143个等位基因，等位基因数量从2(pr-97)～10(pr-14)不等。
[0106]
多态信息含量pic是通过等位基因频率计算出来的，可以反应ssr位点的多样性程度，当pic》0.5时，说明该位点多样性高，属于高度多态性座位；当pic《0.25时，说明该位点多样性水平低，属于低度多态性座位；而当pic值处于0.25～0.5之间时，说明该位点多样性水平中等，属于中度多态性座位。本发明26对ssr引物中有22个高度多态性位点，整体pic值在0.3566(pr-97)～0.8122(pr-14)之间，平均值为0.7431，表明本发明ssr位点具有较高的多态性。
[0107]
ssr位点的期望杂合度(he)越高，说明群体遗传一致性越低，即群体的遗传多样性越高。本发明26个ssr位点he在0.4805(pr-97)～0.8598(pr-14)之间，平均值为0.7117
±
0.1008，而观测杂合度ho0.2667(pr-8)～1.0000(pr-30、pr-40)之间，平均值为0.6436
±
0.1968。综合本发明26对引物扩增得到的等位基因数为5.5
±
1.8815，有效等位基因数为
3.4926
±
1.0190，该结果说明普氏原羚种群具有较高的遗传多样性。
[0108]
由图3可知，26个ssr位点的等位基因频率最高为0.7，最低为0.03333。
[0109]
可见，本发明所涉及的引物能够稳定扩增出目标产物，且具有高度多态性，可用于普氏原羚群体遗传多样性检测、群体遗传结构分析、进化与亲缘关系研究等。
[0110]
实施例3
[0111]
ssr位点个体识别能力分析
[0112]
1、ssr位点一致性概率值的测定
[0113]
一致性概率值是指在一个种群中任意选取两个个体具有相同基因型的概率。通过此方法确定使用的ssr位点的数目是否可以达到个体识别。一致性概率值pisibs的出现则可以得到完成个体识别所需要的基因座数目的保守下限。本研究根据15份样本ssr多态性位点检测结果，使用genalexv6.502对15个个体26个位点的基因型进行分析，计算一致性概率值(pi和pisibs)，具体结果见图4。
[0114]
由图4可知，pr-6，pr-8，pr-12，pr-22，pr-25，pr-30，pr-40，pr-58，pr-63，pr-69，pr-71，pr-72，pr-85，pr-86，pr-97，这15个ssr位点的pi值为8.9020
×
10-11
，表明利用该组合进行个体识别时，随机选取2个普氏原羚个体，单倍型相同的概率为8.9020
×
10-11
；pisibs值为4.1834
×
10-5
，表明在考虑亲缘关系的情况下，任意两个普氏原羚个体该ssr位点组合单倍型相同的概率为4.1834
×
10-5
。利用该组合进行个体识别能达到万分之一的识别率，普氏原羚目前种群数量只有几千只，万分之一的识别率能够满足普氏原羚个体识别的需求。可见，该ssr位点组合可以满足普氏原羚个体识别需求。
[0115]
2、江西沟普氏原羚救护中心普氏原羚亚成体个体识别
[0116]
利用获得的15个ssr位点，通过pcr扩增和毛细管电泳对江西沟普氏原羚救护中心采集的33份普氏原羚亚成体进行个体识别，部分电泳结果见图5。用microsatellite tool kit程序来搜索数据中相匹配的基因型，并与救护中心亚成体实际动物个体数目比较，检测识别开发的ssr位点的识别能力及准确性，具体结果见表7。
[0117]
鉴别个体时遵循以下原则：所有微卫星座位上的基因型都相同或是仅有一个位点上的一个基因型不同视为同一个体。
[0118]
表733个普氏原羚亚成体粪便样品15个ssr位点基因型对比结果
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123][0124]
由表7中可以看出，样品218和样品403，样品301和样品429，样品304和样品446，样品308和样品319，样品408和样品448基因型完全一致，这五组粪便样品每组样品均来自同一个体；样品230和样品323各位点均具有相同的基因型，样品406与样品230、样品323分别只有1个基因型的差异，判断这三份粪便样品来自同一个体；样品215和样品409，样品216和样品410仅有一个基因型的差异，根据判定标准判定这两组样品分别来自同一个体。
[0125]
综上，3份粪便样品来自同一个体的有1组(230-323-406)，2份粪便样品来自同一
个体的有7组(218-403、301-429、304-446、308-319、408-448、215-409、216-410)，以上结果表明检测的33份普氏原羚亚成体粪便样品来自24个普氏原羚个体，根据救护中心记录，2020年普氏原羚新生存活个体数量为9只，2021年新生存活个体数量为15只，即至2022年4月亚成体有24只，表明分子识别结果与实际情况一致。可见，本发明15个ssr位点开展普氏原羚的个体识别结果可靠。
[0126]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.普氏原羚ssr分子标记组合，其特征在于，所述ssr分子标记组合包括pr-6、pr-7、pr-8、pr-10、pr-12、pr-14、pr-16、pr-22、pr-25、pr-26、pr-28、pr-30、pr-40、pr-42、pr-46、pr-53、pr-58、pr-63、pr-64、pr-65、pr-69、pr-71、pr-72、pr-85、pr-86、pr-97中的一种或几种；所述ssr分子标记组合依次由以下引物对扩增得到，所述引物对的序列如seq id no.1-2、seq id no.3-4、seq id no.5-6、seq id no.7-8、seq id no.9-10、seq id no.11-12、seq id no.13-14、seq id no.15-16、seq id no.17-18、seq id no.19-20、seq id no.21-22、seq id no.23-24、seq id no.25-26、seq id no.27-28、seq id no.29-30、seq id no.31-32、seq id no.33-34、seq id no.35-36、seq id no.37-38、seq id no.39-40、seq id no.41-42、seqno.43-44、seq id no.45-46、seq id no.47-48、seq id no.49-50、seq id no.51-52所示。2.根据权利要求1所述的普氏原羚ssr分子标记组合，其特征在于，所述ssr分子标记组合为pr-6、pr-8、pr-12、pr-22、pr-25、pr-30、pr-40、pr-58、pr-63、pr-69、pr-71、pr-72、pr-85、pr-86和pr-97。3.普氏原羚ssr分子标记引物组合，其特征在于，包括以下任意一个或几个引物对，所述引物对的序列如seq id no.1-2、seq id no.3-4、seq id no.5-6、seq id no.7-8、seq id no.9-10、seq id no.11-12、seq id no.13-14、seq id no.15-16、seq id no.17-18、seq id no.19-20、seq id no.21-22、seq id no.23-24、seq id no.25-26、seq id no.27-28、seq id no.29-30、seq id no.31-32、seq id no.33-34、seq id no.35-36、seq id no.37-38、seq id no.39-40、seq id no.41-42、seqno.43-44、seq id no.45-46、seq id no.47-48、seq id no.49-50、seq id no.51-52所示。4.一种识别普氏原羚个体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的ssr分子标记引物组合。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基因组提取试剂和pcr反应试剂。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括毛细管电泳中的试剂。7.权利要求3所述ssr分子标记引物组合或权利要求4-6任一项所述的试剂盒在普氏原羚个体识别分析中的应用。8.权利要求3所述ssr分子标记引物组合或权利要求4-6任一项所述的试剂盒在普氏原羚群体遗传多样性检测中的应用。9.一种普氏原羚个体识别的方法，其特征在于，包括：提取普氏原羚样本的dna，以权利要求3所述的引物分别对所述基因组dna进行pcr扩增，并进行毛细管电泳，确定权利要求1所述ssr分子标记位点的基因型，进行个体识别；当所述ssr分子标记位点的基因型都相同或仅有一个位点上的一个基因型不同，则判定为同一个体。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述样本包括粪便或组织。

技术总结
本发明提供了普氏原羚SSR分子标记组合、引物组合、试剂盒和应用，涉及分子生物学技术领域。本发明基于普氏原羚全基因组测序数据，进行SSR引物设计和SSR位点的筛选，得到的26对SSR引物能够稳定扩增出目标产物，且具有高度多态性，可用于普氏原羚群体遗传多样性检测、群体遗传结构分析、进化与亲缘关系研究。筛选得到的普氏原羚多态性SSR分子标记组合，可对普氏原羚进行个体识别，准确率高。实验结果表明，本发明普氏原羚SSR分子标记组合可满足个体识别需求，对33份普氏原羚亚成体粪便样品个体识别，其来自24个不同个体，这与江西沟普氏原羚救护中心普氏原羚亚成体个数一致。原羚救护中心普氏原羚亚成体个数一致。原羚救护中心普氏原羚亚成体个数一致。


技术研发人员：蔡振媛 常宁 张同作 宋鹏飞 张婧捷 刘道鑫
受保护的技术使用者：中国科学院西北高原生物研究所
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/9