僵尸化巨噬细胞在炎性疾病靶向药物递送载体中的应用

1.本发明属于药物技术领域，更具体地，本发明涉及一种僵尸化巨噬细胞在炎性疾病靶向药物递送载体中的应用、一种炎性疾病靶向药物递送载体、以及一种治疗炎性疾病的药物及其制备方法。


背景技术：

2.近年来，细胞介导的药物递送系统在疾病治疗中增强疗效的特异性和功效已经受到相当大的关注。巨噬细胞作为天然免疫细胞具有较长的血液半衰期，并可被特异性招募到疾病的炎症部位。此外，巨噬细胞可以吞噬自然界中的外来颗粒，可以直接吞噬药物，继而将药物输送到疾病部位。因此，研究人员寻求利用活的巨噬细胞作为药物的仿生递送载体，有研究者利用活的巨噬细胞将化疗药物靶向递送到肿瘤中使药物在肿瘤中的蓄积显著增加。活的巨噬细胞作为药物递送载体，与血液中的其他细胞如红细胞、中性粒细胞相比，具有一样长的血液循环周期，同时也能通过巨噬细胞的α4和β1整合素与炎症病变部位的血管细胞粘附分子-1(vcam-1)结合。
3.尽管巨噬细胞介导的仿生给药系统已被广泛应用，但活的巨噬细胞介导的药物靶向递送方法在治疗炎症性疾病方面收效甚微。主要原因是巨噬细胞可以被炎症部位的细胞因子(如ifn-γ和tnf-α)或细菌脂多糖(lps)识别并诱导为促炎m1型巨噬细胞，这反过来又导致了炎症性疾病中活的巨噬细胞作为药物载体的缺陷。它们还存在着易被肿瘤微环境驯化为促进肿瘤的m2型巨噬细胞发挥促进肿瘤病理进程的作用。目前已有将巨噬细胞作为临床药物的靶向递送载体策略被试验，并且在小鼠实验上也取得了一定的治疗效果。但是这些策略依旧存在一定的局限性，没有从根本上解决细胞被驯化的问题。
4.因此，寻找新的、具有炎症病灶归巢以及驻留的、可以避免巨噬细胞被疾病微环境驯化的巨噬细胞仿生递送载体策略将会为炎症性疾病的治疗提供新的靶向递送方式和希望。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的在于提供一种僵尸化巨噬细胞在炎性疾病靶向药物递送载体中的应用、一种炎性疾病靶向药物递送载体、以及一种治疗炎性疾病的药物及其制备方法。
6.实现上述发明目的的技术方案包括如下。
7.本发明的第一方面，提供了僵尸化巨噬细胞在炎性疾病靶向药物递送载体中的应用，所述应用包括以下步骤：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。
8.本发明的第二方面，提供了一种炎性疾病靶向药物递送载体，其是通过以下方法制备而得：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存
液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。
9.本发明的第三方面，提供了一种治疗炎性疾病的药物，所述药物是通过以下方法制备而得：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。
10.本发明的第四方面，提供了一种治疗炎性疾病的药物的制备方法，包括以下步骤：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。
11.本发明的发明人发现，载药巨噬细胞被僵尸化后，能够避免被炎症因子驯化为m1型巨噬细胞，且依旧保留了大部分活细胞所表达的蛋白，仍然具有炎症部位的归巢以及驻留能力，因此，僵尸化巨噬细胞是潜在的作为治疗炎症性疾病药物的靶向递送载体，对于巨噬细胞作为药物载体的递送策略将会提供更加广阔的应用前景，将会更加有利于巨噬细胞作为药物仿生递送载体的发展。
附图说明
12.图1为本发明实施例1中僵尸化载药巨噬细胞的制备流程图。
13.图2为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞的粒径正态分布图。
14.图3为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞的流式实验结果(fsc和ssc)。
15.图4为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞的共聚焦实验结果(f-actin染色)。
16.图5为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞的共聚焦实验结果(ca/pi染色)。
17.图6为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞的流式实验结果(pi染色)。
18.图7为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞的扫描电镜结果。
19.图8为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞的流式细胞检测inos指标结果。
20.图9为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞的流式检测inos指标的统计结果。
21.图10为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞中炎症因子tnf-α的含量。
22.图11为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞中炎症因子il-6的含量。
23.图12为本发明实施例2中僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞的细胞体积和形态图。
24.图13为本发明实施例3中共聚焦检测僵尸化巨噬细胞保留参与驻留在炎症位置的icam-1蛋白的结果。
25.图14为本发明实施例3中流式细胞术检测僵尸化巨噬细胞保留参与驻留在炎症位置的icam-1(cd54)蛋白的结果。
26.图15为本发明实施例3中对僵尸化巨噬细胞中存在的icam-1(cd54)蛋白进行量化
统计结果。
27.图16为本发明实施例3中共聚焦检测僵尸化巨噬细胞保留其趋化到炎症位置的ccr-2蛋白的结果。
28.图17为本发明实施例3中流式细胞术检测僵尸化巨噬细胞保留其趋化到炎症位置的ccr-2(cd192)蛋白的结果。
29.图18为本发明实施例3中对僵尸化巨噬细胞中存在的ccr-2(cd192)蛋白进行量化统计结果。
30.图19为本发明实施例4中僵尸化巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块位置的驻留效果。
31.图20为本发明实施例4中僵尸化巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块位置的不同时间点的荧光信号统计结果。
32.图21为本发明实施例4中小鼠主动脉血管的离体成像。
33.图22为本发明实施例4中血管离体成像的荧光密度统计图。
34.图23为本发明实施例4中流式细胞术分析趋化并驻留在血管处的外源巨噬细胞并进行量化分析结果。
35.图24为本发明实施例4中统计趋化并驻留在血管处的外源巨噬细胞的比例结果。
具体实施方式
36.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
37.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
38.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如green和sambrook等人，分子克隆实验指南(molecularcloning:alaboratorymanual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
39.在本发明中，首先利用巨噬细胞强大的吞噬功能，将治疗炎症性疾病的药物(游离药物或纳米药物)与巨噬细胞共孵育(确保治疗性药物能够很好地封装在巨噬细胞中)，液氮处理载药细胞，从而获得僵尸化载药巨噬细胞；然后通过一系列实验验证巨噬细胞被僵尸化后，能够避免被炎症因子驯化为m1型巨噬细胞进而隔绝载体细胞炎症因子的释放，僵尸化巨噬细胞保留了促进其向炎症部位归巢以及驻留的关键蛋白，利用动脉粥样硬化小鼠模型进一步通过体内实验验证了僵尸化巨噬细胞的炎症病灶归巢和驻留作用。因此，僵尸化巨噬细胞不仅保留了炎症病灶位置的靶向性，同时能够避免炎症病灶位置累积的炎症因子的驯化进而隔绝炎症，是潜在的作为治疗炎症性疾病药物的靶向递送载体。
40.在本发明的其中一些实施例中，公开了僵尸化巨噬细胞在炎性疾病靶向药物递送载体中的应用，所述应用包括以下步骤：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42
℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。
41.在其中一些实施例中，所述炎性疾病为动脉粥样硬化或炎症性肠病。
42.在其中一些实施例中，所述抗炎药物为阿托伐他汀、辛伐他汀或卡托普利。
43.在其中一些实施例中，所述液氮温度为-196
±
1℃；和/或所述冻存时间为12h～14h。
44.在其中一些实施例中，所述解冻温度为37℃～38℃。
45.在其中一些实施例中，所述ros响应型纳米颗粒可为胶束。
46.在其中一些实施例中，所述巨噬细胞为raw264.7或小鼠骨髓原代巨噬细胞bmdms。
47.在本发明的另一些实施例中，公开了一种炎性疾病靶向药物递送载体，其是通过以下方法制备而得：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。
48.在本发明的另一些实施例中，公开了一种治疗炎性疾病的药物，所述药物是通过以下方法制备而得：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。
49.在本发明的另一些实施例中，公开了一种治疗炎性疾病的药物的制备方法，包括以下步骤：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。
50.以下实施例中，所使用的抗炎药物阿托伐他汀购自selleck(cas:134523-00-5；purity,99％)；ros响应型的纳米颗粒参考文献(nir-lighttriggered dual-cascadetargetingcore-shellnanoparticlesenhancedphotodynamictherapy andimmunotherapy)制作而得。细胞冻存液购自cyagen(ncrc-10001-50)。巨噬细胞raw264.7来自于国家纳米科学中心细胞库。
51.以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
52.实施例1僵尸化载药巨噬细胞的制备
53.请参考图1，为本发明僵尸化载药巨噬细胞的制备流程图，包括以下步骤：
54.1、采用现有方法，将抗炎药物阿托伐他汀封装至ros响应型的纳米颗粒中；
55.2、再于37℃5％二氧化碳的细胞培养箱中，与巨噬细胞raw264.7共孵育12h，收集载药的巨噬细胞；
56.3、将载药的巨噬细胞置于商品化的细胞冻存液(1e7个细胞置于1ml细胞冻存液中)中，-196℃的液氮中常压冻存12h；
57.4、再置于37℃水浴锅中解冻2min，待细胞冻存液完全溶解，即获得僵尸化载药巨噬细胞。
58.实施例2僵尸化载药巨噬细胞可以避免被炎症因子驯化
59.本实施例利用流式细胞术实验，共聚焦实验以及elisa实验验证了僵尸化载药巨噬细胞可以避免被炎症因子驯化。具体步骤如下：
60.1、将活的巨噬细胞和实施例1制备的僵尸化巨噬细胞在细胞计数仪(jimbio)中确
定2组细胞的粒径。再用流式细胞术检测僵尸化巨噬细胞和活的巨噬细胞的fsc和ssc。结果分别如图2和图3所示，图2和图3结果显示，僵尸化巨噬细胞的体积略微小于活的巨噬细胞。
61.2、为了验证僵尸化巨噬细胞的死亡情况，对僵尸化巨噬细胞进行了ca/pi染色，室温避光孵育15min后，共聚焦检测。通过流式实验检测2组细胞的死亡情况。结果如图5和图6所示，如图5和图6结果显示，僵尸化巨噬细胞均能够被pi染色具有很强的pi荧光信号表达，而几乎不具有ca的荧光表达，表明僵尸化巨噬细胞不具有细胞活力几乎全部死亡，同流式结果一致。
62.3、为了验证僵尸化巨噬细胞的细胞结构完整性，对其进行f-actin染色以及扫描电镜分析。对于f-actin染色，首先用4％多聚甲醛室温固定僵尸化巨噬细胞20min，pbs洗3次后，1％bsa/pbs封闭1h，加入f-actin抗体后放在37℃培养箱避光孵育1h，共聚焦拍照。扫描电镜(塞维尔公司)拍照。结果如图4和图7所示，图4和图7结果表明僵尸化巨噬细胞与活细胞一样依旧具有完整的细胞结构。
63.4、接下来，利用lps(10ng/ml)和ifn-γ(20ng/ml)处理活的巨噬细胞和僵尸化巨噬细胞，24h后，收取细胞分别进行流式检测inos的表达情况以及共聚焦观察细胞形态和体积的变化，收取培养细胞的上清液进行elisa检测炎症因子tnf-α和il-6。图8和图9结果表明，僵尸化巨噬细胞避免被炎症因子驯化为m1型巨噬细胞；图10和图11结果表明，僵尸化巨噬细胞避免被炎症因子驯化为m1型巨噬细胞进而隔绝炎症因子(tnf-α和il-6)的释放；图12结果表明，僵尸化巨噬细胞避免被炎症因子驯化m1型巨噬细胞，因此在细胞体积和形态上没有显著的改变。
64.该实施例结果表明，本发明的僵尸化载药巨噬细胞可以避免被炎症因子驯化为m1型巨噬细胞进而隔绝载体细胞炎症因子的释放。
65.实施例3僵尸化载药细胞可以保留炎症病灶处趋化和驻留的关键蛋白
66.本实施例利用共聚焦实验和流式细胞术实验对僵尸化载药细胞保留炎症病灶处趋化和驻留的关键蛋白的效果进行了验证，具体步骤如下：
67.首先将实施例1获得的僵尸化载药巨噬细胞和活的载药巨噬细胞分成2份，一份用于共聚焦检测，一份用于流式细胞术检测。首先用4％多聚甲醛室温固定2组细胞20min，pbs洗3次后，1％bsa/pbs封闭1h，分别加入icam-1和ccr-2抗体后放在4℃冰箱过夜孵育，第二天室温复温20min后，pbs洗3次，加入带有荧光素的对应二抗37℃孵育1h后，pbs洗3次，加入dapi室温孵育3min，pbs洗3次，共聚焦拍照。将cd54和cd192抗体分别加入2组细胞后，4℃冰箱避光孵育30min后，pbs洗3次，待上机流式细胞术检测。
68.icam-1蛋白的结果如图13～图15所示，结果显示，僵尸化巨噬细胞能够保留参与驻留在炎症位置的icam-1蛋白(图13)；流式细胞术实验进一步证明在僵尸化巨噬细胞中icam-1蛋白的存在(图14)；对僵尸化巨噬细胞中存在的icam-1蛋白进行量化统计，结果表明僵尸化巨噬细胞中存在的icam-1蛋白含量虽然少于活的巨噬细胞，但是依旧存在此蛋白(图15)。
69.ccr-2蛋白的结果如图16～图18所示，结果显示，僵尸化巨噬细胞能够保留参与其趋化到炎症位置的ccr-2蛋白(图16)；流式细胞术实验进一步证明在僵尸化巨噬细胞中ccr-2蛋白的存在(图17)；对僵尸化巨噬细胞中存在的ccr-2蛋白进行量化统计，结果表明僵尸化巨噬细胞中存在的ccr-2蛋白含量略低于活的巨噬细胞，但是不具有统计学差异(图
18)。
70.实施例4僵尸化载药细胞具有动脉粥样硬化斑块趋化和驻留的能力
71.本实施例利用小动物荧光活体成像以及流式细胞术验证了僵尸化载药细胞具有动脉粥样硬化斑块趋化和驻留的能力。具体步骤如下：
72.购买4周龄的apoe-/-小鼠，放在spf级动物房中饲养，同时给予高脂饲料喂养，待喂养到小鼠的周龄为12w时，将染过did染料的活的载药巨噬细胞和僵尸化载药巨噬细胞通过尾静脉回输到动脉粥样硬化小鼠中，每只小鼠注射的细胞数为1*e7个细胞，分别在回输细胞前以及在回输细胞24h，48h，72h，96h采集图像，待96h的图像采集完成后，解剖小鼠，收集小鼠的主动脉血管进行离体成像，待成像后，将整根血管用胶原酶消化成单细胞悬液，流式分析浸润到血管斑块处的外源的巨噬细胞的数量。
73.图19～图20结果表明，僵尸化载药巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块位置的驻留效果与活的载药巨噬细胞一样，直到96h仍然具有较强的荧光信号；小鼠主动脉血管的离体成像以及血管离体成像的荧光密度统计如图21和图22所示，结果表明僵尸化巨噬细胞同活的巨噬细胞在血管斑块处具有相似的驻留效果且在静脉回输96h后依旧具有较强的驻留效果；流式细胞术分析趋化并驻留在血管处的外源巨噬细胞并进行量化分析结果如图23和图24所示，结果表明僵尸化巨噬细胞同活的巨噬细胞一样在炎性斑块处具有较好的驻留效果，且两者之间的驻留能力没有显著性差异。
74.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
75.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.僵尸化巨噬细胞在炎性疾病靶向药物递送载体中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎性疾病为动脉粥样硬化或炎症性肠病。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物为阿托伐他汀、辛伐他汀或卡托普利。4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述液氮温度为-196
±
1℃；和/或所述冻存时间为12h～14h。5.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述解冻温度为37℃～38℃。6.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述巨噬细胞为raw264.7或小鼠骨髓原代巨噬细胞bmdms。7.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述纳米颗粒为ros响应型纳米颗粒。8.一种炎性疾病靶向药物递送载体，其特征在于，其是通过以下方法制备而得：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。9.一种治疗炎性疾病的药物，其特征在于，所述药物是通过以下方法制备而得：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。10.权利要求9所述的治疗炎性疾病的药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196
±
4℃的液氮中常压冻存10h～15h；再于37℃～42℃恒温解冻至细胞冻存液完全溶解。

技术总结
本发明公开了僵尸化巨噬细胞在炎性疾病靶向药物递送载体中的应用，所述应用包括以下步骤：将抗炎药物或封装有抗炎药物的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育；再置于细胞冻存液中，-196


技术研发人员：权利要求书1页说明书6页附图10页
受保护的技术使用者：广州医科大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/9