一种快速鉴别山茶品种的SSR标记引物、方法及应用与流程

一种快速鉴别山茶品种的ssr标记引物、方法及应用
技术领域
1.本发明涉及山茶品种鉴别技术，建立了一种快速鉴别山茶品种的ssr标记引物、方法及应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.山茶(camellia japonica)为山茶科theaceae山茶属camellia植物，系中国十大名花，世界名贵花卉，具有重要观赏价值，在盆栽及园林绿化上广泛应用。山茶在两千多年的栽培、应用历史过程中形成了大量色彩丰富、姿态各异的栽培品种，据统计，目前在国际山茶协会登录的山茶品种已达3万以上。尽管我国具有山茶花的资源优势，但我们对其保护及开发利用的研究还远远不够。丰富的山茶花种质资源为保存带来极大困难及较高成本，造成资源大量流失，同时也限制了对资源的系统深入研究和高效利用。
3.山茶种内个体间形态上的差异和变异在自然界中普遍存在，由于自然杂交和人工选育的影响更增添了变异的多样性和复杂性，增加了形态学分类的困难。同时随着山茶种质资源的广泛征集和不断累积交换，出现大量同名异物和同物异名的现象，给生产、研究均带来了极大的不便和混乱，因此利用最新的分子标记技术对山茶花种质资源进行研究是十分必要。建立快速、高效、准确的山茶品种鉴别技术，有望为品种交流、研究及推广应用提供技术支撑和科学依据。
4.山茶品种的鉴别，专业技术人员通常根据经验从外观形态上加以判定，往往会造成主观性带来的误判；通过观测数据定性或者定量综合判定，通常需要一个生长季或某个特定生长发育时期(花、果实、种子)的数据观测收集，山茶种子苗从播种到开花往往需要5年以上，因此缺乏时效性和准确性，此外，表型性状易受栽培管理和环境条件的影响。因此，对形态性状相近的山茶品种难以进行有效鉴定与选择。利用dna分子标记进行鉴定，具有即时、高效、直观、准确的特点，不仅能更快速、准确地对相似种质进行鉴别，还可揭示种质中发生和存在的基因变异，为重要性状基因的定位提供指导，为山茶资源的可持续利用提供科学依据。
5.ssr标记也称微卫星dna(microsatellite dna)，与其它分子标记相比，ssr标记以孟德尔方式遗传，呈共显性；数量丰富，多态性高；多等位基因，信息量大；同时还具有重复性好、可靠性强等特点，广泛应用于种质资源鉴别、遗传多样性与遗传结构分析及遗传图谱构建等方面。目前，ssr分子鉴别技术主要应用于农作物及各种经济作物中，利用ssr分子标记技术鉴别山茶品种的相关报道较少，且能鉴别的山茶品种也有限。
6.本发明自主开发了3对ssr标记引物，通过高通量测序、ssr基因分型技术对10个山茶品种进行了快速鉴别，为山茶品种识别及进一步开发利用提供技术支撑。


技术实现要素：

7.本发明提供3对自主开发设计的ssr标记引物，通过ssrseq
tm
技术将高通量测序与ssr基因分型技术结合，实现对山茶品种快速、准确及高效的鉴别，为山茶品种高效识别提
供技术支持与科学依据。
8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
9.山茶品种ssr标记引物为自主开发，所述引物具体如下：
10.引物编号：ssr525，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，重复单元：(caa)6；
11.引物编号：ssr530，上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，重复单元：(aca)6；
12.引物编号：ssr627，上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，重复单元：(cgg)7。
13.ssr标记引物在鉴别山茶品种上的应用，通过ssrseq
tm
技术对山茶品种进行快速鉴别。鉴别山茶品种的方法，具体如下：
14.dna提取：使用dna提取试剂盒提取山茶品种新鲜叶片中的dna。
15.dna质量评估：用琼脂糖凝胶电泳检查核酸的完整性，条带应清晰，无核酸降解和核酸污染。用nanodrop2000评估dna纯度，dna浓度≥20ng/μl，含量≥(200+n*30)ng(n为panel数目)。
16.pcr扩增：用ssr525、ssr530和ssr627引物位点对10个山茶品种进行单一或多重pcr反应扩增。
17.高通量测序：将所有pcr产物汇集，并制备文库，在illuminahiseq2500(pe150bp)平台上测序。对原始读数经过一系列分析，包括使用fastqc的质量控制、用flash对reads进行合并，使用blastn构建参考比对。
18.ssr基因分型：通过比对reads和序列数据计算ssr等位基因的数量。两步校正后列出了ssr基序和重复数，包括滑移调整和扩增效率调整。
19.山茶品种鉴别：根据同一引物不同山茶品种的ssr基因分型不同，即可有效鉴别不同品种。
20.本发明获得的有益效果：
21.山茶品种ssr分子标记鉴别所用ssr引物为本实验室自主开发设计，引物信息见表1。
22.表1山茶品种ssr引物
[0023][0024]
根据同一引物不同山茶品种的ssr基因分型不同，即可有效鉴别不同品种。利用本实验室自主开发的74对引物对307个山茶品种进行基因分型鉴定，筛选出3对ssr引物可分别对10个山茶品种实现一一区分。
[0025]
本发明利用3对自主开发ssr引物对山茶品种的dna进行高通量测序、ssr基因分型，能有效鉴别10个山茶品种。1、本发明得到的ssr标记分型图谱特异性强、多态性高。2、本
发明自主开发的3对ssr引物均可以一次性将10个山茶品种全部一一区分，鉴别效率高；3对ssr引物可单独用于鉴定，亦可同时进行多重pcr反应，少量扩增循环数即可获得高多态性分型图谱，大大缩短了反应时间，可实现山茶品种的快速鉴定。3、本方法所得数据基于生物信息学分析，不需人工判读基因型，流程高效，分型准确，减少了人工误差，与传统经验鉴别方法相比准确性高、可重复性强。4、本方法与观测数据定性或者定量综合判定方法相比，能够节约时间和成本。因此，利用本方法对山茶品种的鉴别具有广阔的应用前景。
附图说明
[0026]
图1：10个山茶品种引物ssr525基因分型图。
[0027]
图2：10个山茶品种引物ssr530基因分型图。
[0028]
图3：10个山茶品种引物ssr627基因分型图。
具体实施方式
[0029]
实施例1
[0030]
利用自主开发ssr引物对10个山茶品种进行高通量测序、ssr基因分型，根据ssr基因分型结果可以一次鉴别10个山茶品种。一种快速鉴别山茶品种的ssr引物及其应用的方法，具体按照以下步骤进行的：
[0031]
取样：采集山茶品种新鲜叶片。10个山茶品种编号分别为：af10：吉祥红、af11：连城红、af19：金盘荔枝、af24：黄绣球、fd14：粉霞、fd15：七巧、fd40：鸡心银红、fd56：海泡、pf37：里道费、pf39：哈里斯顿。
[0032]
dna提取：使用dna提取试剂盒提取山茶品种新鲜叶片中的dna。
[0033]
dna质量评估：用琼脂糖凝胶电泳检查核酸的完整性，条带应清晰，无核酸降解和核酸污染。用nanodrop2000评估dna纯度，dna浓度≥20ng/μl，含量≥(200+n*30)ng(n为panel数目)。
[0034]
pcr扩增：用ssr525、ssr530和ssr627引物位点对10个山茶品种进行多重pcr反应扩增。反应体系(25μl)：含100ng的模板dna 1.5μl，2
×
tsingke master mix 12.5μl，10mmol/l引物2μl，超纯水9μl。pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，11个循环；72℃延伸9min；4℃保存。
[0035]
高通量测序：将所有pcr产物汇集，并制备文库，在illuminahiseq2500(pe150bp)平台上测序。对原始读数经过一系列分析，包括使用fastqc的质量控制、用flash对reads进行合并，使用blastn构建参考比对。
[0036]
ssr基因分型：通过比对reads和序列数据计算ssr等位基因的数量。两步校正后列出了ssr基序和重复数，包括滑移调整和扩增效率调整。
[0037]
山茶品种鉴别：根据同一引物不同山茶品种的ssr基因分型不同，即可有效鉴别不同品种，结果如表2所示。
[0038]
表2 10个山茶品种ssr基因分型结果
[0039]
引物编号af10af11af19af24fd14fd15fd40fd56pf37pf39ssr5256/64/62/86/72/65/54/44/75/63/8ssr 5307/126/77/97/810/126/87/78/116/115/6
ssr 6275/63/63/76/75/54/73/44/56/63/5
[0040]
实施例2
[0041]
取样：采集山茶品种新鲜叶片。10个山茶品种编号分别为：af10：吉祥红、af11：连城红、af19：金盘荔枝、af24：黄绣球、fd14：粉霞、fd15：七巧、fd40：鸡心银红、fd56：海泡、pf37：里道费、pf39：哈里斯顿。
[0042]
dna提取：使用dna提取试剂盒提取山茶品种新鲜叶片中的dna。
[0043]
dna质量评估：用琼脂糖凝胶电泳检查核酸的完整性，条带应清晰，无核酸降解和核酸污染。用nanodrop2000评估dna纯度，dna浓度≥20ng/μl，含量≥(200+n*30)ng(n为panel数目)。
[0044]
pcr扩增：用ssr525引物位点对10个山茶品种进行pcr反应扩增。反应体系(25μl)：含100ng的模板dna 1.5μl，2
×
tsingke master mix 12.5μl，10mmol/l引物2μl，超纯水9μl。pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，11个循环；72℃延伸9min；4℃保存。
[0045]
高通量测序：将所有pcr产物汇集，并制备文库，在illuminahiseq2500(pe150bp)平台上测序。对原始读数经过一系列分析，包括使用fastqc的质量控制、用flash对reads进行合并，使用blastn构建参考比对。
[0046]
ssr基因分型：通过比对reads和序列数据计算ssr等位基因的数量。两步校正后列出了ssr基序和重复数，包括滑移调整和扩增效率调整。
[0047]
山茶品种鉴别：根据引物ssr525对不同山茶品种的ssr基因分型不同，即可有效鉴别不同品种，结果如图1、表3所示，10个品种af10、af11、af19、af24、fd14、fd15、fd40、fd56、pf37、pf39基因分型分别为：6/6、4/6、2/8、6/7、2/6、5/5、4/4、4/7、5/6、3/8。10个山茶品种的引物ssr525基因分型结果均不相同，一次即可鉴别出10个山茶品种，鉴别效率较高。
[0048]
表3 10个山茶品种引物ssr525基因分型结果
[0049]
引物编号af10af11af19af24fd14fd15fd40fd56pf37pf39ssr5256/64/62/86/72/65/54/44/75/63/8
[0050]
实施例3
[0051]
取样：采集山茶品种新鲜叶片。10个山茶品种编号分别为：af10：吉祥红、af11：连城红、af19：金盘荔枝、af24：黄绣球、fd14：粉霞、fd15：七巧、fd40：鸡心银红、fd56：海泡、pf37：里道费、pf39：哈里斯顿。
[0052]
dna提取：使用dna提取试剂盒提取山茶品种新鲜叶片中的dna。
[0053]
dna质量评估：用琼脂糖凝胶电泳检查核酸的完整性，条带应清晰，无核酸降解和核酸污染。用nanodrop2000评估dna纯度，dna浓度≥20ng/μl，含量≥(200+n*30)ng(n为panel数目)。
[0054]
pcr扩增：用ssr530引物位点对10个山茶品种进行pcr反应扩增。反应体系(25μl)：含100ng的模板dna 1.5μl，2
×
tsingke master mix 12.5μl，10mmol/l引物2μl，超纯水9μl。pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，11个循环；72℃延伸9min；4℃保存。
[0055]
高通量测序：将所有pcr产物汇集，并制备文库，在illuminahiseq2500(pe150bp)平台上测序。对原始读数经过一系列分析，包括使用fastqc的质量控制、用flash对reads进
行合并，使用blastn构建参考比对。
[0056]
ssr基因分型：通过比对reads和序列数据计算ssr等位基因的数量。两步校正后列出了ssr基序和重复数，包括滑移调整和扩增效率调整。
[0057]
山茶品种鉴别：根据引物ssr530对不同山茶品种的ssr基因分型不同，即可有效鉴别不同品种，结果如图2、表4所示，10个品种af10、af11、af19、af24、fd14、fd15、fd40、fd56、pf37、pf39基因分型分别为：7/12、6/7、7/9、7/8、10/12、6/8、7/7、8/11、6/11、5/6。10个山茶品种的引物ssr530基因分型结果均不相同，一次即可鉴别出10个山茶品种，鉴别效率较高。
[0058]
表4 10个山茶品种引物ssr530基因分型结果
[0059]
引物编号af10af11af19af24fd14fd15fd40fd56pf37pf39ssr 5307/126/77/97/810/126/87/78/116/115/6
[0060]
实施例4
[0061]
取样：采集山茶品种新鲜叶片。10个山茶品种编号分别为：af10：吉祥红、af11：连城红、af19：金盘荔枝、af24：黄绣球、fd14：粉霞、fd15：七巧、fd40：鸡心银红、fd56：海泡、pf37：里道费、pf39：哈里斯顿。
[0062]
dna提取：使用dna提取试剂盒提取山茶品种新鲜叶片中的dna。
[0063]
dna质量评估：用琼脂糖凝胶电泳检查核酸的完整性，条带应清晰，无核酸降解和核酸污染。用nanodrop2000评估dna纯度，dna浓度≥20ng/μl，含量≥(200+n*30)ng(n为panel数目)。
[0064]
pcr扩增：用ssr627引物位点对10个山茶品种进行pcr反应扩增。反应体系(25μl)：含100ng的模板dna 1.5μl，2
×
tsingke master mix 12.5μl，10mmol/l引物2μl，超纯水9μl。pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，11个循环；72℃延伸9min；4℃保存。
[0065]
高通量测序：将所有pcr产物汇集，并制备文库，在illuminahiseq2500(pe150bp)平台上测序。对原始读数经过一系列分析，包括使用fastqc的质量控制、用flash对reads进行合并，使用blastn构建参考比对。
[0066]
ssr基因分型：通过比对reads和序列数据计算ssr等位基因的数量。两步校正后列出了ssr基序和重复数，包括滑移调整和扩增效率调整。
[0067]
山茶品种鉴别：根据引物ssr627对不同山茶品种的ssr基因分型不同，即可有效鉴别不同品种，结果如图3、表5所示，10个品种af10、af11、af19、af24、fd14、fd15、fd40、fd56、pf37、pf39基因分型分别为：5/6、3/6、3/7、6/7、5/5、4/7、3/4、4/5、6/6、3/5。10个山茶品种引物ssr627基因分型结果均不相同，一次即可鉴别出10个山茶品种，鉴别效率较高。
[0068]
表5 10个山茶品种引物ssr627基因分型结果
[0069]
引物编号af10af11af19af24fd14fd15fd40fd56pf37pf39ssr 6275/63/63/76/75/54/73/44/56/63/5

技术特征：
1.山茶品种ssr标记引物，其特征在于：3对引物均为自主开发引物，所述引物具体如下：引物编号：ssr525，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，重复单元：(caa)6；引物编号：ssr530，上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，重复单元：(aca)6；引物编号：ssr627，上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，重复单元：(cgg)7。2.一种鉴定山茶品种的方法，其特征在于：使用ssrseq
tm
技术对山茶品种进行快速鉴别，鉴别方法具体如下：dna提取：使用dna提取试剂盒提取山茶品种新鲜叶片中的dna；dna质量评估：用琼脂糖凝胶电泳检查核酸的完整性，条带应清晰，无核酸降解和核酸污染，使用分光光度计评估脱氧核糖核酸纯度，dna浓度≥20ng/μl，含量≥(200+n
ⅹ
30)ng(n为检测数)；pcr扩增：用ssr525、ssr530和ssr627引物位点对10个山茶品种进行单一或多重pcr反应扩增；高通量测序：将所有pcr产物汇集，并制备文库，在illuminahiseq2500(pe150bp)平台上测序，对原始读数经过一系列分析，包括使用fastqc的质量控制、用flash对reads进行合并，使用blastn构建参考比对；ssr基因分型：通过比对reads和序列数据计算ssr等位基因的数量，两步校正后列出了ssr基序和重复数，包括滑移调整和扩增效率调整；山茶品种鉴别：根据同一引物不同山茶品种的ssr基因分型不同，即可有效鉴别不同品种。3.根据权利要求1所述的山茶ssr标记引物在快速鉴别山茶品种中的应用。

技术总结
本发明涉及一种快速鉴别山茶品种的方法，本发明提供了自主开发的3对SSR标记引物SSR525、SSR530、SSR627，并将它们应用于山茶品种鉴别。具体根据同一引物不同山茶品种的SSR基因分型不同，鉴别不同品种。本发明得到的3对SSR引物均可以一次性将10个山茶品种全部一一区分，鉴别效率高。与传统经验鉴别方法相比准确性高、可重复性强。与观测数据定性或者定量综合判定方法相比，能够节约时间和成本。因此，利用本方法对山茶品种的鉴别具有广阔的应用前景为山茶品种有效识别及进一步开发利用提供技术支撑与科学依据。供技术支撑与科学依据。供技术支撑与科学依据。


技术研发人员：李辛雷 张莹 范梦龙 宋志欣 殷恒福 范正琪 刘伟鑫 李纪元
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院亚热带林业研究所
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/8/13