VS6766联合LXH254的应用及药物组合物

vs6766联合lxh254的应用及药物组合物
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及vs6766联合lxh254用于制备治疗kras突变型结直肠癌的药物中的应用及药物组合物。


背景技术：

2.结直肠癌是全球第三大常见的癌症，30-50%的结直肠癌与kras突变异常有关，预后极差，但kras突变一直是肿瘤靶向药研发的难点。结直肠癌患者中的kras突变以g12d（37%）、g12v（30%）、g13d（15%）最常见，其他突变如g12c等均少于10%，目前仅有kras g12c抑制剂获批用于治疗非小细胞肺癌。因此研究针对kras突变型结直肠癌的靶向治疗策略依然是紧迫的难点问题。
3.目前抑制kras基因的下游mapk（raf-mek-erk）通路信号传导是间接阻断kras的重要策略。现有的mapk通路抑制剂多为单靶点，如raf或mek抑制剂等，在结直肠癌患者中临床获益有限，长期服用总是不可避免地出现耐药，其中大多数耐药机制导致erk信号重新激活，这突出了kras突变肿瘤细胞对erk信号传导的强烈依赖性，因此，如何实现持久有效地抑制erk信号对于kras突变型结直肠癌的治疗至关重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一在于提供vs6766联合lxh254用于制备治疗kras突变型结直肠癌的药物中的应用。
5.本发明的目的之二在于提供一种药物组合物。
6.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种vs6766联合lxh254用于制备治疗kras突变型结直肠癌的药物中的应用。
7.第二方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括vs6766和lxh254。
8.基于上述技术方案，本发明的vs6766联合lxh254用于制备治疗kras突变型结直肠癌的药物中的应用及药物组合物至少具有如下有益技术效果：本发明的应用是将raf/mek双靶点抑制剂vs6766联合raf二聚体抑制剂lxh254用于制备治疗kras突变型结直肠癌的药物使用，相比单独使用raf/mek双靶点抑制剂vs6766或raf二聚体抑制剂lxh254，本技术的方案对抑制kras突变型肠癌细胞增殖发挥了协同增效的作用，可持久有效的抑制pmek、perk活性，因此将raf/mek双靶点抑制剂vs6766联合raf二聚体抑制剂lxh254采用联合用药的方式，同时也制成药物组合物或制剂，用于治疗肠癌，特别是kras突变型肠癌，具有良好的应用前景。
附图说明
9.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
10.图1为vs6766和lxh254的结构式，其中，图1a为raf/mek双靶点抑制剂vs6766的分子结构式，图1b为raf二聚体抑制剂lxh254的分子结构式；图2是vs6766联合lxh254的cck8细胞增殖实验结果图，其中，图2a、图2b和图2c分别为hct116-kras g13d的结肠癌细胞在不同浓度的各药物组的cck8细胞增殖结果图；图2d、图2e和2f分别为sw480-kras g12v的结肠癌细胞在不同浓度的各药物组的cck8细胞增殖结果图；图3为vs6766联合lxh254的cck8细胞增殖实验结果的协同指数图，其中，图3a为hct116-kras g13d的结肠癌细胞的cck8细胞增殖实验中vs6766联合lxh254组三种不同药物浓度下协同指数（ci）图，图3b为sw480-kras g12v的结肠癌细胞的cck8细胞增殖实验中vs6766联合lxh254组三种不同药物浓度下协同指数（ci）图；图4为vs6766联合lxh254的克隆形成实验结果图，其中，图4a为hct116-kras g13d的结肠癌细胞在各组药物处理后的细胞克隆数量结果图，图4b为sw480-kras g12v的结肠癌细胞在各组药物处理后的细胞克隆数量结果图；图5为vs6766联合lxh254的蛋白免疫印迹实验结果图，其中，图5a为hct116-kras g13d的结肠癌细胞在各组药物处理后的蛋白免疫印迹结果图，图5b为sw480-kras g12v的结肠癌细胞在各组药物处理后的蛋白免疫印迹结果图；图6为vs6766联合lxh254、ly3009120、hm95573及plx8394的cck8细胞增殖实验结果图，其中，图6a为hct116-kras g13d的结肠癌细胞在不同浓度的各药物组的cck8细胞增殖结果图；图6b为sw480-kras g12v的结肠癌细胞在不同浓度的各药物组的cck8细胞增殖结果图；图7为vs6766联合lxh254、ly3009120、hm95573及plx8394的克隆形成实验结果图，其中，7a为hct116-kras g13d的结肠癌细胞在不同药物组处理后的细胞克隆数量结果图，图7b为sw480-kras g12v的结肠癌细胞在不同药物处理后的细胞克隆数量结果图；图8为vs6766联合lxh254、ly3009120、hm95573及plx8394的蛋白免疫印迹实验结果图，其中，图8a为hct116-kras g13d的结肠癌细胞和sw480-kras g12v的结肠癌细胞在各组药物处理后的蛋白免疫印迹结果图，图8b为sw480-kras g12v的结肠癌细胞在各组药物处理后随着药物作用时长的增加的蛋白免疫印迹结果图。
具体实施方式
11.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
12.发明人在研发过程中发现：在kras突变型结直肠癌细胞中，vs6766，其结构式如图1a所示，是一种新型的raf/mek双靶点变构抑制剂，可直接与mek结合并形成稳定的raf/mek抑制性复合物，可同时抑制pmek、perk的活性。其i期临床试验显示vs6766对多种kras突变
型的肿瘤有效且安全，其客观缓解率达27%，尤其针对kras g12v、g12d、g12r突变体现出极大的治疗潜力。并且该药半衰期长达55个小时，通过一周两次的间歇给药方案能同时保证药效和安全性，但大多数患者对vs6766的反应持续时间约6个月，药物抵抗仍是限制其临床应用的瓶颈。
13.raf蛋白激酶是mapk通路信号传导的关键中间体，包括araf、braf和craf，其功能不完全相同，可形成同源或异源二聚体，是激活下游mek-erk通路信号的重要节点。第一代braf
v600e
单体抑制剂在结肠癌患者中疗效欠佳，可能与其只能抑制braf
v600e
单体，反而导致其他单体及二聚体强烈激活有关。新一代的raf二聚体抑制剂：lxh254、ly3009120、hm95573或plx8394，临床前数据均显示出一定疗效，但总是不可能避免地发生耐药。由于不同亚型raf单体及二聚体的异质性，现有raf二聚体抑制剂不能完全抑制所有raf二聚体的活性。例如lxh254，其结构式如图1b所示，可有效抑制braf二聚体和craf二聚体的信号，但对araf二聚体效果较差，仍会导致erk信号矛盾性激活。
14.在kras突变型结直肠癌的治疗中，如何实现持久有效地抑制mapk通路信号传导仍然是重要的科学问题。基于此，本发明提供一种raf/mek双靶点抑制剂vs6766联合raf二聚体抑制剂lxh254用于制备治疗kras突变型结直肠癌的药物中的应用。
15.实施例1：
16.vs6766联合lxh254有效抑制kras突变肠癌细胞增殖和存活。
17.1.所涉及的肿瘤细胞及药物：kras突变的人结肠癌细胞：hct116（kras g13d）、sw480（kras g12v）（四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室）。
18.raf/mek双靶点抑制剂：vs6766（selleckchem，美国）。
19.raf二聚体抑制剂：lxh254（selleckchem，美国）。
20.2.实验方法：实验分组：
①
对照组：使用dmso（二甲基亚砜，biofroxx，德国）处理细胞；
②
vs6766组：单独使用vs6766处理细胞；
③
lxh254组：单独使用lxh254处理细胞；
④
vs6766联合lxh254组：使用vs6766和lxh254同时处理细胞。vs6766和lxh254使用时用dmso分别配制成溶液，联合组使用2种溶液同时处理细胞。
21.（1）cck8细胞增殖实验：制备新鲜完全培养基用于细胞培养：dmem培养基（gibco，美国）+10%胎牛血清（gibco，美国）。收集对数生长期结肠癌细胞hct116（kras g13d）和sw480（kras g12v），分别均匀接种于96孔板（5000cells/孔，每孔100ul），每个药物浓度3个重复孔。37℃培养箱中过夜，待细胞贴壁后加入不同药物处理。
22.具体分组为：
①
对照组：加入dmso；
②
vs6766组：分别加入浓度为0.5μm、1μm和2μm的vs6766；
③
lxh254组：分别加入浓度为1μm、2μm和4μm的lxh254；
④
vs6766+lxh254组：加入浓度为0.5μm的vs6766和1μm的lxh254，或加入浓度为1μ
m的vs6766和2μm的lxh254，或加入浓度为2μm的vs6766和4μm的lxh254（vs6766和lxh254的摩尔比为1:2）。
23.用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（100μl）。继续培养72h后，用无血清培养基（dmem）按照10：1比例稀释cck8试剂（target mol，美国），每孔加入100ul稀释后的cck8试剂，培养0.5-4小时后，酶标仪测定450nm吸光度，并运用chou-talalay公式计算协同指数（ci），ci《1说明两种药物具有协同增效作用。
24.（2）克隆形成实验：将对数生长期的结肠癌细胞hct116（kras g13d）和sw480（kras g12v）分别均匀接种于12孔板中（1
×
104cells/孔），细胞贴壁后再培养3-4天（待单个细胞形成4-5个细胞小集落）。
25.具体分组为：
①
对照组：加入dmso；
②
vs6766组：加入浓度为1μm的vs6766；
③
lxh254组：加入浓度为5μm的lxh254；
④
vs6766+lxh254组：加入浓度为1μm的vs6766和5μm的lxh254（vs6766和lxh254的摩尔比为1:5）；用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（1ml）。加入相应药物后继续培养5-10天（期间更换2-3次新鲜完全培养基及相应药物）。集落形成后，用0.01m的pbs溶液（biosharp）缓慢冲洗1次，避免吹掉细胞，用多聚甲醛固定20min，pbs冲洗1次，0.5%结晶紫染色20min，pbs冲洗3次，拍照采图，观察细胞克隆数量。
26.（3）蛋白免疫印迹实验：分别对处于对数生长期的细胞sw480和hct116均匀接种于6孔板中（每组5个孔，以探究药物处理时间长短对mapk通路的影响），加入不同药物进行处理。具体分组为：
①
对照组：加入dmso；
②
vs6766组：加入浓度为2μm的vs6766；
③
lxh254组：加入浓度为2μm的lxh254；
④
vs6766+lxh254组：加入浓度为2μm的vs6766和2μm的lxh254（vs6766和lxh254的摩尔比为1:1）；用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（2ml）。
27.各组如上述加入相应药物后，每组中5个孔的药物处理时长呈梯度递增，即5个孔分别培养1天（24h）、2天（48h）、3天（72h）、4天（96h）、5天（120h）时间，每2-3天更换新鲜完全培养基及相应药物以支持细胞生长并维持药物浓度。在相应时间点分别提取细胞总蛋白，进行蛋白免疫印迹实验，检测mapk通路主要蛋白pmek1/2（s218/s222，abcam）、perk（erk1（pt202/py204）+erk2（pt185/py187），abcam）及gapdh（santa cruz）的表达水平。
28.实验结果：图2和图3为vs6766联合lxh254的cck8细胞增殖实验结果。cck8是用于检测细胞增殖和细胞毒性的实验，通过od值间接反映活细胞的数量。协同指数（combined index，ci）可判断两种药物的协同性，ci=1表示相加作用，ci》1表示拮抗作用，ci《1表示协同作用，其中：0.8≤ci《0.9为低度协同作用，0.6≤ci《0.8为中度协同作用，0.4≤ci《0.6为高度协同作用，0.2≤ci《0.4为强协同作用。由图2可知：单药vs6766组和单药lxh254组均可有效抑制kras突变型肠癌细胞增殖；vs6766+lxh254组的相对细胞增殖比例均显著低于单药vs6766
组和lxh254组，并由图3可知，vs6766+lxh254组的ci值均小于1，说明vs6766联合lxh254使用对于治疗kras突变的肠癌具有协同增效作用。更进一步，两药的ci指数＜0.6（位于0.4与0.6之间），说明vs6766联合lxh254具有高度协同作用。
29.图4为vs6766联合lxh254的克隆形成实验结果图。克隆形成实验主要用于评估单个细胞存活、增殖并形成克隆的能力。由图4可知：单药vs6766组和单药lxh254组均可有效抑制kras突变型肠癌细胞增殖与存活；而vs6766+lxh254组的两种细胞克隆数均明显少于单药vs6766组和单药lxh254组。说明vs6766和lxh254联合使用可更有效抑制kras突变肠癌细胞增殖与存活。
30.图5为vs6766联合lxh254的蛋白免疫印迹实验结果图。kras通过级联磷酸化激活mapk通路的pmek、perk关键激酶来促进肿瘤细胞的增殖、分化。kras突变肿瘤细胞对erk信号传导的强烈依赖性，持久有效地抑制erk信号对于kras突变型肠癌的治疗至关重要。由图5可知，短时间vs6766单药治疗可有效抑制pmek、perk活性，但较长时间vs6766单药治疗存在pmek、perk反弹激活；与vs6766单药相比，lxh254单药治疗可持久有效抑制pmek活性，但对perk活性的抑制作用较弱；而vs6766+lxh254组可持久同时有效抑制pmek、perk活性，与cck8和克隆形成实验的结果一致。
31.因此，上述结果可以得出，联合使用vs6766和lxh254，相比vs6766或lxh254单独使用，对抑制kras突变型肠癌细胞增殖发挥了协同增效的作用，可持久有效抑制mapk通路主要激酶pmek、perk活性。
32.实施例2：
33.raf/mek双靶点抑制剂vs6766联合raf二聚体抑制剂lxh254、ly3009120、hm95573和plx8394的协同抗肿瘤作用疗效的比较。
34.1.所涉及的肿瘤细胞及药物：kras突变的人结肠癌细胞：hct116（kras g13d）和sw480（kras g12v）（四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室）。
35.raf/mek双靶点抑制剂：vs6766（selleckchem，美国）。
36.raf二聚体抑制剂：lxh254、ly3009120、hm95573和plx8394（均购自selleckchem，美国）。
37.①
lxh254：有效抑制braf、craf二聚体的激酶活性；
②
ly3009120：有效抑制braf、craf二聚体的激酶活性；
③
hm95573：有效抑制braf、craf二聚体的激酶活性；
④
plx8394：特异性分离braf二聚体，并抑制其激酶活性。
38.2.实验方法：实验分组：
①
对照组：使用dmso处理细胞；
②
vs6766组：单独使用vs6766处理细胞；
③
raf二聚体抑制剂组：单独使用raf二聚体抑制剂处理细胞；
④
vs6766联合raf二聚体抑制剂组：使用vs6766和raf二聚体抑制剂同时处理细胞。vs6766和raf二聚体抑制剂使用时用dmso分别配制成溶液，联合组使用2种溶液同时处理细胞。
39.下面对实验过程进行具体说明。
40.（1）cck8细胞增殖实验：制备新鲜完全培养基用于细胞培养：dmem培养基（gibco，美国）+10%胎牛血清（gibco，美国）。收集对数生长期结肠癌细胞hct116（kras g13d）和sw480（kras g12v），分别均匀接种于96孔板（5000cells/孔，每孔100ul），每个药物浓度3个重复孔。37℃培养箱中过夜，待细胞贴壁后加入不同药物处理。
41.具体分组为：
①
对照组：加入dmso；
②
vs6766组：分别加入浓度为0.1μm、0.5μm和1μm的vs6766；
③
raf二聚体抑制剂组：分别加入浓度为2μm的lxh254、ly3009120、hm95573或plx8394；
④
vs6766+raf二聚体抑制剂组：加入浓度为0.1μm的vs6766和2μm的lxh254、ly3009120、hm95573或plx8394，或加入浓度为0.5μm的vs6766和2μm的lxh254、ly3009120、hm95573或plx8394，或加入浓度为1μm的vs6766和2μm的lxh254、ly3009120、hm95573或plx8394；用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（100μl）。继续培养72h后，用无血清培养基（dmem）按照10:1比例稀释cck8试剂（target mol，美国），每孔加入100ul稀释后的cck8试剂，培养0.5-4小时后，酶标仪测定450nm吸光度。
42.（2）克隆形成实验：将对数生长期的结肠癌细胞hct116（kras g13d）和sw480（kras g12v）均匀接种于12孔板中（1
×
104cells/孔），细胞贴壁后再培养3-4天（待单个细胞形成4-5个细胞小集落）。
43.具体分组为：
①
对照组：加入dmso；
②
vs6766组：加入浓度为1μm的vs6766；
③
raf二聚体抑制剂组：加入浓度为5μm的lxh254、hm95573或plx8394；加入浓度为1μm的ly3009120；
④
vs6766+raf二聚体抑制剂组：加入浓度为1μm的vs6766和5μm的lxh254、hm95573或plx8394；加入浓度为1μm的vs6766和1μm的ly3009120。用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（1ml）。加入相应药物后继续培养5-10天（期间每2-3天更换1次新鲜完全培养基及药物）。集落形成后，用0.01m的pbs溶液（biosharp）缓慢冲洗1次，避免吹掉细胞，用多聚甲醛固定20min，pbs冲洗1次，0.5%结晶紫染色20min，pbs冲洗3次，拍照采图，观察细胞克隆数量。
44.（3）蛋白免疫印迹实验：（a）vs6766与raf二聚体抑制剂短时间联合（24h）的作用效果。
45.具体分组为：
①
对照组：加入dmso；
②
vs6766组：加入浓度为0.1μm的vs6766；
③
raf二聚体抑制剂组：加入浓度为2μm的lxh254、ly3009120、hm95573或plx8394；
④
vs6766+raf二聚体抑制剂组：加入浓度为0.1μm的vs6766和2μm的lxh254、ly3009120、hm95573或plx8394；用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（2ml）。加入药物后继续培养24h，提取蛋白。
46.（b）vs6766与raf二聚体抑制剂长时间联合（120h）的作用效果。
47.具体分组为：
①
对照组：加入dmso；
②
vs6766组：加入浓度为1μm的vs6766；
③
raf二聚体抑制剂组：加入浓度为2μm的lxh254、ly3009120、hm95573或plx8394；
④
vs6766+raf二聚体抑制剂组：加入浓度为1μm的vs6766和2μm的lxh254、ly3009120、hm95573或plx8394；用新鲜完全培养基配制各组药物，每孔的反应体系的终体积相同（2ml）。各组加入相应药物后，继续培养120h，每2-3天更换新鲜完全培养基以支持细胞生长并维持药物浓度。在相应时间点分别提取细胞总蛋白，进行蛋白免疫印迹实验，检测mapk通路主要蛋白pmek1/2（s218/s222，abcam）、perk（erk1（pt202/py204）+erk2（pt185/py187），abcam）的表达水平。
48.实验结果：图6为vs6766联合lxh254、ly3009120、hm95573及plx8394的cck8细胞增殖实验结果。由图6a和图6b可知，在同等浓度下（2μm），与其他raf二聚体抑制剂相比，lxh254单药和ly3009120单药对kras突变型肠癌细胞hct116-kras g13d或sw480-kras g12v的抑制作用更强。且vs6766+lxh254组、vs6766+ly3009120组、vs6766+hm95573组的相对细胞增殖比例均显著低于单药组，而vs6766+plx8394联合组效果相比于其他联合组效果不佳。说明vs6766联合raf二聚体抑制剂（lxh254、ly3009120或hm95573）使用对于抑制kras突变型肠癌的增殖具有协同作用，而vs6766与plx8394联合使用的效果不佳。
49.图7为vs6766联合lxh254、ly3009120、hm95573及plx8394的克隆形成实验结果。由图7可知：vs6766单药可有效抑制kras突变型肠癌细胞的克隆形成，lxh254单药、ly3009120单药及hm95573单药均可有效抑制kras突变型肠癌细胞的克隆形成，而plx8394单药的抑制作用较弱；vs6766+lxh254组、vs6766+ly3009120组、vs6766+hm95573组的两种细胞克隆数均明显少于其单药组，而vs6766+plx8394联合组效果相比于其他联合组效果不佳。说明与单独使用相比，vs6766与raf二聚体抑制剂（lxh254、ly3009120或hm95573）联合使用可更有效抑制kras突变肠癌细胞增殖与存活，而vs6766与plx8394联合使用的效果不佳。
50.图8为vs6766联合lxh254、ly3009120、hm95573及plx8394的蛋白免疫印迹实验结果，4种raf二聚体抑制剂的浓度均为2μm。由图8a可知：vs6766单药可有效抑制perk活性，部分抑制pmek活性；各raf二聚体单药对pmek、perk活性的抑制作用较弱；与vs6766单药组和raf二聚体抑制剂单药组相比，vs6766+lxh254组、vs6766+ly3009120组和vs6766+hm95573组可更有效地抑制pmek、perk的活性，而vs6766+plx8394联合组效果相比其他联合组效果不佳。由图8b可知，短时间（24h）vs6766单药处理可有效抑制pmek、perk活性，但较长时间（120h）vs6766单药处理存在pmek、perk反弹激活；而vs6766+lxh254组、vs6766+ly3009120组和vs6766+hm95573组，可持久同时有效抑制pmek、perk活性，而vs6766+plx8394联合组效果相比其他联合组效果不佳，这与与cck8和克隆形成实验的结果一致。
51.综上，vs6766联合raf二聚体抑制剂（lxh254、ly3009120、hm95573）可有效抑制
kras突变肠癌细胞增殖与存活，同时有效抑制mapk通路关键激酶pmek、perk的活性，并可逆转vs6766长时间单药治疗导致的pmek、perk反弹激活。上述raf二聚体抑制剂中，尤其lxh254、ly3009120与vs6766的联合效果更优，lxh254在相关临床试验中体现出更可靠的有效性和安全性。因此，vs6766与lxh254联合方案不仅疗效优于其他方案，也更具临床转化价值。
52.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.vs6766联合lxh254用于制备治疗kras突变型结直肠癌的药物中的应用。2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括vs6766和lxh254。

技术总结
本发明提供了VS6766联合LXH254的应用及药物组合物，涉及生物医药技术领域。与单独使用RAF/MEK双靶点抑制剂VS6766或RAF二聚体抑制剂LXH254相比，联合使用RAF/MEK双靶点抑制剂VS6766与RAF二聚体抑制剂LXH254对抑制KRAS突变型肠癌细胞增殖发挥了协同增效的作用，可持久有效的抑制MAPK通路的pMEK、pERK活性，因此将RAF/MEK双靶点抑制剂VS6766联合RAF二聚体抑制剂LXH254既可以采用联合用药的方式，又可以制成药物组合物或制剂，用于治疗肠癌，特别是KRAS突变型肠癌，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：尹欢欢
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/8/13