一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法与流程

1.本发明涉及涉及细胞领域，尤其是涉及一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法。


背景技术：

2.甘草（glycyrrhiza）又名甜草（东北、内蒙古），甜草根（陕西），为豆科（leguminosae）蝶形花亚科（papiliantae taub.）甘草属多年生草本植物。近年来，各国学者对甘草化学成分进行了大量的研究，已经从甘草中分离得到约170 多种化学成分；其中，黄酮类和三萜类化合物是主要成分，此外，还有甘草多糖、多种氨基酸、有机酸以及少量的生物碱、香豆素和木质素等。
3.随着对甘草药理作用的深入研究，发现甘草总黄酮类化合物具有多种生物活性，除了消炎、抗菌、抗变态等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、防肿瘤等方面也有明显的生物活性，目前已成为甘草研究的热点。
4.目前有关甘草的细胞培养体系及其次生代谢产物甘草总黄酮主要的培养方式是悬浮培养，当细胞生长量达到最大时，采用细胞破碎的方式使胞内次生代谢产物释放出来，再进一步地提取纯化，在这个过程中，细胞直接死亡，不能可持续的生产甘草总黄酮。
5.因此，如何使甘草细胞中的甘草总黄酮有效地释放到液体培养基中，并且保证甘草细胞存活，能够进行可持续甘草总黄酮的生产活动成为迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明公开了一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，可以使得甘草细胞中的甘草总黄酮有效地释放到液体培养基中，在此基础上保证甘草细胞存活，能够进行可持续甘草总黄酮的生产活动。
7.第一方面，本技术提供一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，采用如下的技术方案：一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，步骤如下：将甘草外植体进行悬浮培养，得到细胞悬浮液；向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养，得到含有甘草总黄酮的细胞悬浮液。
8.优选的，将甘草外植体进行悬浮培养的步骤如下：将甘草外植体放入至液体培养基中进行悬浮培养，得到细胞悬浮液。
9.优选的，甘草外植体与液体培养基的质量体积比为5g/l-25g/l。
10.优选的，悬浮培养的时间为20-50天。
11.优选的，悬浮培养的条件为25
±
1℃黑暗培养，摇床转速100-120rpm。
12.本技术中的甘草外植体包括甘草外植体的根、茎、叶、胚根、子叶等。本技术中通过
将甘草外植体进行悬浮培养，甘草外植体在液体培养基中发生脱分化，由于甘草外植体是在液体培养基中培养，所以直接获得了细胞悬浮液，而常规的细胞悬浮培养需要利用甘草外植体诱导愈伤组织（30-50天），再用愈伤组织进行悬浮培养获得细胞悬浮液（20-50天），本技术的培养方式与常规悬浮培养相比缩短了培养时间。
13.优选的，表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温-20中任意一种；加入的表面活性剂可以在维持细胞正常生长的情况下增加其表面活性，使细胞内次生代谢物质释放出来。
14.优选的，加入表面活性剂后的细胞悬浮体系中，表面活性剂的质量浓度为0-20%，且不为0。
15.优选的，向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养的时间为10-15天。
16.优选的，向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养，培养的条件为25
±
1℃黑暗培养，摇床转速100-120rpm。
17.优选的，液体培养基以ms为基本培养基，质量浓度为4.4g/l，6-ba质量浓度为0.3-1.0 mg/l，naa质量浓度为0.3-1.0 mg/l，2,4-d质量浓度为0.3-1.0 mg/l，蔗糖30g/l，ph值为5.8-6.0。
18.本技术中将甘草外植体直接获取悬浮细胞，方法简单、容易操作，耗费时间周期短、且增殖效率高，可在短时间内获得大量甘草单细胞，通过添加表面活性剂，可以使甘草单细胞内的次生代谢物质释放到培养基中，且保证较高的细胞成活率，可以在更低的时间及经济成本上更加高效地生产甘草总黄酮。
19.在一个具体的可实施方案中，一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，步骤如下：（1）甘草无菌苗的获取；选择饱满无病虫害的光果甘草种子，用体积浓度为75%的酒精消毒3 min，再用体积浓度为10%的次氯酸钠消毒15 min，无菌水清洗3次后，用滤纸吸干种子水分，接种到ms培养基中使其萌发，得到光果甘草无菌苗。
20.（2）甘草下胚轴液体培养以光果甘草无菌苗为材料，切取其下胚轴，直接放入液体培养基中，在25
±
1℃黑暗培养，摇床转速100-120rpm下进行悬浮震荡培养20-50天，得到稳定的细胞悬浮液。
21.光果甘草无菌苗下胚轴与液体培养基的质量体积比为5g/l-25g/l。
22.液体培养基以ms为基本培养基，质量浓度为4.4g/l，6-ba质量浓度为0.3-1.0 mg/l，naa质量浓度为0.3-1.0 mg/l，2,4-d质量浓度为0.3-1.0 mg/l，蔗糖30g/l，ph值为5.8-6.0。
23.甘草下胚轴液体培养的过程如下：光果甘草无菌苗下胚轴进行培养至1周时，下胚轴开始膨大，并有少量细胞悬出；培养至3-4周时，细胞分裂生长速度较快，此时开始传代培养，之后每2-3周传代一次，传代两次后获得稳定的细胞悬浮液。
24.（3）表面活性剂浓度的确定向细胞悬浮液中加入表面活性剂，在25
±
1℃黑暗培养，摇床转速100-120rpm下进行培养10-15天，得到含有甘草总黄酮的细胞悬浮液。
25.其中，表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温-20中任意一种。
26.加入表面活性剂后的细胞悬浮体系中，表面活性剂的质量浓度为0-20%，且不为0。
27.1.甘草中的总黄酮成分的检测与分离纯化甘草中的总黄酮成分的检测：对制备得到的含有甘草总黄酮的细胞悬浮液中的黄酮含量进行测定。
28.分离纯化：将含有甘草总黄酮的细胞悬浮液进行分离，纯化，得到不同纯度的甘草总黄酮原料。
29.本技术中以光果甘草无菌苗为材料，切取其下胚轴，直接放入液体培养基中进行悬浮震荡培养，20-50天即可建立稳定的细胞悬浮液。向上述细胞悬浮液中加入不同浓度的表面活性剂（聚乙二醇-peg、聚乙烯吡咯烷酮-pvp、吐温-20中任意一种），在细胞存活率较高的情况下使细胞悬浮液中的甘草细胞将次生代谢物释放到液体培养基中，最终在液体培养基中将甘草总黄酮进行分离纯化获得甘草总黄酮，可直接药用或用于化妆品。
30.第二方面，本技术提供一种含有甘草总黄酮的细胞悬浮液，采用如下的技术方案：一种含有甘草总黄酮的细胞悬浮液，采用上述方法制备得到。
31.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：1、本发明公开了一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，可以在维持细胞存活的基础上获取甘草总黄酮。
32.2、本发明公开了一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，将甘草外植体直接获取悬浮细胞，方法简单、容易操作，耗费时间周期短、且增殖效率高，可在短时间内获得大量甘草单细胞，通过添加的表面活性剂，可以使甘草单细胞内的次生代谢物质释放到培养基中，且保证较高的细胞成活率，可以在更低的时间及经济成本上更加高效地生产甘草总黄酮。
附图说明
33.图1为甘草无菌苗的获取；图2为甘草下胚轴液体培养10天的状态；图3为稳定甘草细胞悬浮液的获取；图4为添加不同浓度吐温-20对黄酮含量及细胞成活率的影响；图5为添加不同浓度pvp对黄酮含量及细胞成活率的影响；图6为添加不同浓度peg对黄酮含量及细胞成活率的影响；图7为表面活性剂添加对细胞生长的影响（左图分别添加3%、5%、8%peg、右图分别添加3%、5%、8%吐温-20）。
具体实施方式
34.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
35.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.本实施例中以光果甘草无菌苗为例进行说明，另外，本实施例中不限制于光果甘草无菌苗，还包括甘草的其他品种，比如胀果甘草无菌苗、乌拉尔甘草无菌苗、刺果甘草无菌苗等。
37.实施例：
1、光果甘草无菌苗的获取选择饱满无病虫害的光果甘草种子，用体积浓度为75%的酒精消毒3 min，再用体积浓度为10%的次氯酸钠消毒15 min，无菌水清洗3次后，用滤纸吸干种子水分，接种到ms培养基中使其萌发，见图1。
38.2、甘草下胚轴液体培养（细胞悬浮液的获取）待种子萌发后3-5天，将下胚轴切成大小0.3-0.8cm，将0.5g光果甘草无菌苗的下胚轴直接放入至50ml液体培养基中，在25℃黑暗培养，摇床转速120rpm下，进行悬浮培养1.5个月，得到细胞悬浮液。
39.所用的液体培养基以ms为基本培养基4.4g/l，6-ba质量浓度为0.5 mg/l，naa质量浓度为0.5mg/l，2,4-d质量浓度为0.5mg/l，蔗糖30g/l，ph值为5.8-6.0。
40.甘草下胚轴液体培养的过程如下：培养至一周左右时，甘草下胚轴在液体培养基中膨大，并有少量悬浮细胞出现（见图2）；培养至3-4周时，细胞分裂生长速度较快，此时开始传代培养，之后每3周传代一次，传代2次即可获得稳定的细胞悬浮液（见图3）。
41.3、表面活性剂浓度的确定以不添加表面活性剂的传代培养基为对照（ck），分别加入不同质量浓度的表面活性剂，其中，聚乙烯吡咯烷酮pvp加入的质量浓度分别为1%、2%、3%、5%、8%、10%、20%（对应的重量分别为0.5g、1g、1.5g、2.5g、4g、5g、10g）；聚乙二醇peg加入的质量浓度分别为1%、2%、3%、5%、8%、10%、20%（对应的重量分别为0.5g、1g、1.5g、2.5g、4g、5g、10g）；吐温-20加入的质量浓度分别为1%、2%、3%、5%、8%、10%、20%（对应的重量分别为0.5g、1g、1.5g、2.5g、4g、5g、10g），增加甘草单个细胞的表面活性，使其次生代谢物质释放到培养基内。
42.具体步骤如下：表面活性剂的灭菌：分别取各梯度上述表面活性剂的药品加入装有10ml液体培养基的三角瓶中（容量为250ml），透气封口膜封好后，在120℃下进行灭菌15min后，将灭菌后的培养基放凉。
43.所用的液体培养基以ms为基本培养基4.4g/l，6-ba质量浓度为0.5 mg/l，naa质量浓度为0.5mg/l，2,4-d质量浓度为0.5mg/l，蔗糖30g/l，ph值为5.8-6.0。
44.表面活性剂的添加：向40ml的细胞悬浮液中加入上述灭菌后的培养基，在25℃摇床中黑暗培养，转速120rpm，培养至14天，得到含有甘草总黄酮的细胞悬浮液。
45.4、甘草细胞成活率统计取200μl含有甘草总黄酮的细胞悬浮液进行沉淀，对沉淀后得到的悬浮细胞进行台盼蓝染色，染为蓝色的为死细胞，未染上色的为活细胞，最后统计细胞成活率、进行数据分析。
46.5、甘草中的总黄酮成分的检测将含有甘草总黄酮的细胞悬浮液离心后，对上清液中的甘草总黄酮进行的检测，最后进行数据分析。
47.对加入不同质量浓度的表面活性剂制备得到的样品进行检测，检测结果如图4-图7所示，根据图4-图6可知，随着表面活性剂的浓度的增高，细胞成活率及黄酮浓度成先升高后下降的趋势，以黄酮浓度和细胞成活率同时作为评判标准，两组数据同时达到峰值为最佳结果；表面活性剂添加对细胞生长的影响如图7所示，其中左图分别添加质量浓度为3%、
5%、8%的peg、右图分别添加质量浓度为3%、5%、8%的吐温-20。
48.图4为添加不同浓度吐温-20对黄酮含量及细胞成活率的影响，根据图4可知，随着表面活性剂（吐温-20）的浓度的增高，细胞成活率及黄酮浓度成先升高后下降的趋势，当吐温-20添加量优选为质量浓度1%-5%时，黄酮含量、细胞成活率最高，并且当吐温-20添加量为质量浓度3%和质量浓度5%时黄酮含量最高，分别为35.59
±
1.01mg/l、36.46
±
1.81mg/l；细胞成活率分别为82.03
±
1.37%、65.82
±
11.78%。
49.图5为添加不同浓度pvp对黄酮含量及细胞成活率的影响，根据图5可知，随着表面活性剂（pvp）的浓度的增高，细胞成活率及黄酮浓度成先升高后下降的趋势，根据图5的数据综合来看，当pvp添加量优选为质量浓度1%、2%、8%时，黄酮含量、细胞成活率均不低，其综合数据较优，并且当pvp添加量为质量浓度8%时，黄酮含量最高为37.01
±
2.45mg/l，但是细胞成活率较低为32.90
±
5.25%。
50.图6为添加不同浓度peg对黄酮含量及细胞成活率的影响，根据图6可知，随着表面活性剂（peg）的浓度的增高，细胞成活率及黄酮浓度成先升高后下降的趋势，添加质量浓度20% peg培养基中黄酮显著降低，其他添加量对液体培养基中黄酮含量及细胞成活率没有显著影响，当peg添加量优选为质量浓度2%-10%时，黄酮含量、细胞成活率最高。
51.对比例：常规的细胞悬浮培养，步骤如下：将甘草外植体诱导愈伤组织培养50天后，再用愈伤组织以接种量10g/l放入至液体培养基中，在25℃黑暗培养，摇床转速120rpm下，进行悬浮培养40天，获得稳定的细胞悬浮液。
52.所用的液体培养基以ms为基本培养基4.4g/l，6-ba质量浓度为0.5 mg/l，naa质量浓度为0.5mg/l，2,4-d质量浓度为0.5mg/l，蔗糖30g/l，ph值为5.8-6.0。
53.本技术中通过将甘草外植体进行悬浮培养，甘草外植体在液体培养基中发生脱分化，由于甘草外植体是在液体培养基中培养，所以直接获得了细胞悬浮液，悬浮培养的时间为20-50天，而常规的细胞悬浮培养需要利用甘草外植体诱导愈伤组织培养30-50天后，再用愈伤组织进行悬浮培养20-50天，获得细胞悬浮液，因此，本技术的培养方式与常规悬浮培养相比缩短了培养时间。
54.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于，步骤如下：将甘草外植体进行悬浮培养，得到细胞悬浮液；向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养，得到含有甘草总黄酮的细胞悬浮液。2.根据权利要求1所述的一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于，将甘草外植体进行悬浮培养的步骤如下：将甘草外植体放入至液体培养基中进行悬浮培养，得到细胞悬浮液。3.根据权利要求2所述的一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于，甘草外植体与液体培养基的质量体积比为5g/l-25g/l。4.根据权利要求1或2所述的一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于：悬浮培养的时间为20-50天。5.根据权利要求1所述的一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于：表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐温-20中任意一种。6.根据权利要求5所述的一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于：加入表面活性剂后的细胞悬浮体系中，表面活性剂的质量浓度为0-20%，且不为0。7.根据权利要求1所述的一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，其特征在于：向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养的时间为10-15天。8.一种含有甘草总黄酮的细胞悬浮液，其特征在于：所述含有甘草总黄酮的细胞悬浮液按照权利要求1-7任一项所述的方法制得。

技术总结
本发明公开了一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，步骤如下：将甘草外植体进行悬浮培养，得到细胞悬浮液；向细胞悬浮液中加入表面活性剂进行培养，得到含有甘草总黄酮的细胞悬浮液；本发明公开了一种促进甘草细胞向悬浮培养基中释放次生代谢产物甘草总黄酮的方法，将甘草外植体直接获取悬浮细胞，方法简单、容易操作，耗费时间周期短、且增殖效率高，可在短时间内获得大量甘草单细胞，通过添加表面活性剂，可以使甘草细胞内的次生代谢物质释放到培养基中，且保证较高的细胞成活率，可以在更低的时间及经济成本上更加高效地生产甘草总黄酮。成本上更加高效地生产甘草总黄酮。成本上更加高效地生产甘草总黄酮。


技术研发人员：位明君 赵永军 邵瞳 谭国昇 姚睿 潘如雪
受保护的技术使用者：浙江觅得优生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/8/13