植物乳杆菌在缓解肝损伤中的应用

1.本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及植物乳杆菌在缓解肝损伤中的应用。


背景技术：

2.非酒精性脂肪性肝病(nafld)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(sfl)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)及其相关肝硬化。非酒精性脂肪性肝病(nafld)分原发性和继发性两大类，前者与胰岛素抵抗和遗传易感性有关，而后者则由某些特殊原因所致。营养过剩所致体重增长过快和体重过重，肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢综合征相关脂肪肝，以及隐源性脂肪肝均属于原发性非酒精性脂肪性肝病范畴；而营养不良、全胃肠外营养、减肥手术后体重急剧下降、药物/环境和工业毒物中毒等所致脂肪肝则属于继发性非酒精性脂肪性肝病范畴。非酒精性脂肪性肝病除可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发外，还可影响其他慢性肝病的进展，并参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。代谢综合征相关恶性肿瘤、动脉硬化性心脑血管疾病以及肝硬化为影响非酒精性脂肪性肝病患者生活质量和预期寿命的重要因素。为此，非酒精性脂肪性肝病成为当代医学领域的新挑战。
3.到目前为止，尚无防治脂肪肝的特效药物。西药常选用保护肝细胞、降脂药物及抗氧化剂等，如维生素b、c、e，卵磷脂、熊去氧胆酸、水飞蓟素、肌苷、辅酶a、还原型谷胱甘肽、牛磺酸、肉毒碱乳清酸盐、以及某些降脂药物等。也可用丹参、山楂、草决明、泽泻、柴胡汤、五苓散等中药治疗。但治疗效果并不理想，并且还会带来一定的副作用。
4.氧化应激被认为是肝细胞毒性和发病机制中的一个关键因素。因此，抗氧化活性或者抑制和清除自由基在保护肝损伤中起着至关重要的作用。活性氧(ros)是正常细胞代谢的一种产物，特别是在线粒体呼吸链所产生的活性氧，例如超氧阴离子(o
2-)、过氧化氢(h2o2)和有机过氧化物等。通常，内源性活性氧(ros)可以通过酶促抗氧化剂(如超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)、过氧化氢酶(cat))和非酶促抗氧化剂(如谷胱甘肽(gsh)、维生素c和d)的复杂系统消除。然而，如果生理抗氧化防御系统未能及时清除ros，过量的ros会引起细胞内氧化应激，进而破坏蛋白质、dna等在内的细胞结构，从而导致产生炎症。在线粒体中，高水平的ros可导致膜磷脂的自由基攻击，导致线粒体膜去极化，这与细胞色素c的释放有关，触发caspase-3活化和细胞凋亡。氧化应激和过量的ros积累可以导致肝细胞的凋亡，并诱导受损肝脏中肝星状细胞的活化和增殖，从而导致慢性肝病的发展。因此，抗氧化治疗可能是纠正这些肝病发展过程中氧化剂和抗氧化剂之间不平衡的策略之一，以防止肝细胞过度暴露于氧化应激。
5.益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。活性益生菌还有抗氧化的能力，可以清除人体内的氧自由基、增强人体的免疫力，同时调节人
体的血脂水平、保护心血管。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明提供了植物乳杆菌bx62在缓解非酒精性脂肪肝中的应用，植物乳杆菌bx62能有效降低ast和alt的含量；提高sod含量，有效降低肝脏脂肪沉积对肝脏的损伤。本发明还提供了植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62在缓解肝损伤中的应用，两株菌能协同增高gsh-px的活性和cat活力，为临床干预和预防高脂饮食导致的肝损伤和氧化应激，提供了广阔的应用前景。
7.术语：
8.本发明中，“ast”指谷草转氨酶，“alt”指谷丙转氨酶，“sod”指超氧化物歧化酶。
9.本发明中，“gsh-px”指谷胱甘肽过氧化物酶，“cat”指过氧化氢酶。
10.一方面，本发明提供了植物乳杆菌bx62在制备预防或治疗肝损伤的药物中的应用。
11.所述的植物乳杆菌bx62保藏编号为cgmcc no.15779。
12.所述的肝损伤包括但不限于高血脂造成的肝损伤。
13.所述的高血脂包括但不限于高胆固醇血症或混合型高脂血症。
14.所述的药物可以用于减轻肝脏的脂肪堆积或细胞肿胀、降低肝脏细胞中的中性脂肪堆积或提高gsh-px的活性、提高cat活力。
15.优选地，所述的肝损伤为非酒精性脂肪肝。
16.优选地，所述的药物中还可以包括植物乳杆菌lp5；植物乳杆菌lp5的保藏编号为：cgncc no.9017。
17.进一步优选地，所述的药物中植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62的菌数比例选自1-2:1-2，所述的菌数比例可以是2-3:2-3。
18.更进一步地，所述的药物中植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62的菌数比例为1:1。
19.优选地，所述的药物中同时包括植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62时，所述的药物中，菌数不低于108cfu/g或108cfu/ml，进一步优选为不低于109cfu/g或109cfu/ml。根据常规情况，可以选择10
9-10
12
cfu/g或10
9-10
12
cfu/ml，也可根据实际情况进行调节。
20.具体地，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
21.进一步具体地，所述的药学上可接受的辅料可以是淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、微晶纤维素中的一种或多种。
22.基于上述内容，本发明同时提供了植物乳杆菌bx62在制备预防肝损伤并发症的药物中的应用。所述的药物通过预防或治疗肝损伤达到预防肝损伤并发症的目的，特别是高血脂引起的肝损伤，包括但不限于非酒精性脂肪肝。
23.基于上述内容，本发明同时提供了植物乳杆菌bx62在制备维护高血脂人群肝脏功能的保健品中的应用。
24.另一方面，本发明提供了一种益生菌组合物。
25.所述的益生菌组合物中包括植物乳杆菌bx62和植物乳杆菌lp5。
26.所述的益生菌组合物中，植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62的菌数比例为1-2:1-2。
27.基于上述已经记载的内容，本发明的益生菌组合物可以用于制备预防或治疗肝损伤的药物、预防肝损伤并发症的药物或维护高血脂人群肝脏功能的保健品。
28.本发明同时也提供了包括前述益生菌组合物的药品或保健品，所述的药品和保健品的功能如上述内容记载。
29.本发明的有益效果：
30.(1)植物乳杆菌株bx62能有效降低小鼠血清中甘油三酯的含量；提高高密度脂蛋白胆固醇的含量；能有效降低谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量；提高超氧化物歧化酶含量。
31.(2)植物乳杆菌株lp5和植物乳杆菌株bx62组合在提高高密度脂蛋白胆固醇的含量，降低ast和alt的含量等方面与植物乳杆菌株bx62相当，但在提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶含量方面优于两株均单独使用，在抗氧化方面表现了良好的协同性。
附图说明
32.图1为实施例1的实验数据；其中，a为sd大鼠每周体重变化对比图；b为sd大鼠平均日能量摄入变化对比图；c为sd大鼠饲料利用率对比图；d为sd大鼠肝脏指数对比图。
33.图2为实施例1的实验数据；其中，a为sd大鼠第十三周血清总胆固醇和甘油三酯含量对比图；b为sd大鼠第十三周血清高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量对比图；c为sd大鼠第十三周血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量对比图；d为sd大鼠第十三周肝脏谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量对比图；e为sd大鼠第十三周肝脏总胆固醇和甘油三酯含量对比图。
34.图3为实施例1的实验数据；其中，a为sd大鼠第十三周血清中葡萄糖(glu)含量；b为sd大鼠第十三周血清中胰岛素(ins)含量；c为sd大鼠胰岛素抵抗指数(homa-ir)。
35.图4为实施例1的实验数据；其中，a为sd大鼠第十三周血清丙二醛(mda)含量对比图；b:sd大鼠第十三周血清超氧化物歧化酶(sod)含量对比图；
36.图5为实施例1中sd大鼠第十三周谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)含量，其中a为肝脏中的；b为血清中的；柱形图上方字母相同代表无显著性差异，字母不同代表存在显著性差异。
37.图6为实施例1中sd大鼠第十三周过氧化氢酶(cat)含量，其中a为肝脏中的；b为血清中的。
38.图7为实施例1中sd大鼠肝脏组织he染色切片图。
39.图8为实施例1中sd大鼠肝脏组织油红o染色切片图。
具体实施方式
40.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
41.本发明实施例中所用的植物乳杆菌lp5的保藏编号为：cgncc no.9017；植物乳杆菌bx62保藏编号为cgmcc no.15779，均为现有技术已公开菌株。
42.基础实验例植物乳杆菌的培养
43.将植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62分别接种于mrs液体培养基中，于37℃静置培养12h，然后转接活化两次，调整菌种的数量至1
×
109cfu/ml，用于后续实验。
44.实施例1植物乳杆菌bx62和植物乳杆菌lp5在缓解大鼠肝损伤中的应用
45.本实施例中，基础普通饲料和高胆固醇饲料均购自北京博泰宏达生物技术有限公司。
46.1.1实验动物及分组
47.实验动物为5周龄雄性sd大鼠30只，体重208
±
13g。每3只分别喂养于spf级鼠房中的单独隔离的鼠笼，室温维持在23
±
2℃，相对湿度为55％
±
5％，并且定时12小时光照和12小时黑暗；饲料和水由老鼠自由取食；sd大鼠在第一周适应期间喂食基础普通饲料。适应一周后，将大鼠随机分为5组，每组6只，具体分组如下：
48.(1)nd组(记为a)：空白对照组，此组sd大鼠喂食基础普通饲料；
49.(2)hfd组(记为b)：高胆固醇组，此组sd大鼠喂食高胆固醇饲料；
50.(3)lp5组(记为c)：喂食高胆固醇饲料+植物乳杆菌lp5组，此组sd大鼠喂食高胆固醇饲料，并且每天灌胃1ml植物乳杆菌lp5菌液，菌数在1
×
109cfu/ml。
51.(4)bx62组(记为d)：喂食高胆固醇饲料+植物乳杆菌bx62组，此组sd大鼠喂食高胆固醇饲料，并且每天灌胃1ml植物乳杆菌bx62菌液，菌数在1
×
109cfu/ml。
52.(5)lp5+bx62组(记为e)：喂食高胆固醇饲料+植物乳杆菌lp5组和植物乳杆菌bx62组，此组sd大鼠喂食高胆固醇饲料，并且每天灌胃0.5ml植物乳杆菌lp5菌液和0.5ml植物乳杆菌bx62菌液，总菌数在1
×
109cfu/ml。
53.基础普通饲料和高胆固醇饲料的配方分别见表1和表2。
54.表1基础普通饲料
[0055][0056]
表2高胆固醇饲料
[0057][0058]
1.2实验内容
[0059]
对sd大鼠进行采食量记录并每周记录其体重，实验进行13周后，将大鼠禁食12h后乙醚麻醉，腹腔动脉采血5ml，放入-80℃冰箱待用。
[0060]
将肝脏取出用生理盐水冲洗并擦拭干净后称重，计算脏器指数，结果表明饲喂植物乳杆菌lp5、bx62和lp5+bx62对大鼠均没有明显毒副作用；一部分肝组织用于各指标的检测分析，一部分肝组织切块后(1cm
×
1cm)放入10％甲醛溶液中固定，待用。
[0061]
1.3样品制备及胆固醇各指标分析
[0062]
1.3.1血清
[0063]
采集到的血液样品放置于室温三小时后，低温低速离心取上层淡黄色液体，立即冷冻于-80℃冰箱，直到测定总胆固醇、甘油三酯等各指标。
[0064]
1.3.2肝组织
[0065]
将肝组织加入适量生理盐水捣碎。3000rpm/min，离心10min，取上清用于各指标的检测。
[0066]
1.3.3检测方法
[0067]
肝脏及血清样品中总胆固醇(tc)、总甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、胆汁酸(tba)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)、过氧化氢酶(cat)等指标，均利用市售相应指标的常规试剂盒来测定，其具体信息如下：
[0068]
(1)tc:南京建成生物工程研究院，a111-1-1；
[0069]
(2)tg:南京建成生物工程研究院，a110-1-1；
[0070]
(3)ldl-c：南京建成生物工程研究院，a113-1-1；
[0071]
(4)hdl-c：南京建成生物工程研究院，a112-1-1；
[0072]
(5)ast:南京建成生物工程研究院，c010-2-1；
[0073]
(6)alt:南京建成生物工程研究院，c009-2-1；
[0074]
(7)sod:南京建成生物工程研究院，a001-3-2；
[0075]
(8)mda:南京建成生物工程研究院，a003-1-2；
[0076]
(9)tba:南京建成生物工程研究院，e003-2-1；
[0077]
(10)gsh-px：南京建成生物工程研究院，a006-2-1；
[0078]
(11)cat:南京建成生物工程研究院，a007-1-1。
[0079]
1.3.4结果分析
[0080]
由图1中的a可知，hfd组的大鼠体重较nd组增长速度快，并从第八周开始，hfd组和nd组呈显著性差异，随后差异逐渐增大；在第十二周时，lp5组大鼠的体重和hfd组相比呈显著下降趋势。此外，bx62组、lp5+bx62组和hfd组相比体重呈显著增加趋势。以上结果表明，植物乳杆菌lp5可以有效缓解高胆固醇导致的体重增加，但是bx62组和lp5+bx62组并无减重现象。
[0081]
大鼠的平均日能量摄入量如图1中的b所示，hfd组与nd组相比，其日均能量摄入量显著升高(p《0.05)；lp5组、bx62组和lp5+bx62组与hfd组相比，均无显著差异。饲料利用率情况如图1中的c所示，bx62组与hfd组相比，饲料利用率显著性增高；lp5组、lp5+bx62组与hfd组相比，均无显著差异。大鼠的肝脏脏器指数如图1中的d所示，与nd组相比，hfd组的肝脏脏器指数显著增加；lp5组与hfd组相比，其肝脏脏器指数显著降低；bx62组、lp5+bx62组和hfd组相比，无显著性差异。以上结果说明，灌胃植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62并未使大鼠产生厌食反应，并且灌胃植物乳杆菌lp5能够缓解由hfd导致的肝脏脏器指数的增加；
但是bx62组和lp5+bx62组并无减轻肝脏脏器指数现象。
[0082]
由图2中的a和b可知，与nd组相比，hfd组大鼠血清中tc、tg和ldl-c的含量显著升高，hdl-c的含量显著下降；lp5组相比于hfd组显著降低了大鼠血清中tc、tg和ldl-c的含量，而hdl-c的含量并无显著变化；bx62组相比于hfd组，显著提高了hdl-c的含量；lp5+bx62组和hfd组相比，可以显著降低血清中tg，并提高hdl-c的含量。血清和肝脏中的ast和alt如图2中的c和d所示，与nd组相比，hfd组的ast和alt的含量显著上升，说明高脂饮食能够对肝脏组织造成一定损伤。与hfd组相比，lp5组、bx62组和lp5+bx62组均显著降低了ast和alt的含量，所以植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62均可以降低由高胆固醇导致的肝损伤，对肝脏有一定的保护作用，并且在降低alt的含量上表现了良好的协同性。
[0083]
由图3可知，hfd组大鼠血清中葡萄糖和胰岛素的含量显著上升，并导致胰岛素抵抗指数的上升。lp5组与hfd组相比，血清中的葡萄糖和胰岛素的水平显著降低，并促进胰岛素抵抗指数的下降；但是，bx62组、lp5+bx62组和hfd组相比，均无显著差异。以上结果说明，植物乳杆菌lp5可以有效降低高脂饮食导致的胰岛素抵抗，但是植物乳杆菌bx62以及两菌的组合无明显效果。
[0084]
如图4中的a所示，与nd组相比，hfd组血清中mda显著升高；与hfd组相比，lp5组血清中mda显著降低；但是，bx62组、lp5+bx62组和hfd组相比，血清中mda的含量并无显著差异。如图4中的b所示，与nd组相比，hfd组血清中sod显著降低；与hfd组相比，lp5组、bx62组和lp5+bx62组均显著升高了血清中sod的含量。
[0085]
由图5中的a可知，lp5组肝脏中gsh-px的与hfd组无显著性差异，gsh-px活性的活性最低；bx62组相对hfd组具有显著性差异，能显著提高gsh-px的活性；lp5+bx62组与nd组无显著性差异，能显著提高gsh-px的活性，并与nd组持平。由图5中的b可知，lp5组血浆中的gsh-px和bx62组均与hfd组无显著性差异，gsh-px的活性最低；lp5+bx62组与nd组无显著性差异，能显著提高gsh-px的活性。以上结果表明植物乳杆菌lp5与植物乳杆菌bx62能显著提高gsh-px的活性，相比于单独使用具有良好的协同作用。
[0086]
由图6的a可知，两株菌不论是单独还是组合使用均能提升血清和肝组织中的cat活力，其中单独使用对血清中的cat活力提升幅度最小，组合使用对cat活力提升幅度更大；lp5组肝脏中的cat活力提升幅度最小，其次是bx62组，提升幅度最大的是lp5+bx62组。以上结果表明植物乳杆菌lp5与植物乳杆菌bx62能显著提高cat活力，相比于单独使用同样具有良好的协同作用。
[0087]
1.4肝脏组织病理学切片
[0088]
固定好的肝脏组织进行石蜡包埋、切片、固定、he染色等步骤得到肝脏组织病理学切片，在光学显微镜下观察切片，he染色结果显示hfd组、lp5组、bx62组和lp5+bx62组大鼠肝脏细胞均出现不同程度的脂肪变性及空泡样变，变性的肝细胞肿胀成圆形，体积大于正常肝细胞，一个细胞内有许多圆形脂肪空泡，细胞核被挤于周边。其中hfd组尤为明显，几乎每个肝脏细胞内都充满较大的脂肪空泡且分布紧密，而lp5组、bx62组和lp5+bx62组仅有个别细胞内有较大脂肪空泡，多为较小的脂肪空泡，且分布松散。说明食用植物乳杆菌lp5、植物乳杆菌bx62以及两种菌同时食用均能明显减轻高脂饮食引起的大鼠脂肪堆积和细胞肿胀程度。
[0089]
油红o染色结果显示，与nd组相比，hfd组、lp5组、bx62组和lp5+bx62组大鼠肝脏细
胞内呈现深浅不等的油红着色，其中hfd组大鼠着色整体较深较密集，而lp5组、bx62组和lp5+bx62组着色较浅较分散，说明，植物乳杆菌lp5、bx62和lp5+bx62菌株能较明显地降低高脂饮食造成的肝脏细胞中性脂肪堆积程度。
[0090]
实施例2
[0091]
参照实施例1中的lp5+bx62组设置实施例2，区别在于，lp5菌液灌胃量为0.4ml，bx62菌液灌胃量0.6ml。
[0092]
实施例3
[0093]
参照实施例1中的lp5+bx62组设置实施例2，区别在于，lp5菌液灌胃量为0.6ml，bx62菌液灌胃量0.4ml。
[0094]
对比例
[0095]
参照实施例1设置对比例1-3，如表3。
[0096]
表3
[0097][0098]
参照实施例1的方法，检测实施例2-3和对比例1-3的小鼠肝脏及血清中的gsh-px和cat含量，结果表明实施例2-3与实施例1的lp5+bx62组无显著性差异，均能显著提高gsh-px的活性和cat活力。对比例1-2与实施例1的lp5+bx62组存在显著性差异，对gsh-px的活性和cat活力的提高幅度不大。由此说明植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌株bx62在抗氧化方面的协同性最好。对比例3表明，相对于植物乳杆菌lp90，植物乳杆菌bx62对gsh-px的活性和cat活力的提高效果更好。

技术特征：
1.植物乳杆菌bx62在制备预防或治疗肝损伤的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物中还包括植物乳杆菌lp5。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物中植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62的菌数比例为1-2:1-2。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物中植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62的菌数比例为1:1。5.植物乳杆菌bx62在制备预防肝损伤并发症的药物中的应用，其特征在于，所述的肝损伤为高血脂造成的肝损伤。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物中还包括植物乳杆菌lp5，所述的药物中植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62的菌数比例为1-2:1-2。7.植物乳杆菌bx62在制备维护高血脂人群肝脏功能的保健品中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的保健品中还包括植物乳杆菌lp5；所述的保健品中植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62的菌数比例为1-2:1-2。9.一种益生菌组合物，其特征在于，包括植物乳杆菌bx62和植物乳杆菌lp5；所述的植物乳杆菌lp5和植物乳杆菌bx62的菌数比例为1-2:1-2。10.包括权利要求9所述的益生菌组合物的药品或保健品。

技术总结
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及植物乳杆菌在缓解肝损伤中的应用。本发明提供了植物乳杆菌株BX62在缓解非酒精性脂肪肝中的应用，植物乳杆菌株BX62能有效降AST和ALT的含量；提高SOD含量，有效降低肝脏脂肪沉积对肝脏的损伤。本发明还提供了植物乳杆菌Lp5和植物乳杆菌BX62作为组合物在缓解肝损伤中的应用，两株菌能协同显著增高SOD的含量、GSH-Px的活性和CAT活力，在抗氧化方面表现了良好的协同性，为临床干预和预防高脂饮食导致的肝损伤和氧化应激，提供了广阔的应用前景。提供了广阔的应用前景。提供了广阔的应用前景。


技术研发人员：郭旭生 林枫翔 丁梓桐 张百兵 朱杰 秦琦
受保护的技术使用者：兰州大学
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/8/13