一种基于AIE脂质体荧光纳米粒子检测腐胺的方法

一种基于aie脂质体荧光纳米粒子检测腐胺的方法
技术领域
1.本发明属于食品污染物检测技术领域，具体的，本发明涉及一种aie脂质体荧光纳米粒子及其在aie脂质体比色-荧光双模态检测腐胺残留中的应用。


背景技术：

2.腐胺是一种变质食品中的常见的生物胺源，其通常在低浓度下对人体是无害的，但是若是从变质食物中摄入了过量的生物胺会引起一些生理症状，如呼吸窘迫、头痛、高血压和呕吐等。除此之外，腐胺也是一种用来评判食品腐败和污染的重要的指标，通过对腐胺含量的判断进而评估食品质量、新鲜度和安全性，从而减少食物浪费。在此背景下，开启一种有效预警检测方法，用于现场检测食品基质中的腐胺残留，对于保护食品安全和人类身体健康具有重要意义。
3.目前常见的对于食品中的腐胺的检测方法包括液相色谱法、电化学检测、sers、比色法和荧光法等。虽然这些方法可以实现对食品中的腐胺实现定量检测，但是还存在着样品预处理复杂，需要大型和昂贵的仪器等问题。而单一的比色法和单发射的荧光法抗干扰能力小，容易受到外部环境的干扰。因此，构建一种比色和比例荧光双模态传感用于检测腐胺的含量是非常具有意义的。
4.与传统的合成具有酶活性的纳米材料相比，具有强氧化性的ag
+
有着更好的酶活性，且操作简单，省去了复杂的合成过程。dspe-peg纳米脂质体常被用作药物载体递送系统被用于亲脂性药物的递送；其具备的水溶性、生物相容性和无免疫原性等优势突出，具有良好的开发利用前景。


技术实现要素：

5.本发明解决的技术问题是提供一种aie脂质体荧光纳米粒子以及如何高效的检测腐胺。
6.为实现上述目的和其它相关目的，本发明采用如下的技术方案，一种aie脂质体荧光纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：将dspe-peg2000-ome、tpe溶解于二氯甲烷，充分混合后，置于磁力搅拌器上搅拌过夜；去除反应物中有机溶剂二氯甲烷，超滤离心、超纯水洗涤即得。
7.本发明的一个方案，本发明公开了一种aie荧光纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：（1）称取2.0 mg dspe-peg2000-ome、0.5 mg tpe 溶解于1.5 ml二氯甲烷中置于棕色瓶中，再加入1.5 ml超纯水，超声5min 使其充分混合，置于磁力搅拌器上搅拌过夜；（2）利用高压旋转蒸发仪去除有机溶剂二氯甲烷，之后转移到10.0 kd的超滤管中4000 rpm 离心5 min，用超纯水洗涤三次，得到aie荧光纳米粒子溶液。
8.制备得到aie荧光纳米粒子的浓度可以通过其在270 nm处的峰值进行定量。
9.本发明的一个方案，本发明公开了一种基于aie脂质体比色-荧光双模态检测样品中腐胺的方法，具体步骤为：s1：测定不同浓度的标准品紫外吸收光度值移取硝酸银溶液和rma溶液于一容器中，加入溶于水中的不同浓度的腐胺标准品，然后加入aie荧光纳米粒子溶液和opd溶液，混合均匀后移至比色皿中，用紫外分光光度计测量440 nm处吸光度值，记录腐胺样品浓度为0时的吸光度值为a0，其他腐胺样品浓度的吸光度值为a1，计算得到δa
0-a1；s2: 测定不同浓度标准品在365 nm波长激发下的荧光光谱移取硝酸银溶液和rma溶液于一容器中，加入溶于水中的不同浓度的待检腐胺样品，然后加入aie荧光纳米粒子溶液和opd溶液，混合均匀后移至比色皿中，用荧光分光光度计测量在365 nm波长激发下的荧光光谱，记录560 nm处与437 nm处的比值为f1=f
560 nm
/f
437 nm
；s3：构建标准曲线方程基于紫外分光光度计测试计算得到的δa
0-a1值与腐胺标准品的浓度c
putrescine 构建线性方程，紫外分光光度计回归方程为δa
0-a1＝ac
putrescine + b；基于荧光分光光度计测试计算得到的f值与腐胺标准品的浓度c
putrescine 构建线性方程，紫外分光光度计回归方程为f＝ac
putrescine + b；s4：待测样品检测从待测的含有污染物的样品代替腐胺标准品进行紫外分光光度测试计算δa
0-a1，荧光分光光度计测试计算f1值，将获得的δa
0-a1值和f1值带入相应的标准曲线方程，计算获得相应的待测样品的腐胺浓度值。
10.本发明的一个方案，优选的本发明中ag
+
的浓度为50.0 mg/ml；rma的浓度为 0.3 mg/ml；aie的浓度为0.32 mmol/l；opd溶液的浓度为10 mmol/l；缓冲液用的是d.i. h2o；ag溶液、rma乙醇溶液、aie溶液、opd溶液与d.i. h2o之间的体积比为：10：6：10：20：154。
11.本发明的一个方案，本发明中样品混合均匀后反应10 min，然后再移至比色皿中进行检测。
12.本发明的一个方案，本发明中紫外分光光度计回归方程为δa
0-a＝ 0.0017c
putrescine + 0.0068；荧光分光光度计回归方程为f =
ꢀ‑
0.0055c
putrescine + 1.6071；本发明的方案可以用于环境或食品中的腐胺的检测，优选的检测液体食品、环境水体中的腐胺；样品在检测前用孔径0.22 μm滤纸或滤膜过滤，收集滤液。
13.本发明的一个方案，本发明公开了一种基于aie脂质体比色-荧光双模态检测样品中腐胺的试剂，包括本发明方法制备的aie荧光纳米粒子。
14.本发明的一个方案，本发明公开了一种基于aie脂质体比色-荧光双模态检测样品中腐胺的试剂盒，所述试剂盒包括aie荧光纳米粒子、ag+溶液、rma乙醇溶液、opd溶液、d.i. h2o。
有益效果
15.本发明用dspe-peg-2000将具有聚集诱导发光特性的tpe包裹形成aie荧光纳米粒子，本方法脂质体荧光纳米粒子aie合成方法简单，具有较好的荧光特性。可用作构建比率
荧光检测方法的内参，可以有效避免外部环境的干扰。
16.本发明以具有强氧化性的ag
+
作为氧化opd产生具有黄色荧光的dap的催化剂，腐胺所带来的碱性环境可以将rma水解为间苯二酚，后者可以将ag
+
转化为ag单质，使其失去氧化性，导致荧光产物dap不能产生。根据腐胺浓度和显色强度的关系以及根据dap在560 nm处的黄色荧光与aie在437 nm处的蓝色荧光建立起一种比色和比率荧光双模式快速测定腐胺的方法，并成功用于实际样品的检测，方法检出限低至1.3 mg/ml。本发明方法的构建对食品中的腐胺的浓度快速准确的检测具有极其重要的意义。
附图说明
17.图1为aie荧光纳米粒子的tem图。
18.图2为aie荧光纳米粒子的紫外光谱图（左侧）和荧光光谱图（右侧）。
19.图3为紫外分光光度计测量的 (1) opd, (2) ag
+ + opd, (3) ag
+ + rma + opd, (4) ag
+ + rma + 腐胺 + opd, (5) ag
+ + rma + 腐胺 + aie + opd 组合的紫外光谱图，对本发明技术方案的可行性进行验证。
20.图4为ag
+-rma-腐胺-aie-opd反应的时间优化。
21.图5为ag
+-rma-腐胺-aie-opd反应各个反应条件的优化。分别（a）对应的是ag
+
浓度优化；（b）对应的是温度优化；（c）对应的是rma浓度优化；（d）对应的是aie浓度优化；(e)对应的是aie浓度荧光法优化；（f）对应的是用水和不同ph的醋酸醋酸钠缓冲液的反应对比。
22.图6为不同浓度的腐胺的吸光度和荧光光谱。
23.图7为比色法和比率荧光法的对腐胺浓度在0-250 mg/ml的标准曲线。
具体实施方式
24.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。请参阅图1-7。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比率、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比率关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
25.实施例1： 一种aie荧光纳米粒子的制备方法称取2.0 mg dspe-peg2000-ome、0.5 mg tpe 溶解于1.5 ml二氯甲烷中置于棕色瓶中，再加入1.5 ml超纯水，超声五分钟使其充分混合，置于磁力搅拌器上搅拌过夜后，利用高压旋转蒸发仪去除有机溶剂二氯甲烷，之后转移到10.0 kd的超滤管中4000 rpm 离心5 min，用超纯水洗涤三次，得到aie荧光纳米粒子溶液，浓度通过其在270 nm处的峰值进行定量。
26.本发明制备得到的aie荧光纳米粒子是是同时具有纳米材料和荧光特性的一种材料。参见图1，本发明aie荧光纳米粒子通过tem可以很清楚的观察到其的纳米结构，其尺寸在6.0 nm左右，表明其具有纳米级尺寸。
27.参见图2，显示了aie荧光纳米材料在250-700 nm处的紫外光谱图和390-700 nm处
nm和437 nm处的比值f
560 nm
/f
437 nm (e)，可发现其在440 nm处的吸收峰值在加入aie之后会发生增强，但不会随着aie的浓度发生变化，通过比值f
560 nm
/f
437 nm
可以发现，其在0.32 mmol/l之后变化趋于平缓，所以我们选取0.32 mmol/l作为反应中aie浓度的最佳浓度；(f)显示了ag
+ (50.0 mg/ml) + rma (0.3 mg/ml) + 腐胺 (250 mg/ml) + aie (0.32 mmol/l) + opd (10 mmol/l)在d.i. h2o中或不同ph的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中在室温下反应10 min后分别在440 nm处的吸收峰值，可以发现该反应体系在d.i. h2o中抑制反应达到最佳，所以我们选取d.i. h2o作为反应溶液。
实施例3：一种基于aie脂质体比色-荧光双模态检测腐胺残留检测方法的构建
32.将10 ml浓度为1 mg/ml的ag
+
溶液，6 ml浓度为10 mg/ml的rma和10 ml不同浓度的腐胺溶液加入到144 ml的超纯水中，再加入10 ml浓度为6.4 mmol/l的aie荧光纳米粒子溶液和20 ml浓度为100 mm的opd溶液中，将混合物反应10 min，用紫外分光光度计测量其440 nm处吸光度值以及用荧光分光光度计测量其在365 nm波长激发下的荧光光谱，记录560 nm和437 nm处的比值为f1=f
560 nm
/f
437 nm
；参见图6-图7和表1，在440 nm处吸收强度变化值与腐胺浓度在8.4-250 mg/ml之间存在良好的线性关系，回归方程为δa
0-a=0.0017c+0.0068，相关系数为0.9984，检测限为2.8 mg/ml；其拟合过程为：将向体系加入0-500 mg/ml腐胺后体系在440 nm处的吸光度变化值与对应加入的腐胺浓度导入origin软件，通过拟合操作得到加入0-500 mg/ml的腐胺和对应的吸光度变化值的线性方程δa
0-a = 0.0017c
putrescine
+0.0068，相关系数为0.9984，检出限是通过3σ/k得出的，其中σ是11次ag
+-rma-opd-aie体系不加入腐胺时对应的溶液在440 nm处测得的吸光度值的标准偏差，k是求得的线性方程斜率。
33.荧光光谱在560 nm处与437 nm处的比值变化(f=f
560 nm
/f
437 nm
)与腐胺浓度在3.9-250 mg/ml之间存在良好的线性关系，回归方程为f=0.0055c+1.6071，相关系数为0.9970，检测限为1.3 mg/ml。其拟合过程为：将向体系加入0-500 mg/ml腐胺后体系在365 nm激发下的荧光光谱在560 nm处与437 nm处的比值变化与对应加入的腐胺浓度导入origin软件，通过拟合操作得到加入0-500 mg/ml的腐胺和对应的吸光度变化值的线性方程f=0.0055c
putrescine
+1.6071，相关系数为0.9984，检出限是通过3σ/k得出的，其中σ是11次ag
+-rma-opd-aie体系不加入腐胺时对应的溶液在365 nm激发下的荧光光谱在560 nm处与437 nm处的比值变化的标准偏差，k是求得的线性方程斜率。
34.表 1 实施例6中不同浓度的腐胺测试数值腐胺浓度/（mg/ml）吸收峰值（a）δa
0-af
560nm
/f
437nm
01.31201.606101.2810.0311.588251.2640.0481.439501.2210.0911.358751.1670.1451.1881001.1380.17409871501.0360.2760.7852000.9530.3590.506
2500.8740.4390.2275000.8670.4450.226
实施例4 样品中腐胺的检测
35.（1）检测样品预处理使用豆干作为残留腐胺的食品样品，检测样品在进行检测前，用刀切碎，以超纯水溶解后，以用孔径0.22 μm滤纸或滤膜过滤，收集滤液，待检测。
36.(2) 检测样品测定检测样品在440 nm处吸光度值a。
37.移取ag
+
和rma溶液与一容器中，加入溶于超纯水中的待检测样品，加入aie荧光纳米粒子溶液和opd溶液，混合均匀后移至比色皿中，用紫外分光光度计测量440 nm处吸光度值，及为吸光度值a1；并测定ag
+-rma-opd-aie体系不加入腐胺时对应的溶液在440 nm处的吸光度值，记为吸光度值a0；计算得到δa
0-a1；测定待检测样品在365 nm波长激发下的荧光光谱移取ag
+
和rma溶液与一容器中，加入溶于超纯水中的待检测样品，加入aie和opd溶液，混合均匀后移至比色皿中，用荧光分光光度计测量在365 nm波长激发下的荧光光谱，记录560 nm处与437 nm处的比值为f1=f
560 nm
/f
437 nm
；(3) 计算豆干样品中的腐胺浓度将检测计算值δa
0-a1、f1带入吸光度回归方程δa
0-a=0.0017c
putrescine
+0.0068，荧光光谱回归方程f=0.0055c
putrescine
+1.6071。得出检测样品中腐胺浓度c
putrescine
的数值即为腐胺残留数值，通过吸光度回归方程可得出其腐胺残留数值为8.6 mg/ml，通过荧光光谱回归方程可得出其腐胺残留数值为8.4 mg/ml。
38.以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

技术特征：
1.一种aie荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将dspe-peg2000-ome、tpe溶解于二氯甲烷，充分混合后，置于磁力搅拌器上搅拌过夜；去除反应物中有机溶剂二氯甲烷，超滤离心、超纯水洗涤即得。2.一种aie荧光纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）称取2.0 mg dspe-peg2000-ome、0.5 mg tpe 溶解于250 ml二氯甲烷中置于棕色瓶中，再加入1.5 ml超纯水，超声5min 使其充分混合，置于磁力搅拌器上搅拌过夜；（2）利用高压旋转蒸发仪去除有机溶剂二氯甲烷，之后转移到10.0 kd的超滤管中4000 rpm 离心5 min，用超纯水洗涤三次，得到aie荧光纳米粒子溶液。3.根据权利要求1-2任一所述方法制备的aie荧光纳米粒子。4. 一种基于aie脂质体比色-荧光双模态检测样品中腐胺的方法，其特征在于，所述方法包括：s1：测定不同浓度的标准品紫外吸收光度值移取硝酸银溶液和单乙酸间苯二酚酯（rma）溶液于一容器中，加入溶于水中的不同浓度的腐胺标准品，然后加入aie荧光纳米粒子溶液和opd溶液，混合均匀后移至比色皿中，用紫外分光光度计测量440 nm处吸光度值，记录腐胺样品浓度为0时的吸光度值为a0，其他腐胺样品浓度的吸光度值为a1，计算得到δa
0-a1；s2: 测定不同浓度标准品在365 nm波长激发下的荧光光谱移取硝酸银溶液和rma溶液于一容器中，加入溶于水中的不同浓度的待检腐胺样品，然后加入aie荧光纳米粒子溶液和opd溶液，混合均匀后移至比色皿中，用荧光分光光度计测量在365 nm波长激发下的荧光光谱，记录560 nm处与437 nm处的比值为f1=f
560 nm
/f
437 nm
；s3：构建标准曲线方程基于紫外分光光度计测试计算得到的δa
0-a1值与腐胺标准品的浓度c
putrescine 构建线性方程，紫外分光光度计回归方程为δa
0-a1＝ac
putrescine + b；基于荧光分光光度计测试计算得到的f值与腐胺标准品的浓度c
putrescine 构建线性方程，紫外分光光度计回归方程为f＝ac
putrescine + b；s4：待测样品检测从待测的含有污染物的样品代替腐胺标准品进行紫外分光光度测试计算δa
0-a1，荧光分光光度计测试计算f1值，将获得的δa
0-a1值和f1值带入相应的标准曲线方程，计算获得相应的待测样品的腐胺浓度值。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s1和s2中ag
+
的浓度为50.0 mg/ml；rma的浓度为 0.3 mg/ml；aie荧光纳米粒子溶液的浓度为0.32 mmol/l；opd溶液的浓度为10 mmol/l；缓冲液用的是d.i. h2o；ag
+
溶液、rma乙醇溶液、aie荧光纳米粒子溶液、opd溶液与d.i. h2o之间的体积比为：10：6：10：20：154。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s1和s2中样品混合均匀后反应10 min，然后再移至比色皿中进行检测。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，紫外分光光度计回归方程为δa
0-a＝ 0.0017c
putrescine + 0.0068；荧光分光光度计回归方程为f =
ꢀ‑
0.0055c
putrescine + 1.6071。8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，待测样品为环境或食品样品；优选的待测样品为检测液体样品；样品在检测前用孔径0.22 μm滤纸或滤膜过滤，收集滤液。
9.一种基于aie脂质体比色-荧光双模态检测样品中腐胺的试剂，其特征在于，所述试剂中包括权利要求1-2任一所述方法制备的aie荧光纳米粒子。10. 一种基于aie脂质体比色-荧光双模态检测样品中腐胺的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括aie荧光纳米粒子、ag
+
溶液、rma乙醇溶液、opd溶液、d.i. h2o。

技术总结
本发明属于食品污染物检测技术领域，具体的，本发明涉及一种AIE荧光纳米粒子及其在基于AIE脂质体比色-荧光双模态检测腐胺中的应用。本发明首先利用DSPE-PEG-2000包裹四苯基乙烯（TPE）得到的AIE脂质体荧光纳米粒子，其可以在365 nm激发下产生蓝色荧光。其次，本发明利用腐胺溶液所具有的碱性特征促进单乙酸间苯二酚酯（RMA）水解成为间苯二酚，间苯二酚进一步还原Ag


技术研发人员：沈益忠 高翔 聂鹏 郑志 聂超 吴国建
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/13