一种长期稳定的免疫比浊试剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及免疫比浊技术领域，尤其涉及一种长期稳定的免疫比浊试剂及其制备方法。


背景技术：

2.免疫比浊法(turbidimetric inhibition immuno assay)是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。
3.抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个b淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体(monoclonalantibody)。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一种抗原决定簇，也可刺激机体产生igg、igm、iga、ige和igd等五类抗体。抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗血清(antiserum)是一种含有多克隆抗体的血清。
4.免疫比浊法试剂主要原材料为多克隆抗体或多克隆抗血清，无论羊，还是兔多抗或抗血清，均包含有很多的纤维蛋白，脂类，糖蛋白和抗体。脂类或者其他杂蛋白会明显影响试剂的长期稳定性，加速或长期储存会产生明显的沉淀，影响试剂的外观及分析性能。为有效解决普通免疫比浊试剂中多克隆抗体或抗血清的影响，本发明从试剂的组分和制备方法上着手来维持免疫比浊试剂的稳定性。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
6.第一方面，提供一种长期稳定的免疫比浊试剂，包括试剂r1和试剂r2；
7.所述的试剂r1包括如下浓度的组分：
8.缓冲液50-200mm，无机盐1-8wt％，促凝剂10-20g/l，防腐剂1-5wt
‰
；
9.所述的试剂r2包括如下浓度的组分：
10.缓冲液50-200mm，蛋白保护剂1-5g/l，防腐剂1-5g/l，无机盐1-8g/l，表面活性剂0.5-4wt
‰
，促凝剂5-40g/l，抗体或抗血清50-500ml/l。
11.进一步的，所述促凝剂为peg2000-20000中的至少一种；所述的表面活性剂的hlb值为10-18。
12.进一步的，所述的表面活性剂选自吐温20、聚乙二醇十六烷基醚(briji58)中的至
少一种；所述的缓冲液选自pbs缓冲液、mops缓冲液、tris-hcl缓冲液、柠檬酸、mopso缓冲液中的至少一种；所述的防腐剂选自叠氮钠、proclin300中的至少一种；所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾中的至少一种；所述的蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白钠中的至少一种。
13.进一步的，所述长期稳定的免疫比浊试剂为尿微量白蛋白检测试剂。
14.进一步的，所述抗体为羊抗人白蛋白抗体。
15.进一步的，所述试剂r1的ph为6.0-8.0；所述试剂r2的ph为6.0-8.0。
16.优选的，所述试剂r1的ph为6.0-7.0；所述试剂r2的ph为6.0-7.0。
17.第二方面，提供一种如第一方面所述的长期稳定的免疫比浊试剂的制备方法，所述制备方法包括：
18.试剂r1的制备：将缓冲液、无机盐、促凝剂、防腐剂加入至超纯水中搅拌至溶解完全，调节ph为6.0-8.0即得；
19.试剂r2的制备：
20.s1.将缓冲液、蛋白保护剂、防腐剂、无机盐、表面活性剂、促凝剂加入至超纯水溶剂中搅拌至溶解完全，调节ph为6.0-8.0；
21.s2.将抗体或抗血清与步骤s1制备得到的混合溶液进行混合，搅拌混匀1-1.5h；
22.s3.在2-8℃的条件下静置3-10天，采用0.2-1.0μm的过滤器进行过滤，即得试剂r2。
23.优选的，步骤s2中，抗体或抗血清与步骤s1制备得到的混合溶液的体积比为1：(1-1.5)。
24.进一步的，所述的过滤器的过滤精度为0.3-0.5μm。
25.优选的，所述的过滤器的过滤精度为0.45μm。
26.进一步的，所述抗体为羊抗人白蛋白抗体。
27.进一步的，所述长期稳定的免疫比浊试剂为尿微量白蛋白检测试剂。
28.本发明通过peg2000-20000大分子进行蛋白的预沉淀，搭配特定尺寸的滤膜使用，去除试剂中的杂蛋白。聚乙二醇是非离子型的水溶性聚合物，在特定的用量情况下，不会影响抗体的性能。并在免疫比浊试剂中加入特定比例的聚乙二醇和hlb值为10
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18的表面活性剂的组合搭配，可有效分散试剂中抗体及蛋白，进一步提升试剂的稳定性。
具体实施方式
29.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
31.还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
32.还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
33.为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进一步介绍和说明。
34.本发明中所述的长期稳定是指在试剂制备完成后18个月内测试值与靶值的相对偏差控制在10％以内。
35.长期稳定的免疫比浊试剂
36.包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分。
37.所述的试剂r1包括如下浓度的组分：
38.缓冲液50-200mm，无机盐1-8wt％，促凝剂10-20g/l，防腐剂1-5wt
‰
，超纯水余量；
39.所述的试剂r2包括如下浓度的组分：
40.缓冲液50-200mm，蛋白保护剂1-5g/l，防腐剂1-5g/l，无机盐1-8g/l，表面活性剂0.5-4wt
‰
，促凝剂5-40g/l，抗体或抗血清50-500ml/l，超纯水余量。
41.其中，试剂r1与试剂r2中，促凝剂均为peg2000-20000中的至少一种，缓冲液均选自pbs缓冲液、mops缓冲液、tris-hcl缓冲液、柠檬酸、mopso缓冲液中的至少一种，防腐剂均选自叠氮钠、proclin300中的至少一种，无机盐均选自氯化钠、氯化钾中的至少一种。试剂r2中的蛋白保护剂为牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白钠中的至少一种，表面活性剂的hlb值为10-18，表面活性剂选自吐温20、聚乙二醇十六烷基醚(briji58)中的至少一种。试剂r1与试剂r2的ph为6.0-8.0。
42.长期稳定的免疫比浊试剂的制备方法：
43.(1)试剂r1的制备：
44.将缓冲液、无机盐、促凝剂、防腐剂加入至超纯水中搅拌至溶解完全，调节ph为6.0-8.0即得，放于2-8℃保存；
45.(2)试剂r2的制备：
46.s1.将缓冲液、蛋白保护剂、防腐剂、无机盐、表面活性剂、促凝剂加入至超纯水溶剂中搅拌至溶解完全，调节ph为6.0-8.0；
47.s2.将抗体或抗血清与步骤s1制备得到的混合溶液按照1：(1-1.5)的体积比进行混合，用搅拌桨或磁力搅拌器搅拌混匀1-1.5h；
48.s3.在2-8℃的条件下静置3-10天，采用0.2-1.0μm的过滤器进行过滤，即得试剂r2。
49.实施例1
50.本实施例为长期稳定的免疫比浊试剂(检测尿微量白蛋白)的制备方法，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分。
51.1.试剂r1的制备
52.按照下述浓度组分配方进行配置，搅拌至溶解完全，调节ph为6.5即得，放于2-8℃保存。
53.mopso缓冲液：100mm；
54.nacl：2wt％；
55.peg-6000：20g/l；
56.proclin300：1wt
‰
；
57.溶剂：超纯水(余量)。
58.2.试剂r2的制备
59.s1.将mopso缓冲液、bsa(牛血清白蛋白)、proclin300、nacl、吐温20、peg-6000加入至超纯水溶剂中搅拌至溶解完全，调节ph为6.5；
60.s2.将羊抗人白蛋白抗体与步骤s1制备得到的混合溶液按照1：1的体积比进行混合，用搅拌桨或磁力搅拌器搅拌混匀1h；
61.s3.在5℃条件下静置7天，采用0.45μm的过滤器过滤，即得试剂r2。
62.所得的试剂r2中包括以下浓度组分：
63.mopso缓冲液：100mm；
64.nacl：2g/l；
65.bsa(牛血清白蛋白)：2g/l；
66.proclin300：1g/l；
67.peg-6000：40g/l；
68.吐温20：2wt
‰
；
69.羊抗人白蛋白抗体：500ml/l；
70.溶剂：超纯水(余量)。
71.对比例1
72.免疫比浊试剂(检测尿微量白蛋白)的制备方法，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分。
73.1.试剂r1的制备
74.按照下述浓度组分配方进行配置，搅拌至溶解完全，调节ph为6.5即得，放于2-8℃保存。
75.mopso缓冲液：100mm；
76.nacl：2wt％；
77.peg-6000：20g/l；
78.proclin300：1wt
‰
；
79.溶剂：超纯水(余量)。
80.2.试剂r2的制备
81.s1.将mopso缓冲液、bsa(牛血清白蛋白)、proclin300、nacl、吐温20加入至超纯水溶剂中搅拌至溶解完全，调节ph为6.5；
82.s2.将羊抗人白蛋白抗体与步骤s1制备得到的混合溶液按照1：1的体积比进行混合，用搅拌桨或磁力搅拌器搅拌混匀1h；
83.s3.在5℃条件下静置7天，采用0.45μm的过滤器过滤，即得试剂r2。
84.所得的试剂r2中包括以下浓度组分：
85.mopso缓冲液：100mm；
86.nacl：2g/l；
87.bsa(牛血清白蛋白)：2g/l；
88.proclin300：1g/l；
89.吐温20：2wt
‰
；
90.羊抗人白蛋白抗体：500ml/l；
91.溶剂：超纯水(余量)。
92.对比例2
93.免疫比浊试剂(检测尿微量白蛋白)的制备方法，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分。
94.1.试剂r1的制备
95.按照下述浓度组分配方进行配置，搅拌至溶解完全，调节ph为6.5即得，放于2-8℃保存。
96.mopso缓冲液：100mm；
97.nacl：2wt％；
98.peg-6000：20g/l；
99.proclin300：1wt
‰
；
100.溶剂：超纯水(余量)。
101.2.试剂r2的制备
102.s1.将mopso缓冲液、bsa(牛血清白蛋白)、proclin300、nacl、peg-6000加入至超纯水溶剂中搅拌至溶解完全，调节ph为6.5；
103.s2.将羊抗人白蛋白抗体与步骤s1制备得到的混合溶液按照1：1的体积比进行混合，用搅拌桨或磁力搅拌器搅拌混匀1h；
104.s3.在5℃条件下静置7天，采用0.45μm的过滤器过滤，即得试剂r2。
105.所得的试剂r2中包括以下浓度组分：
106.mopso缓冲液：100mm；
107.nacl：2g/l；
108.bsa(牛血清白蛋白)：2g/l；
109.proclin300：1g/l；
110.peg-6000：40g/l；
111.羊抗人白蛋白抗体：500ml/l；
112.溶剂：超纯水(余量)。
113.对比例3
114.免疫比浊试剂(检测尿微量白蛋白)的制备方法，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分。
115.1.试剂r1的制备
116.按照下述浓度组分配方进行配置，搅拌至溶解完全，调节ph为6.5即得，放于2-8℃保存。
117.mopso缓冲液：100mm；
118.nacl：2wt％；
119.peg-6000：20g/l；
120.proclin300：1wt
‰
；
121.溶剂：超纯水(余量)。
122.2.试剂r2的制备
123.s1.将mopso缓冲液、bsa(牛血清白蛋白)、proclin300、nacl加入至超纯水溶剂中搅拌至溶解完全，调节ph为6.5；
124.s2.将羊抗人白蛋白抗体与步骤s1制备得到的混合溶液按照1：1的体积比进行混合，用搅拌桨或磁力搅拌器搅拌混匀1h；
125.s3.在5℃条件下静置7天，采用0.45μm的过滤器过滤，即得试剂r2。
126.所得的试剂r2中包括以下浓度组分：
127.mopso缓冲液：100mm；
128.nacl：2g/l；
129.bsa(牛血清白蛋白)：2g/l；
130.proclin300：1g/l；
131.羊抗人白蛋白抗体：500ml/l；
132.溶剂：超纯水(余量)。
133.对比例4
134.对比例4与实施例1相比，区别之处在于免疫比浊试剂(检测尿微量白蛋白)的试剂r2中选用的促凝剂为peg-1000，其余条件均相同。
135.对比例5
136.对比例5与实施例1相比，区别之处在于免疫比浊试剂(检测尿微量白蛋白)的试剂r2中选用的促凝剂为peg-30000，其余条件均相同。
137.对比例6
138.对比例6与实施例1相比，区别之处在于免疫比浊试剂(检测尿微量白蛋白)的试剂r2中选用的表面活性剂为二乙二醇脂肪酸酯(hlb值小于10)，其余条件均相同。
139.对比例7
140.对比例7与实施例1相比，区别之处在于免疫比浊试剂(检测尿微量白蛋白)的试剂r2中选用的表面活性剂为聚氧乙烯单硬脂酸酯(hlb值大于18)，其余条件均相同。
141.长期稳定的免疫比浊试剂的使用方法
142.本实施例中，采用全自动生化分析仪(au680)配合本发明的免疫比浊试剂进行样本检测，具体步骤如下：
143.1.仪器参数设置：
144.全自动生化分析仪的参数设置如表1所示：
145.表1全自动生化分析仪的参数设置
[0146][0147]
2.样品加入方式及测定方案
[0148]
样品加入方式及测定方案如表2所示：
[0149]
表2样品加入方式及测定方案
[0150][0151]
3.计算
[0152]
使用多点非线性/半对数校准模式，以样条函数为计算模式，根据校准品的值与吸光度变化值作剂量/响应曲线，样品中目标检测物的含量可根据其吸光度变化值在剂量/响应曲线上计算出，空白品作为本底会去除，也是试剂正常与否的参考。
[0153]
4.检测原理：本试剂采用免疫比浊法测定人体内标志物的含量。样本中的标志物与试剂中的多克隆抗体结合，使相邻的抗体彼此交联，发生凝集反应产生浊度变化，该浊度的与样本中标志物的含量成正比，可通过测定特定波长处吸光度计算出样本中标志物的含量，根据工作曲线可以检测出样本中标志物的含量。
[0154]
性能测试
[0155]
1.长期稳定性测试
[0156]
选取低值样本和高值样本，使用试剂对样本进行测试，每个测值设10次重复，分别按时间0、3、6、9、12、15、18个月进行测定，通过全自动生化分析仪(au680)读取信号，读取数值，数值表示吸光度变化，吸光度值与靶值存在一定的线性关系，通过吸光度变化可以换算出样品浓度测试值。。其中，测值1为靶值0mg/l、测值2为靶值30mg/l、测值3为靶值60mg/l、测值4为靶值150mg/l、测值5为靶值300mg/l、测值6为靶值600mg/l。
[0157]
使用实施例1和对比例1-7的免疫比浊试剂对尿微量白蛋白进行测试，测试结果如下表3-10所示：
[0158]
表3实施例1的免疫比浊试剂稳定性测试结果
[0159][0160]
表4对比例1的免疫比浊试剂稳定性测试结果
[0161]
[0162][0163]
表5对比例2的免疫比浊试剂稳定性测试结果
[0164]
[0165][0166]
表6对比例3的免疫比浊试剂稳定性测试结果
[0167][0168]
表7对比例4的免疫比浊试剂稳定性测试结果
[0169][0170]
表8对比例5的免疫比浊试剂稳定性测试结果
[0171]
[0172][0173]
表9对比例6的免疫比浊试剂稳定性测试结果
[0174][0175][0176]
表10对比例7的免疫比浊试剂稳定性测试结果
[0177][0178]
由表3-10的测试结果可知，采用本发明实施例1的组分制备而成的免疫比浊试剂随着时间的增加，其空白检测即校准品检测的吸光度数值变化不大，因此试剂的稳定性较好。而缺少聚乙二醇组分(对比例1)或缺少表面活性剂组分(对比例2)或缺少聚乙二醇和表面活性剂组分(对比例3)或聚乙二醇组分不在本发明范围内(对比例4、对比例5)或表面活性剂组分不在本发明范围内(对比例6、对比例7)制备而成的免疫比浊试剂随着时间的增加，其空白检测即校准品检测的吸光度样本数值变化较大，试剂稳定性显著劣于实施例1对应的检测试剂。
[0179]
2.试剂质控测试
[0180]
使用试剂对两组水平质控品进行测试，分别按时间0、3、6、9、12、15、18个月进行测定，通过全自动生化分析仪(au680)读取信号，计算测定值和靶值的相对偏差，相对偏差控制在
±
10％以内说明测定结果正常，超过10％不合格。水平质控品ⅰ：靶值为25mg/l；水平质控品ⅱ：靶值为100mg/l。对实施例1、对比例1-3的免疫比浊试剂进行试剂质控测试，测试结果如下表11-12所示。
[0181]
水平质控品ⅰ(靶值：25mg/l)的测定结果如下表11所示：
[0182]
表11水平质控品ⅰ(靶值：25mg/l)测定结果
[0183][0184]
由表11测试结果可知，采用本发明实施例制备而成的免疫比浊试剂随着时间的推移，从0个月到18个月的测定结果的偏差较小(10％以内)，即测定结果正常。而缺少聚乙二醇组分(对比例1)或缺少表面活性剂组分(对比例2)或缺少聚乙二醇和表面活性剂组分(对比例3)制备而成的免疫比浊试剂在15个月的偏差值均超过10％，说明试剂不合格。
[0185]
水平质控品ⅱ(靶值：100mg/l)的测定结果如下表12所示：
[0186]
表12水平质控品ⅱ(靶值：100mg/l)测定结果
[0187]
[0188]
由表12测试结果可知，采用本发明实施例制备而成的免疫比浊试剂随着时间的推移，从0个月到18个月的测定结果的偏差较小(10％以内)，即测定结果正常。而缺少聚乙二醇组分(对比例1)或缺少表面活性剂组分(对比例2)或缺少聚乙二醇和表面活性剂组分(对比例3)制备而成的免疫比浊试剂在15个月的偏差值均超过10％，说明试剂不合格。
[0189]
综上所述，本发明的长期稳定的免疫比浊试剂及其制备方法具体以下有益效果：
[0190]
(1)采用peg沉淀，离心和表面活性剂的配合使用，能够有效的保障免疫比浊试剂的稳定性。
[0191]
(2)该方法可用于羊/兔多抗免疫比浊项目，有效保证试剂的稳定性。
[0192]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种长期稳定的免疫比浊试剂，其特征在于，包括试剂r1和试剂r2；所述的试剂r1包括如下浓度的组分：缓冲液50-200mm，无机盐1-8wt％，促凝剂10-20g/l，防腐剂1-5wt
‰
；所述的试剂r2包括如下浓度的组分：缓冲液50-200mm，蛋白保护剂1-5g/l，防腐剂1-5g/l，无机盐1-8g/l，表面活性剂0.5-4wt
‰
，促凝剂5-40g/l，抗体或抗血清50-500ml/l。2.根据权利要求1所述的长期稳定的免疫比浊试剂，其特征在于，所述促凝剂为peg2000-20000中的至少一种；所述的表面活性剂的hlb值为10-18。3.根据权利要求2所述的长期稳定的免疫比浊试剂，其特征在于，所述的表面活性剂选自吐温20、聚乙二醇十六烷基醚中的至少一种；所述的缓冲液选自pbs缓冲液、mops缓冲液、tris-hcl缓冲液、柠檬酸、mopso缓冲液中的至少一种；所述的防腐剂选自叠氮钠、proclin300中的至少一种；所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾中的至少一种；所述的蛋白保护剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白钠中的至少一种。4.根据权利要求1-3任意一项所述的长期稳定的免疫比浊试剂，其特征在于，所述长期稳定的免疫比浊试剂为尿微量白蛋白检测试剂。5.根据权利要求4所述的长期稳定的免疫比浊试剂，其特征在于，所述抗体为羊抗人白蛋白抗体。6.根据权利要求5所述的长期稳定的免疫比浊试剂，其特征在于，所述试剂r1的ph为6.0-8.0；所述试剂r2的ph为6.0-8.0。7.一种如权利要求1-3任意一项所述的长期稳定的免疫比浊试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：试剂r1的制备：将缓冲液、无机盐、促凝剂、防腐剂加入至超纯水中搅拌至溶解完全，调节ph为6.0-8.0即得；试剂r2的制备：s1.将缓冲液、蛋白保护剂、防腐剂、无机盐、表面活性剂、促凝剂加入至超纯水溶剂中搅拌至溶解完全，调节ph为6.0-8.0；s2.将抗体或抗血清与步骤s1制备得到的混合溶液进行混合，搅拌混匀1-1.5h；s3.在2-8℃的条件下静置3-10天，采用0.2-1.0μm的过滤器进行过滤，即得试剂r2。8.根据权利要求7所述的长期稳定的免疫比浊试剂的制备方法，其特征在于，所述的过滤器的过滤精度为0.3-0.5μm。9.根据权利要求8所述的长期稳定的免疫比浊试剂的制备方法，其特征在于，所述抗体为羊抗人白蛋白抗体。10.根据权利要求9所述的长期稳定的免疫比浊试剂的制备方法，其特征在于，所述长期稳定的免疫比浊试剂为尿微量白蛋白检测试剂。

技术总结
本发明公开了一种长期稳定的免疫比浊试剂及其制备方法，涉及免疫比浊技术领域。本发明提供一种长期稳定的免疫比浊试剂，包括试剂R1和试剂R2；所述的试剂R1包括如下浓度的组分：缓冲液50-200mM，无机盐1-8wt％，促凝剂10-20g/L，防腐剂1-5wt


技术研发人员：李云 伍鑫 刘雨薇
受保护的技术使用者：中元汇吉生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/8/13