一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法与流程

1.本发明涉及技术领域，具体涉及一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cell,mscs)是具有高度自我更新能力、多向分化潜能的成体干细胞，起源于中胚层，最早在骨髓中发现，主要存在于结缔组织和器官间质中，在适合的诱导条件下能分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪组织等。
3.胎盘(placenta)是胎儿与母体之间物质交换的重要组织器官，由内至外分为羊膜层，绒毛膜层及蜕膜层，其中羊膜层是间充质干细胞重要来源之一。羊膜来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。
4.羊膜(amniotic membrane)位于胎盘儿体面的最内层，无血管、神经和淋巴管分布，从内至外分别为：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。其中羊膜间充质干细胞存在于致密层等皮下层中。
5.目前，分离提取人羊膜间充质干细胞的常用方法是：两步酶消化法和组织块贴壁培养法。两步酶消化法是利用胰酶与胶原酶组合消化组织，分离获得单个细胞进行培养；组织块贴壁培养法是通过组织附着在培养器皿中，待细胞自行爬出后进行贴壁生长。
6.1)两步酶消化法的消化时间长，化学试剂对细胞伤害大，导致细胞形态较差，质量偏低，同时试剂成本高，不利于大规模分离培养；
7.2)组织块贴壁培养法的细胞爬出贴壁时间较长，培养过程中所收获的原代细胞数量少且纯度低，需多次纯化。
8.因此，所属领域技术人员仍需要进一步改进分离提取人羊膜间充质干细胞方法的必要性。


技术实现要素：

9.本发明的目的是提供一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，用以解决传统方法的细胞培养周期过长，增殖速度过慢的问题，本发明将结合并优化两种方法以培养优质细胞。
10.本发明是采用以下的技术方案来实现的。
11.一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，包括以下工艺步骤：
12.1)清理
13.胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用止血钳取出胎盘至无菌托盘中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水冲洗胎盘表面，去除残留的血液与其他杂物；
14.2)剥离
15.用钩镊从胎盘上剥取羊膜平铺于10cm培养皿中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水将其清洗至半透明状，再剪成大小为3～4cm2的组织块；
16.3)消化
17.将羊膜块转入150ml储液瓶中，加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶后放入37℃、200rpm/min恒温摇床中消化30min于1200rpm/min离心5min并弃上清；再次加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶在相同条件下消化30min，两次消化过程中每隔10min取出储液瓶观察并剧烈摇晃，使羊膜块充分接触液体；此操作目的是消化上皮细胞等杂细胞，提高细胞纯度且有利于羊膜间充质干细胞爬出。
18.4)除杂
19.将消化好的组织混合液用70μm细胞筛网过滤，弃滤液，取出网中组织放置于10cm培养皿中，用生理盐水漂洗2次后用直剪剪碎成0.3cm2左右的组织块。
20.5)贴壁培养
21.将剪碎后组织块平铺于10cm培养皿中，倒置培养1～2h至组织紧贴培养皿后，正置培养皿并加入5ml培养基(友康胎盘间充质干细胞培养基，货号：nc0103)在37℃，5％co2培养箱中培养，每2天换液1次。
22.6)差速消化与传代
23.所述组织原代分离培养间充质干细胞汇合度达85％后弃掉培养液，加入5ml pbs(pbs缓冲液(1x)，货号：pbs-10001)清洗培养皿后吸出，缓慢加入1ml的0.25％胰蛋白酶消化细胞2分钟后吸出细胞悬液至50ml离心管终止消化(无需冲洗培养皿底部细胞)，1200rpm/min离心5min，弃上清，加入20ml友康培养基吹打均匀，接种至t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养；此操作的特点是利用消化时间差，使收集到的羊膜间充质干细胞纯度更高。
24.7)除杂与细胞二次爬出
25.向步骤6)中含有贴壁羊膜组织块的培养皿中再次加入0.25％胰蛋白酶消化细胞5分钟，用移液管轻轻吹散培养皿底部细胞并弃掉，用生理盐水缓慢清洗培养皿底部2次，加入5ml友康培养基使组织二次爬出间充质干细胞，待细胞汇合度达85％时，按步骤6)差速消化细胞，接种至t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养；此操作的特点是去除初次贴壁爬出的杂细胞，同时重复利用组织块获得大量原代细胞。
26.8)大量培养
27.步骤6)与步骤7)收获的p1代细胞再次经过差速消化，接种培养后，获得p2代羊膜间充质干细胞。
28.9)传代培养
29.p2代羊膜间充质干细胞汇合度达85％后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆未脱落时，用移液管冲洗t182培养瓶底部收集细胞终止消化后于1200rpm/min离心5min，将细胞沉淀用培养液重悬接种培养后，获得p3代间充质干细胞。待p3代间充质干细胞汇合度达85％后，收集p3代细胞。
30.优选地，上述从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，步骤6)中，以3000cells/cm2的密度接种至7个t182培养瓶中，每瓶加入20ml友康培养基以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p1代羊膜间充质干细胞；
31.此步骤培养的p1代细胞为a组，将4个t182培养瓶依次编号为a
‑①
，a
‑②
，a
‑③
，a
‑④
，a
‑⑤
，a
‑⑥
及a
‑⑦
。
32.优选地，上述从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，步骤7)中，按步骤6)差速消化细胞，以3000cells/cm2的接种密度接种至7个t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p1代羊膜间充质干细胞；记录爬出时间以及细胞汇合度达85％时间；
33.此步骤培养的p1代细胞为b组，将7个t182培养瓶依次编号为b
‑①
，b
‑②
，b
‑③
，b
‑④
，b
‑⑤
，b
‑⑥
及b
‑⑦
。
34.优选地，上述从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，步骤8)中，以3000cells/cm2的接种密度接种至7个t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p2代羊膜间充质干细胞；
35.此步骤一次贴壁培养的p2代细胞为c组，将7个t182培养瓶依次编号为c
‑①
，c
‑②
，c
‑③
，c
‑④
，c
‑⑤
，c
‑⑥
及c
‑⑦
；
36.二次贴壁培养的p2代细胞为d组，将7个t182培养瓶依次编号为d
①
，d
‑②
，d
‑③
，d
‑④
，d
‑⑤
，d
‑⑥
及d
‑⑦
。
37.优选地，上述从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，步骤9)中，计数：
38.编号
①
的t182培养瓶于细胞接种24h后弃掉培养液，加入5ml pbs清洗培养皿后吸出，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆未脱落时，用移液管冲洗t182培养瓶底部收集细胞后终止消化，采用countstar细胞计数仪计算细胞数量。
39.之后每隔24h，按上述方法分别收集编号
②
～
⑥
的细胞进行计数。
40.借由上述技术方案，本发明的有益效果如下：
41.1)本发明结合传统方法，通过胰蛋白酶消化羊膜的上皮细胞除去杂细胞，减少两步酶消化法消化用时过长对原代细胞产生的损伤，同时降低使用胶原酶带来的经济成本；又能避免组织块培养法中细胞爬出用时过长，以及杂细胞过多的缺点，降低时间成本；同时二次贴壁重复利用组织块，提高原代细胞获得量。
42.2)本发明技术方案分离得到的羊膜间充质干细胞质量优，纯度高，数量多，增殖速度快。
附图说明
43.图1为实施例一中p0代羊膜间充质干细胞状态(x 40)图；
44.图2为p1代细胞增殖曲线对比图；
45.图3为p2代细胞增殖曲线对比图；
46.图4为实施例一p2代羊膜间充质干细胞状态(x 40)图；
47.图5为对照例一p0代羊膜间充质干细胞状态(x 40)图；
48.图6为对照例二剥离的羊膜组织块状态图；
49.图7为实施例三中羊膜间充质干细胞成骨分化、成脂分化及成软骨分化状态图。
具体实施方式
50.本发明的目的是提供一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，用以解
决传统方法的细胞培养周期过长，增殖速度过慢的问题，本发明将结合并优化两种方法以培养优质细胞。也就是将酶消法和组织爬出法相结合。
51.本发明提供了一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法。该方法包括：1)清理；2)剥离；3)消化；4)除杂；5)贴壁培养；6)差速消化与传代；7)除杂与二次爬出；8)大量培养；步骤6)与步骤7)收获的p1代细胞再次经过差速消化，接种培养后，获得p2代羊膜间充质干细胞；9)传代培养。本发明通过胰蛋白酶消化羊膜的上皮细胞除去杂细胞后进行组织块培养，不仅可以减少两步酶消化法消化用时过长对原代细胞产生的损伤，同时降低使用胶原酶带来的经济成本；又能避免组织块培养法中细胞爬出用时过长，以及杂细胞过多的缺点，降低时间成本；同时二次贴壁重复利用组织块，提高原代细胞获得量。
52.1)差速消化法进行纯化；
53.两步酶消化法消化用时过长对原代细胞产生损伤，本发明将取消传统酶消化法中的胶原酶消化步骤；
54.2)组织块二次贴壁法提高细胞量；
55.组织块贴壁培养法杂细胞过多，本发明将在组织附着于培养器前加入纯化步骤。
56.本发明提供了一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，具体包括以下工艺步骤：
57.1)清理
58.胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用止血钳取出胎盘至无菌托盘中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水冲洗胎盘表面，去除残留的血液与其他杂物。
59.2)剥离
60.用钩镊从胎盘上剥取羊膜平铺于10cm培养皿中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水将其清洗至半透明状，再剪成大小为3～4cm2的组织块。
61.3)消化
62.将羊膜块转入150ml储液瓶中，加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶后放入37℃、200rpm/min恒温摇床中消化30min，于1200rpm/min离心5min并弃上清；再次加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶在相同条件下消化30min，两次消化过程中每隔10min取出储液瓶观察并剧烈摇晃，使羊膜块充分接触液体；此操作目的是消化上皮细胞等杂细胞，提高细胞纯度且有利于羊膜间充质干细胞爬出。
63.4)除杂
64.将消化好的组织混合液用70μm细胞筛网过滤，弃滤液，取出网中组织放置于10cm培养皿中，用生理盐水漂洗2次后用直剪剪碎成0.3cm2左右的组织块。
65.5)贴壁培养
66.将剪碎后组织块平铺于10cm培养皿中，倒置培养1～2h至组织紧贴培养皿后，正置培养皿并加入5ml培养基(友康胎盘间充质干细胞培养基，货号：nc0103)在37℃，5％co2培养箱中培养，每2天换液1次。
67.6)差速消化与传代
68.所述组织原代分离培养间充质干细胞汇合度达85％后弃掉培养液，加入5ml pbs(pbs缓冲液(1x)，货号：pbs-10001)清洗培养皿后吸出，缓慢加入1ml的0.25％胰蛋
白酶消化细胞2分钟后吸出细胞悬液至50ml离心管终止消化(无需冲洗培养皿底部细胞)，1200rpm/min离心5min，弃上清，加入20ml友康培养基吹打均匀，接种至t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养；此操作的特点是利用消化时间差，使收集到的羊膜间充质干细胞纯度更高。
69.7)除杂与细胞二次爬出
70.向步骤6)中含有贴壁羊膜组织块的培养皿中，再次加入0.25％胰蛋白酶消化细胞5分钟，用移液管轻轻吹散培养皿底部细胞并弃掉，用生理盐水缓慢清洗培养皿底部2次，加入5ml友康培养基使组织二次爬出间充质干细胞，待细胞汇合度达85％时，按步骤6)差速消化细胞，接种至t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养；此操作的特点是去除初次贴壁爬出的杂细胞，同时重复利用组织块获得大量原代细胞。
71.8)大量培养
72.步骤6)与步骤7)收获的p1代细胞再次经过差速消化，接种培养后，获得p2代羊膜间充质干细胞。
73.9)传代培养
74.p2代羊膜间充质干细胞汇合度达85％后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆未脱落时，用移液管冲洗t182培养瓶底部收集细胞终止消化后于1200rpm/min离心5min，将细胞沉淀用培养液重悬接种培养后，获得p3代间充质干细胞。待p3代间充质干细胞汇合度达85％后，收集p3代细胞。
75.实施例一
76.本实施例提供一种羊膜间充质干细胞的分离培养方法，该分离培养方法包括如下：
77.1)清理
78.胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用止血钳取出胎盘至无菌托盘中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水冲洗胎盘表面，去除残留的血液与其他杂物。
79.2)剥离
80.用钩镊从胎盘上剥取羊膜平铺于10cm培养皿中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水将其清洗至半透明状，再剪成大小为3～4cm2的羊膜块。
81.3)消化
82.将羊膜块转入150ml储液瓶中，加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶后放入37℃、200rpm/min恒温摇床中消化30min，于1200rpm/min离心5min并弃上清；再次加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶在相同条件下消化30min，两次消化过程中每隔10min取出储液瓶观察并剧烈摇晃，使羊膜块充分接触液体。
83.4)除杂
84.将消化好的组织混合液用70μm细胞筛网过滤，弃滤液，取出网中组织放置于10cm培养皿中，用生理盐水漂洗2次后，用直剪剪碎成0.3cm2左右的组织块。
85.5)贴壁培养
86.将剪碎后组织块平铺于10cm培养皿中，倒置培养1～2h至组织紧贴培养皿，正置培养皿并加入5ml培养基(友康胎盘间充质干细胞培养基，货号：nc0103)在37℃，5％co2培养
箱中培养，每2天换液1次。记录细胞爬出及细胞汇合度达85％时间，见表1。培养4d后，可见成纤维样细胞从组织块中爬出(图1)，培养8d汇合度可达85％。
87.6)差速消化与传代
88.所述组织原代分离培养间充质干细胞汇合度达85％后弃掉培养液，加入5ml pbs(pbs缓冲液(1x)，货号：pbs-10001)清洗培养皿后吸出，缓慢加入1ml的0.25％胰蛋白酶消化细胞2分钟后吸出细胞悬液至50ml离心管终止消化(无需冲洗培养皿底部细胞)，1200rpm/min离心5min，弃上清，重悬细胞沉淀，以3000cells/cm2的密度接种至7个t182培养瓶中，每瓶加入20ml友康培养基以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p1代羊膜间充质干细胞。
89.此步骤培养的p1代细胞为a组，将4个t182培养瓶依次编号为a
‑①
，a
‑②
，a
‑③
，a
‑④
，a
‑⑤
，a
‑⑥
及a
‑⑦
。
90.7)组织块二次贴壁与传代
91.向步骤6)中含有贴壁羊膜组织块的培养皿中，再次加入0.25％胰蛋白酶消化细胞5分钟，用移液管轻轻吹散培养皿底部细胞并弃掉，用生理盐水缓慢清洗培养皿底部2次，加入5ml友康培养基使组织二次爬出间充质干细胞，待细胞融合度达85％时，按步骤6)差速消化细胞，以3000cells/cm2的接种密度接种至7个t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p1代羊膜间充质干细胞。记录爬出时间以及细胞汇合度达85％时间，见表1。
92.此步骤培养的p1代细胞为b组，将7个t182培养瓶依次编号为b
‑①
，b
‑②
，b
‑③
，b
‑④
，b
‑⑤
，b
‑⑥
及b
‑⑦
。
93.8)大量培养
94.步骤6)与步骤7)中编号
⑥
培养的p1代细胞汇合度达到85％后，再次经过差速消化，以3000cells/cm2的接种密度接种至7个t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p2代羊膜间充质干细胞。
95.此步骤一次贴壁培养的p2代细胞为c组，将7个t182培养瓶依次编号为c
‑①
，c
‑②
，c
‑③
，c
‑④
，c
‑⑤
，c
‑⑥
及c
‑⑦
；
96.二次贴壁培养的p2代细胞为d组，将7个t182培养瓶依次编号为d
①
，d
‑②
，d
‑③
，d
‑④
，d
‑⑤
，d
‑⑥
及d
‑⑦
。
97.9)计数
98.编号
①
的t182培养瓶于细胞接种24h后弃掉培养液，加入5ml pbs清洗培养皿后吸出，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆未脱落时，用移液管冲洗t182培养瓶底部收集细胞后终止消化，采用countstar细胞计数仪计算细胞数量。
99.之后每隔24h，按上述方法分别收集编号
②
～
⑥
的细胞进行计数。结果见表2与图2～4。
100.对照例一
101.本对照例使用两步酶消法对羊膜间充质干细胞进行分离培养，该分离培养方法包括如下：
102.1)清理
103.胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用止血钳取出胎盘至无菌托盘中，用
含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水冲洗胎盘表面，去除残留的血液与其他杂物。
104.2)剥离
105.用钩镊从胎盘上剥取羊膜平铺于10cm培养皿中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水将其清洗至半透明状，再剪成大小为3～4cm2的羊膜块。
106.3)胰酶消化
107.将羊膜块转入150ml储液瓶中，加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶后放入37℃、200rpm/min恒温摇床中消化30min，于1200rpm/min离心5min并弃上清；再次加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶在相同条件下消化30min，两次消化过程中每隔10min取出储液瓶观察并剧烈摇晃，使羊膜块充分接触液体。
108.4)除杂
109.将消化好的组织混合液用70μm细胞筛网过滤，弃滤液，取出网中组织放置于10cm培养皿中，用生理盐水漂洗2次后用直剪剪碎成0.3cm2左右的组织块。
110.5)胶原酶消化
111.将剪碎组织块转入150ml储液瓶中，瓶中按羊膜总体积2倍加入0.25％ii型胶原酶，将储液瓶放入37℃、200rpm/min恒温摇床中消化3h，直至组织块完全消化。
112.6)过滤离心
113.将消化好的组织混合液用70μm细胞筛网过滤后取细胞悬液加入等体积的生理盐水，1200rpm/min离心5min。
114.7)贴壁培养
115.离心后弃上清，加入5ml培养基(友康胎盘间充质干细胞培养基，货号：nc0103)重悬细胞沉淀(p0代)，接种至10cm培养皿中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，每2天换液1次。培养5d后，仅有少量成纤维样细胞贴壁，细胞纯度低(图5)。
116.8)差速消化与传代
117.所述组织原代分离培养间充质干细胞汇合度达85％后弃掉培养液，加入5ml pbs清洗培养皿后吸出，缓慢加入1ml的0.25％胰蛋白酶消化细胞2分钟后吸出细胞悬液至50ml离心管终止消化(无需冲洗培养皿底部细胞)，1200rpm/min离心5min，弃上清，重悬细胞沉淀，以3000cells/cm2的密度接种至7个t182培养瓶中，每瓶加入20ml友康培养基以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p1代羊膜间充质干细胞。
118.此步骤培养的p1代细胞为e组，将7个t182培养瓶依次编号为e
‑①
，e
‑②
，e
‑③
，e
‑④
，e
‑⑤
，e
‑⑥
及e
‑⑦
。
119.9)二次差速消化与传代
120.步骤8)e
‑⑦
培养的p1代细胞汇合度达到85％后，再次经过差速消化，以3000cells/cm2的接种密度接种至7个t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p2代羊膜间充质干细胞。
121.此步骤培养的p2代细胞为f组，将7个t182培养瓶依次编号为f
‑①
，f
‑②
，f
‑③
，f
‑④
，f
‑⑤
，f
‑⑥
及f
‑⑦
。
122.10)计数
123.编号
①
的t182培养瓶于细胞接种24h后弃掉培养液，加入5ml pbs清洗培养皿后吸
出，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆未脱落时，用移液管冲洗t182培养瓶底部收集细胞后终止消化，采用countstar细胞计数仪计算细胞数量。
124.之后每隔24h，按上述方法分别收集编号
②
～
⑥
的细胞进行计数。结果见表2与图2～3。
125.对照例二
126.本对照例使用组织爬出法对羊膜间充质干细胞进行分离培养，该分离培养方法包括如下：
127.1)清理
128.胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用止血钳取出胎盘至无菌托盘中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水冲洗胎盘表面，去除残留的血液与其他杂物。
129.2)剥离
130.用钩镊从胎盘上剥取羊膜平铺于10cm培养皿中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水将其清洗至半透明状(图6)，再用直剪剪碎成大小为0.3～0.4cm2的羊膜块。
131.3)贴壁培养
132.将剪碎后组织块平铺于10cm培养皿中，倒置培养1～2h至组织紧贴培养皿，正置培养皿并加入5ml培养基(友康胎盘间充质干细胞培养基，货号：nc0103)在37℃，5％co2培养箱中培养，每2天换液1次。记录细胞爬出及细胞汇合度达85％时间，见表1。
133.表1实施例一和对照例二中培养的羊膜间充质干细胞(p0代)细胞各生长状态对应时间
[0134][0135]
根据上述所述实施例一、对照组一与对照组二的细胞生长记录如表1所示。
[0136]
表1结果表明，二次贴壁后细胞爬出速度较一次贴壁快，经初步纯化后的组织较原始组织贴壁更快，说明本发明提供的方法充分利用组织块，有利于干细胞爬出，缩短原代细胞培养周期，同时细胞数量明显提高。
[0137]
4)差速消化与传代
[0138]
所述组织原代分离培养间充质干细胞汇合度达85％后弃掉培养液，加入5ml pbs清洗培养皿后吸出，缓慢加入1ml的0.25％胰蛋白酶消化细胞2分钟后吸出细胞悬液至50ml离心管终止消化(无需冲洗培养皿底部细胞)，1800rpm/min离心5min，弃上清，重悬细胞沉淀，以3000cells/cm2的密度接种至7个t182培养瓶中，每瓶加入20ml友康培养基以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p1代羊膜间充质干细胞。
[0139]
此步骤培养的p1代细胞为g组，将7个t182培养瓶依次编号为g
‑①
，g
‑②
，g
‑③
，g
‑④
，g
‑⑤
，g
‑⑥
及g
‑⑦
。
[0140]
5)二次差速消化与传代
[0141]
步骤4)g
‑⑦
培养的p1代细胞汇合度达到85％后，再次经过差速消化，以3000cells/cm2的接种密度接种至7个t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p2代羊膜间充质干细胞。
[0142]
此步骤培养的p2代细胞为h组，将7个t182培养瓶依次编号为h
‑①
，h
‑②
，h
‑③
，h
‑④
，h
‑⑤
，h
‑⑥
及h
‑⑦
。
[0143]
6)计数
[0144]
编号
①
的t182培养瓶于细胞接种24h后弃掉培养液，加入5ml pbs清洗培养皿后吸出，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆未脱落时，用移液管冲洗t182培养瓶底部收集细胞后终止消化，采用countstar细胞计数仪计算细胞数量。
[0145]
之后每隔24h，按上述方法分别收集编号
②
～
⑥
的细胞进行计数。结果见表2与图2～3。
[0146]
表2实施例一和对照例中培养的羊膜间充质干细胞(p1、p2代)细胞数量
[0147][0148]
根据上述所述实施例一、对照组一与对照组二的细胞生长记录如表2所示。
[0149]
以表2培养天数为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制细胞生长曲线如图2、图3所示。结果发现，一次和二次贴壁的干细胞传代时的增殖趋势相似，说明本发明在相同时间内可获取更多数量的细胞；同时本发明中干细胞的增殖速度明显快于传统方法，说明细胞质量优，培养时间更短。
[0150]
实施例二
[0151]
待实施例一的一次贴壁、实施例一的二次贴壁、对照例一和对照例二培养的p2代细胞(编号
⑦
)汇合度达到85％后，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，消化步骤中吸取足量细胞于离心管中，1200rpm/min离心5min，弃上清，加入pbs重悬细胞，调节细胞浓度为3
×
106cells/ml。
[0152]
按照细胞表面标记检测试剂盒(间充质干细胞(人)表面标记检测试剂盒，货号：huxmx-09011)，所述方法对四例细胞分别进行表面标记物的上机检测。
[0153]
通过流式细胞术分析四例羊膜间充质干细胞表面抗原cd34、cd45、cd14、cd19、hla-dr、cd73、cd29、cd105的表达情况，结果表明，四例羊膜间充质干细胞均低表达cd34、cd45、cd14、cd19、hla-dr，高表达cd73、cd29、cd105，均符合mscs的特征，如表3所示。
[0154]
表3实施例一和对照例中培养的羊膜间充质干细胞流式检测结果
[0155][0156]
实施例三
[0157]
待实施例一的一次贴壁、实施例一的二次贴壁、对照例一和对照例二培养的p2代细胞(编号
⑦
)汇合度达到85％后，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，消化步骤中吸取足量细胞于离心管中，对应成脂、成骨、成软骨三种分化方向进行多向分化潜能鉴定实验。
[0158]
将单细胞悬液以2
×
104cells/cm2的密度接种于六孔板中，使用人相关干细胞成脂诱导分化试剂盒(货号：huxxc-90031)进行成脂诱导分化实验，待观察到出现足量、大小适宜的脂滴，使用油红“o”进行染色实验。
[0159]
结果显示，四例羊膜间充质干细胞均可见被染成红色的脂肪油滴(图7
‑①
)，均具有分化成脂细胞的能力。
[0160]
将单细胞悬液以2
×
104cells/cm2的密度接种于六孔板中，使用人相关干细胞成骨诱导分化试剂盒(货号：huxxc-90021)进行成骨诱导分化实验，待观察到出现明显钙结节之后，使用茜素红进行染色实验。
[0161]
结果显示，四例羊膜间充质干细胞均可见被染成红色的钙沉积处(图7
‑②
)，均具有分化成骨细胞的能力。
[0162]
取3～4
×
105个细胞转移至15ml离心管中，使用人相关干细胞成软骨诱导分化试剂盒(货号：huxxc-90041)进行成软骨诱导分化实验，待观察到形成直径1.5～2mm的软骨球，使用阿利辛蓝进行切片染色实验。结果显示，四例羊膜间充质干细胞均可见染成蓝色的团块(图7
‑③
)，均具有分化成软骨细胞的能力。
[0163]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：1)清理胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用止血钳取出胎盘至无菌托盘中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水冲洗胎盘表面，去除残留的血液与其他杂物；2)剥离用钩镊从胎盘上剥取羊膜平铺于10cm培养皿中，用含有100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水将其清洗至半透明状，再剪成大小为3～4cm2的组织块；3)消化将羊膜块转入150ml储液瓶中，加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶后放入37℃、200rpm/min恒温摇床中消化30min，于1200rpm/min离心5min并弃上清；再次加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶，在相同条件下消化30min，两次消化过程中每隔10min取出储液瓶观察并剧烈摇晃，使羊膜块充分接触液体；4)除杂将消化好的组织混合液用70μm细胞筛网过滤，弃滤液，取出网中组织放置于10cm培养皿中，用生理盐水漂洗2次后用直剪剪碎成0.3cm2左右的组织块；5)贴壁培养将剪碎后组织块平铺于10cm培养皿中，倒置培养1～2h至组织紧贴培养皿后，正置培养皿并加入5ml培养基在37℃，5％co2培养箱中培养，每2天换液1次；6)差速消化与传代所述组织原代分离培养间充质干细胞汇合度达85％后弃掉培养液，加入5ml pbs清洗培养皿后吸出，缓慢加入1ml的0.25％胰蛋白酶消化细胞，2分钟后吸出细胞悬液至50ml离心管终止消化，1200rpm/min离心5min，弃上清，加入20ml友康培养基吹打均匀，接种至t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养；7)除杂与细胞二次爬出向步骤6)中含有贴壁羊膜组织块的培养皿中再次加入0.25％胰蛋白酶消化细胞5分钟，用移液管轻轻吹散培养皿底部细胞并弃掉，用生理盐水缓慢清洗培养皿底部2次，加入5ml友康培养基使组织二次爬出间充质干细胞，待细胞汇合度达85％时，按步骤6)差速消化细胞，接种至t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养；8)大量培养步骤6)与步骤7)收获的p1代细胞再次经过差速消化，接种培养后，获得p2代羊膜间充质干细胞；9)传代培养。2.如权利要求1所述的从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤6)中，以3000cells/cm2的密度接种至7个t182培养瓶中，每瓶加入20ml友康培养基以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p1代羊膜间充质干细胞；此步骤培养的p1代细胞为a组，将4个t182培养瓶依次编号为a
‑①
，a
‑②
，a
‑③
，a
‑④
，a
‑⑤
，a
‑⑥
及a
‑⑦
。3.如权利要求1所述的从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：
步骤7)中，按步骤6)差速消化细胞，以3000cells/cm2的接种密度接种至7个t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p1代羊膜间充质干细胞；记录爬出时间以及细胞汇合度达85％时间；此步骤培养的p1代细胞为b组，将7个t182培养瓶依次编号为b
‑①
，b
‑②
，b
‑③
，b
‑④
，b
‑⑤
，b
‑⑥
及b
‑⑦
。4.如权利要求1所述的从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤8)中，以3000cells/cm2的接种密度接种至7个t182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养，记为p2代羊膜间充质干细胞；此步骤一次贴壁培养的p2代细胞为c组，将7个t182培养瓶依次编号为c
‑①
，c
‑②
，c
‑③
，c
‑④
，c
‑⑤
，c
‑⑥
及c
‑⑦
；二次贴壁培养的p2代细胞为d组，将7个t182培养瓶依次编号为d
①
，d
‑②
，d
‑③
，d
‑④
，d
‑⑤
，d
‑⑥
及d
‑⑦
。5.如权利要求1所述的从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤9)中，计数：编号
①
的t182培养瓶于细胞接种24h后弃掉培养液，加入5ml pbs清洗培养皿后吸出，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆未脱落时，用移液管冲洗t182培养瓶底部收集细胞后终止消化，采用countstar细胞计数仪计算细胞数量。之后每隔24h，按上述方法分别收集编号
②
～
⑥
的细胞进行计数。

技术总结
本发明提供了一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法。该方法包括：1)清理；2)剥离；3)消化；4)除杂；5)贴壁培养；6)差速消化与传代；7)除杂与二次爬出；8)大量培养；步骤6)与步骤7)收获的P1代细胞再次经过差速消化，接种培养后，获得P2代羊膜间充质干细胞；9)传代培养。本发明通过胰蛋白酶消化羊膜的上皮细胞除去杂细胞后进行组织块培养，不仅可以减少两步酶消化法消化用时过长对原代细胞产生的损伤，同时降低使用胶原酶带来的经济成本；又能避免组织块培养法中细胞爬出用时过长，以及杂细胞过多的缺点，降低时间成本；同时二次贴壁重复利用组织块，提高原代细胞获得量。提高原代细胞获得量。提高原代细胞获得量。


技术研发人员：李文东 杜文敬
受保护的技术使用者：广东华夏健康生命科学有限公司
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/13