橙皮有效成分在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用及包含其的药物

1.本发明涉及药物新用途技术领域，尤其是涉及一种橙皮有效成分在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用及包含其的药物。


背景技术：

2.冠心病是指冠状动脉发生粥样硬化所导致的血管腔狭窄淤堵，进而导致心肌缺血所引发的心脏病。中医虽无冠心病这一病名，但根据其临床症状特征，主要参考中医疾病中的“胸痹”、“心痛”等范畴。胸痹的中医证型主要分为心脉瘀阻证、气滞心胸证和痰浊闭阻证等症。结合长期中医临床实践，现有中医理论基础中所强调的“痰邪”在冠心病治疗中的重要性变得日益重要，同时以化痰、祛痰法为主进行干预治疗的冠心病痰证治疗理论逐渐形成。
3.然而，目前中西医临床上虽然也有多种治疗冠心病的药物，但治疗效果均非常微弱。因此，对我国中医药宝库进行挖掘，进而寻找一种能够有效治疗冠心病的药物变得十分的迫切。
4.现有研究表明，陈皮、化橘红等中药具有很好的抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒化及抗癌等方面的作用，同时陈皮、化橘红等中药中的有效成分不会在任何器官中积累，使用安全、无明显副作用。橙皮素和橙皮内脂是陈皮、化橘红等中药中的主要活性成分，但对橙皮素和橙皮内脂的现有应用研究并不多见，特别是对冠心病的相关应用研究还从未有人涉及。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的在于提供一种橙皮有效成分在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用。
7.本发明的第二目的在于提供一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物，所述药物的原料包括橙皮素和橙皮内脂。
8.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
9.本发明提供的一种橙皮有效成分在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用；
10.所述橙皮有效成分包括橙皮素和/和橙皮内脂。
11.进一步的，所述冠状动脉粥样硬化性心脏病为冠状动脉中巨噬细胞泡沫化所导致的冠状动脉粥样硬化性心脏病。
12.进一步的，所述应用为通过抑制巨噬细胞内的胆固醇合成治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病。
13.和/或，通过提高巨噬细胞内的胆固醇流出治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病。
14.进一步的，通过降低巨噬细胞清道夫受体蛋白的表达抑制巨噬细胞内胆固醇合成；
15.进一步的，所述巨噬细胞清道夫受体蛋白包括sr-a蛋白。
16.更进一步的，通过提高巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白的表达提高巨噬细胞内胆固醇流出；
17.优选地，所述巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白包括abca1蛋白和sr-bi蛋白。
18.本发明提供的一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物，所述药物的原料包括橙皮素和/或橙皮内脂。
19.进一步的，所述的药物还包括药学上可接受的载体。
20.更进一步的，所述药学上可接受的载体包括乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂中的一种或多种。
21.进一步的，所述药物的剂型为汤剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或散剂中的一种或多种。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
23.本发明提供的橙皮有效成分在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用，所述橙皮有效成分包括橙皮素和/或橙皮内脂。本发明通过实验研究发现，橙皮中的有效成分橙皮素和/或橙皮内脂对冠状动脉粥样硬化性心脏病具有良好的治疗效果。
24.本发明提供的治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物，所述药物的原料中包括橙皮素和/或橙皮内脂，为治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的新型药物研发提供了一种新的思路和研究基础。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为本发明实施例1提供的橙皮素溶液对oxldl干预的thp-1源性巨噬细胞的存活率影响柱状图；
27.图2为本发明实施例1提供的橙皮内脂溶液对oxldl干预的thp-1源性巨噬细胞的存活率影响柱状图；
28.图3为本发明实施例2提供的油红o染色观察图；
29.图4为本发明实施例2提供的油红o染色半定量分析图；
30.图5为本发明实施例4提供的橙皮素和橙皮内脂干预下的巨噬细胞内胆固醇流出率分析图；
31.图6为实施例5提供的橙皮素干预下巨噬细胞清道夫受体表达的表达水平图；
32.图7为实施例5提供的橙皮内脂干预下巨噬细胞清道夫受体表达的表达水平图；
33.图8为实施例6提供的橙皮素干预下巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白表达的表达水平图；
34.图9为实施例6提供的橙皮内脂干预下巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白表达的
表达水平图。
具体实施方式
35.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.根据本发明的一个方面，一种橙皮有效成分在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用；
37.所述橙皮有效成分包括橙皮素和/或橙皮内脂。
38.本发明提供的橙皮有效成分在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用，所述橙皮有效成分包括橙皮素和/或橙皮内脂。本发明通过实验研究发现，橙皮中的有效成分橙皮素和橙皮内脂对冠状动脉粥样硬化性心脏病具有良好的治疗效果。
39.橙皮素(cas号520-33-2)：植物来源于橙皮，化学分子式：c
16h14
o6，分子量：302.28，其化学结构式如下：
[0040][0041]
橙皮内脂(cas号23971-42-8)：植物来源于橙皮，化学分子式：c
15h16
o4，分子量：260.285，其化学结构式如下：
[0042][0043]
在本发明的一种优选实施方式中，所述冠状动脉粥样硬化性心脏病为冠状动脉中巨噬细胞泡沫化所导致的冠状动脉粥样硬化性心脏病；其中，所述巨噬细胞泡沫化主要由巨噬细胞内具有细胞毒性的游离胆固醇酯的累积所导致。
[0044]
作为一种优选的实施方式，在冠状动脉粥样硬化性心脏病的病程中，循环血流中
的低密度脂蛋白增加，渗透进入血管内皮下层，并被氧化形成氧化修饰的低密度脂蛋白。巨噬细胞膜表面富含清道夫受体，这些清道夫受体与氧化修饰的低密度脂蛋白结合，以脂筏的形式内化吞噬这些氧化修饰的低密度脂蛋白。然而随着巨噬细胞对氧化修饰的低密度脂蛋白的不断吞噬，大量具有细胞毒性的游离胆固醇产生(氧化修饰的低密度脂蛋白经细胞内酸性脂肪酶、中性胆固醇水解酶作用降解为游离胆固醇，并通过酰基辅酶a的酯化作用形成胆固醇酯沉积在细胞内)，导致细胞活性逐渐减弱甚至死亡。同时伴随着上述胆固醇酯的大量累积，巨噬细胞泡沫化形成泡沫细胞，这些巨噬泡沫细胞不断沉积在内膜下层，进而导致了动脉粥样硬化的形成。由此可知，巨噬细胞的泡沫化是动脉粥样硬化形成的重要原因。
[0045]
在本发明的一种优选实施方式中，所述应用为通过抑制巨噬细胞内的胆固醇合成治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病；
[0046]
和/或，通过提高巨噬细胞内的胆固醇流出治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病。
[0047]
作为一种优选的实施方式，本发明通过实验研究得到，上述橙皮有效成分(橙皮素和/或橙皮内脂)能够显著降低巨噬细胞内的胆固醇浓度和提高巨噬细胞内胆固醇流出，进而缓解具有细胞毒性的游离胆固醇酯在巨噬细胞中的累积，从而避免冠状动脉粥样硬化的形成。
[0048]
在上述实验研究的基础上，本发明对橙皮素和橙皮内脂在降低巨噬细胞内的胆固醇浓度和提高巨噬细胞内胆固醇流出方面的调控机制进行了深入研究。
[0049]
在上述优选实施方式中，通过降低巨噬细胞清道夫受体蛋白的表达抑制巨噬细胞内胆固醇合成；所述巨噬细胞清道夫受体蛋白包括sr-a蛋白。
[0050]
作为一种优选的实施方式，巨噬细胞膜表面富含多种清道夫受体，可以脂筏的形式内化吞噬氧化修饰的低密度脂蛋白。本发明通过实验证明，本发明橙皮有效成分(橙皮素和/或橙皮内脂)能够有效降低巨噬细胞清道夫受体sr-a蛋白的表达。
[0051]
在上述优选实施方式中，通过提高巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白的表达提高巨噬细胞内胆固醇流出；所述巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白包括abca1蛋白和sr-bi蛋白。
[0052]
作为一种优选的实施方式，正常的巨噬细胞中，胆固醇外流主要通过液相扩散，而在过量负载胆固醇的巨噬细胞中，胆固醇外流主要通过转运蛋白介导。此外，在胆固醇过载的人巨噬细胞中，胆固醇外流主要由abca1介导，其次为sr-bi。本发明通过实验证明，本发明橙皮素和橙皮内脂能够显著促进巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白abca1的表达水平。
[0053]
根据本发明的一个方面，一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物，所述药物的原来包括橙皮素和/或橙皮内脂。
[0054]
本发明提供的治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物，所述药物的原料包括橙皮素和/或橙皮内脂，为治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的新型药物研发提供了一种新的思路和研究基础。
[0055]
在本发明的一种优选实施方式中，所述的药物还包括药学上可接受的载体。
[0056]
在上述优选实施方式中，所述药学上可接受的载体包括乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂中的一种或多种。
[0057]
优选地，所述辅料包括如下(a)～(e)中的至少一种：
[0058]
(a)填充剂：淀粉，乳糖，糊精，糖粉，硫酸钙，蔗糖，甘露醇，微晶纤维素，葡萄糖等；
[0059]
(b)粘合剂：淀粉浆，预胶化淀粉，糊精，聚维酮，乙基纤维素，羟丙基纤维素等；
[0060]
(c)润湿剂：蒸馏水，乙醇等；
[0061]
(d)崩解剂：淀粉，羧甲基淀粉钠，微晶纤维素，交联羧甲基纤维素钠，低取代-羟丙基纤维素，枸橼酸，聚山梨酯80等；
[0062]
(e)润滑剂：硬脂酸，硬脂酸钙和硬脂酸镁，滑石粉，氢化植物油，硬脂酸，硬脂酸钙和硬脂酸镁，滑石粉，氢化植物油，硬脂酸，硬脂酸钙和硬脂酸镁，滑石粉，氢化植物油，硬脂酸，硬脂酸钙和硬脂酸镁，滑石粉，氢化植物油等。
[0063]
在本发明的一种优选实施方式中，所述药物的剂型为汤剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或散剂中的一种或多种。
[0064]
作为一种优选的实施方式，上述药物可以作为汤剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或散剂等多种剂型。
[0065]
下面以thp-1源性巨噬细胞为例，结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
[0066]
实施例1橙皮素和橙皮内脂对thp-1源性巨噬细胞的毒性实验。
[0067]
实验方法如下：
[0068]
(1)、分别将橙皮素和橙皮内脂的单体dmaso溶解于rpmi1640培养基，随后分别设置梯度浓度为～1000μmol/l的橙皮素和橙皮内脂单体溶液，具体梯度浓度如下：
[0069]
橙皮素梯度浓度为：0μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、500μmol/l、1000μmol/l；
[0070]
橙皮内脂梯度浓度为：0μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、500μmol/l、1000μmol/l；
[0071]
(2)、将上述各梯度浓度的橙皮素和橙皮内脂单体溶液协同oxldl(氧化修饰的低密度脂蛋白)干预thp-1源性巨噬细胞24h，随后使用mtt法测量干预后细胞的存活率，其结果如下表和图1、图2所示：
图1为不同浓度的橙皮素溶液对oxldl干预的thp-1源性巨噬细胞的存活率影响柱状图。
[0072]
图2为不同浓度的橙皮内脂溶液对oxldl干预的thp-1源性巨噬细胞的存活率影响柱状图。
[0073]
由上表和图1、图2可知，当橙皮内酯浓度升至500μmol/l时的细胞存活率为(35.46
±
15.75)％，而橙皮素浓度升至200μmol/l细胞存活率(54.47
±
16.24％)；
[0074]
这说明当橙皮内酯浓度≥500μmol/l时会对thp-1源性泡沫细胞产生明显毒性作用，浓度在0-200μmol/l时对细胞存活率无明显影响；当橙皮素浓度≥200μmol/l时会对thp-1源性泡沫细胞产生明显毒性作用，浓度在0-100μmol/l时对细胞存活率无明显影响。
[0075]
实施例2橙皮素和橙皮内脂干预下对巨噬细胞泡沫化的影响实验。
[0076]
实验方法如下：
[0077]
分别采用浓度为100μmol/l的橙皮素溶液以及浓度为200μmol/l的橙皮内酯溶液协同oxldl干预thp-1源性巨噬细胞24h，随后进行油红o染色观察泡沫细胞形成情况；
[0078]
实验过程中，采用10μmol/l化合物单体t0901317(化学式c
17h12
f9no3s)作为干预阳性对照组，以及单纯使用ox-ldl刺激不施加药物干预的为对照组，做对比观察。
[0079]
实验结果如图3和图4所示，其中：
[0080]
图3为本实施例提供的油红o染色观察图；由图3可知，对照组细胞经ox-ldl刺激后体积明显增大，胞浆内有亮红色脂滴围绕细胞核，呈典型戒环样泡沫细胞态。与对照组比较，t0901317组、橙皮素、橙皮内酯组，细胞胞浆内红色脂滴明显减少、变小。
[0081]
图4为本实施例提供的油红o染色半定量分析图。由图4可知，本实施例浓度为100μmol/l的橙皮素溶液组以及浓度为200μmol/l的橙皮内酯溶液组与对照组比较能够明显减少细胞内脂质沉积，其效果与t0901317组相当。
[0082]
实施例3橙皮素和橙皮内脂干预下对巨噬细胞内胆固醇浓度的影响实验。
[0083]
实验方法如下：
[0084]
分别采用浓度梯度为10μmol/l、50μmol/l、200μmol/l的橙皮内脂溶液和浓度梯度为10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l的橙皮素溶液，干预ox-ldl诱导的thp-1源性巨噬细胞24小时。
[0085]
实验中，以单纯使用ox-ldl刺激不施加药物干预的为对照组，10μmol/l t0901317干预的方案为阳性对照组，干预24h后使用总胆固醇酶法测量试剂盒、游离胆固醇酶法测量试剂盒检测细胞内胆固醇水平，具体结果如下表所示：
[0086][0087]
注：*p＜0.05 vs对照组；δp＜0.05 vs t0901317。
[0088]
由上表可知，与对照组比较，t0901317、橙皮素各浓度、橙皮内酯各浓度剂量干预均能有效降低细胞内tc、ce水平，并抑制细胞内胆固醇酯化率(cer)，差异有统计学意义(p＜0.05)；而各给药组对细胞内fc水平的影响与对照组比较无显著差异(p＞0.05)。与t0901317组比较，橙皮素各浓度组在降低tc、ce水平上效果较差，差异有统计学意义(p＜0.05)；橙皮内酯各浓度组在细胞内tc水平上与t0901317无显著差异(p＞0.05)，而在细胞内ce水平以及细胞内胆固醇酯化率方面，橙皮内酯50μmol/l药效优于t0901317p＜0.05)，橙皮内酯10、200μmol/l与t0901317无显著差异(p＞0.05)。橙皮内酯降低胆固醇水平药效未显示出明显的浓度依赖性，橙皮素有一定浓度依赖性趋势，但各浓度组间比较无显著差异(p＞0.05)。
[0089]
实施例4橙皮素和橙皮内脂干预下巨噬细胞内胆固醇流出率的影响实验。
[0090]
实验方法如下：
[0091]
标记的胆固醇刺激thp-1源性巨噬细胞后，使用10μmol/lt0901317、梯度浓度橙皮素(10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l)、橙皮内酯(10μmol/l、50μmol/l、200μmol/l)分别干预被标记的巨噬细胞，以单纯使用标记胆固醇刺激的thp-1巨噬细胞为对照组，干预24h后检测培养基内胆固醇浓度和细胞裂解液胆固醇浓度。
[0092]
然后以培养基内胆固醇浓度/(培养基内胆固醇浓度+细胞裂解液胆固醇浓度)计
算胆固醇流出率，探查橙皮素和橙皮内脂对细胞胆固醇流出率的影响。
[0093]
实验结果如下表和图5所示：
[0094][0095]
图5为本实施例提供的上述橙皮素和橙皮内脂干预下的巨噬细胞内胆固醇流出率分析图。
[0096]
由上表和图5可知，与对照组比较，t0901317组和各梯度浓度橙皮素、橙皮内酯干预后细胞胆固醇流出率均明显增加。橙皮素浓度10μmol/l、100μmol/l时促进细胞胆固醇流出率效果劣于t0901317组，而橙皮素50μmol/l组与t0901317促进胆固醇流出率效果相当；橙皮内酯10μmol/l、200μmol/l时促进细胞胆固醇流出率效果劣于t0901317组，而橙皮素0μmol/l组与t0901317促进胆固醇流出率效果相当。
[0097]
实施例5橙皮素和橙皮内脂对巨噬细胞清道夫受体的表达影响实验。
[0098]
实验方法如下：
[0099]
采用western blot法检测各组巨噬细胞清道夫受体cd36、sr-a的表达水平，以探查橙皮素和橙皮内脂干预巨噬细胞泡沫化的药效机制，具体方法如下：
[0100]
1.分组
[0101]
对照组：3％ fbs rpmi-1640培养基+50mg/l ox-ldl；
[0102]
t0901317组：3％ fbs rpmi-1640培养基+50mg/l ox-ldl+10μmol/lt0901317；
[0103]
橙皮素组：3％ fbs rpmi-1640培养基+50mg/l ox-ldl+10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l橙皮素；
[0104]
橙皮内酯组：3％ fbs rpmi-1640培养基+50mg/l ox-ldl+10μmol/l、50μmol/l、200μmol/l橙皮内酯。
[0105]
2.给药
[0106]
取对数增长、状态良好thp-1细胞，以2
×
106个/孔接种于6孔细胞板中，按前述操作使用pma诱导分化为巨噬细胞；吸弃原培养基，使用复温的pbs缓慢润洗2次。按上述分组，加入ox-ldl和药物溶解于含3％ fbs的rpmi-1640培养基中，放入37℃，5％co2细胞培养箱培养24h。
[0107]
3.蛋白提取
[0108]
取出6孔板，吸弃原培养基，pbs漂洗2次，放置于冰上；取适量ripa细胞裂解液，加入pmsf，使其终浓度为1mmol/l；每孔加入适量含pmsf的细胞裂解液，在冰上静置裂解3min，用细胞刮刮下细胞，将细胞和裂解液一同收集于1.5ml ep管；离心机预冷至4℃，12000r/min，离心15min，小心收集上清液于1.5mlep管，取适量上清液用于bca蛋白浓度测定；其余按蛋白总体积以4∶1比例加入5
×
上样缓冲液sds，根据bca蛋白浓度测量结果，加入适量ripa调整各样品浓度，移液枪吹打混匀，100℃恒温金属浴煮10min，-80℃存储备用。
[0109]
4.蛋白浓度测定
[0110]
取1ml浓度为2g/l牛血清蛋白标准品，用无水乙醇稀释终浓度为1500mg/l、1000mg/l、750mg/l、500mg/l、250mg/l、125mg/l，无水乙醇作为零浓度空白对照；按体积比例50∶1，将bca试剂盒中适量试剂a与试剂b混匀，制成蛋白测量工作液备用。将适量空白对照、标准品、待测样品加入96孔板中，每孔加入200μl蛋白测量工作液，充分混合，37℃孵育30min；待冷却至室温后，使用酶标仪测量每孔在波长562nm处的吸光度od562；样品的od562校正，将各个标准品、待测样品在562nm出的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值；使用校正后bca标准品的od562与其对应的浓度作图，绘制标准曲线；运用标准曲线计算待测样品od562所对应的蛋白浓度。
[0111]
5.western blot检测蛋白表达水平
[0112]
(1)制胶：清洗1.5mm玻璃板，超纯水润洗后晾干备用；按照说明书，使用bio-rad微型垂直板电泳装置固定夹层玻璃板；按照如下表所示，配制10％分离胶溶液，充分混匀，使用5ml移液枪沿夹层玻璃板一侧缓慢灌入分离胶，以避免产生气泡，用无水乙醇压平分离胶液面；待分离胶凝固后，倒掉无水乙醇，使用超纯水多次冲洗分离胶平面，再用滤纸吸干残存超纯水；按如下表所示，配制5％浓缩胶，加入temed混匀后，立即向夹层玻璃板中灌入浓缩胶，灌胶时使用移液枪沿夹层玻璃板一侧贴壁灌入，以防止气泡产生，最后在浓缩胶中插入梳子；室温放置1h，待浓缩胶凝固后小心拔出梳子，用上样缓冲液冲洗梳孔。
[0113]
10％分离胶和5％浓缩胶配方
[0114][0115]
(2)上样：将凝胶板安装固定于电泳槽中，内槽加满新鲜配制的电泳缓冲液，外槽根据凝胶板数量加入对应量的电泳缓冲液；取出冻存的蛋白样品，4℃冰箱缓慢溶解；溶解后，用微量注射器将蛋白样品加入浓缩胶上样孔中，每孔30-50μg蛋白，根据目的蛋白，在两侧加入相应marker。(3)电泳：开始设置电压为80v，观察marker进入分离胶后，调整电压为100v，根据所需目的蛋白，恒压电泳1-3h。得到目的蛋白后断开电源，取出凝胶板。(4)转膜：根据凝胶板大小，裁取大小适宜的pvdf膜，放入甲醛中数秒后，按滤纸-凝胶-膜的顺序制成“三明治”，安装过在电转液浸泡下完成，每加一层使用表面光滑的玻璃管轻轻压走气泡；将安装好的电转板放入电转槽，倒入预冷的转膜液，应没过整张pvdf膜；设置300ma恒定电流转膜1.5h。(5)封闭：转膜后，小心打开电转板夹，取出pvdf膜，根据目的蛋白分子量，安装marker标记位置，剪下目的蛋白条带，并做好标记；将目的蛋白条带放入5％脱脂奶粉中，低速摇床室温封闭2h。(6)孵育一抗、二抗：按照抗体说明书要求配制一抗，将封闭完成的条带放入对应的一抗溶液中，4℃孵育过夜；次日回收一抗，tbst溶液漂洗目的蛋白条带，10min
×
3次；根据一抗种属，按照抗体说明书配制相应二抗，将目的蛋白条带放入对应的二抗溶液中，室温孵育2h；孵育完成后，tbst溶液漂洗母带蛋白条带，10min
×
3次。
[0116]
(7)显影和图像分析：避光，按1∶1比例，将a液与b液混匀，制成发光工作液备用；目的条带蛋白面朝上，加入适量发光工作液，使用bio-rad自动曝光机显影；所得图片保存，进行灰度分析，计算统计各目的蛋白的相对表达量。
[0117]
检测结果如图6和图7所示，由图6可知，梯度浓度橙皮素干预后，cd36方面，与对照组比较，对照组与t0901317和各浓度橙皮素组、t0901317组与各浓度橙皮素组以及各浓度橙皮素组组间比较均无显著差异(p＞0.05)。sr-a方面，与对照组比较，橙皮素50μmol/l能够显著降低细胞sr-a蛋白表达水平，差异有统计学意义(p＜0.05)，其他给药组与对照组比较差异无统计学意义(p＞0.05)；与t0901317比较，橙皮素10μmol/l、50μmol/l降低sr-a蛋白水平效果优于t0901317，差异有统计学意义(p＜0.05)，而橙皮素100μmol/l与t0901317
之间差异不显著(p＞0.05)。
[0118]
由图7可知，梯度浓度橙皮内酯干预后，在cd36和sr-a方面，对照组与t0901317和各浓度橙皮内酯、t0901317组与各浓度橙皮内酯组以及各浓度橙皮内酯组组间比较均无显著差异(p＞0.05)。
[0119]
由上述实验可知，橙皮素能够有效降低巨噬细胞清道夫受体sr-a蛋白的表达水平。
[0120]
实施例6橙皮素和橙皮内脂对巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白的表达影响实验。
[0121]
实验方法如下：
[0122]
采用western blot法检测各组巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白abca1、sr-bi的表达水平，以探查橙皮素和橙皮内脂干预巨噬细胞泡沫化的药效机制，具体方法如下：
[0123]
1.分组
[0124]
对照组：3％ fbs rpmi-1640培养基+50mg/l ox-ldl；
[0125]
t0901317组：3％ fbs rpmi-1640培养基+50mg/l ox-ldl+10μmol/lt0901317；
[0126]
橙皮素组：3％ fbs rpmi-1640培养基+50mg/l ox-ldl+10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l橙皮素；
[0127]
橙皮内酯组：3％ fbs rpmi-1640培养基+50mg/l ox-ldl+10μmol/l、50μmol/l、200μmol/l橙皮内酯。
[0128]
2.给药
[0129]
取对数增长、状态良好thp-1细胞，以2
×
106个/孔接种于6孔细胞板中，按前述操作使用pma诱导分化为巨噬细胞；吸弃原培养基，使用复温的pbs缓慢润洗2次。按上述分组，加入ox-ldl和药物溶解于含3％ fbs的rpmi-1640培养基中，放入37℃，5％co2细胞培养箱培养24h。
[0130]
3.蛋白提取
[0131]
取出6孔板，吸弃原培养基，pbs漂洗2次，放置于冰上；取适量ripa细胞裂解液，加入pmsf，使其终浓度为1mmol/l；每孔加入适量含pmsf的细胞裂解液，在冰上静置裂解3min，用细胞刮刮下细胞，将细胞和裂解液一同收集于1.5ml ep管；离心机预冷至4℃，12000r/min，离心15min，小心收集上清液于1.5mlep管，取适量上清液用于bca蛋白浓度测定；其余按蛋白总体积以4∶1比例加入5
×
上样缓冲液sds，根据bca蛋白浓度测量结果，加入适量ripa调整各样品浓度，移液枪吹打混匀，100℃恒温金属浴煮10min，-80℃存储备用。
[0132]
4.蛋白浓度测定
[0133]
取1ml浓度为2g/l牛血清蛋白标准品，用无水乙醇稀释终浓度为1500mg/l、1000mg/l、750mg/l、500mg/l、250mg/l、125mg/l，无水乙醇作为零浓度空白对照；按体积比例50∶1，将bca试剂盒中适量试剂a与试剂b混匀，制成蛋白测量工作液备用。将适量空白对照、标准品、待测样品加入96孔板中，每孔加入200μl蛋白测量工作液，充分混合，37℃孵育30min；待冷却至室温后，使用酶标仪测量每孔在波长562nm处的吸光度od562；样品的od562校正，将各个标准品、待测样品在562nm出的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值；使用校正后bca标准品的od562与其对应的浓度作图，绘制标准曲线；运用标准曲线计算待测样品od562所对应的蛋白浓度。
[0134]
5.western blot检测蛋白表达水平
[0135]
(1)制胶：清洗1.5mm玻璃板，超纯水润洗后晾干备用；按照说明书，使用bio-rad微型垂直板电泳装置固定夹层玻璃板；按照如下表所示，配制10％分离胶溶液，充分混匀，使用5ml移液枪沿夹层玻璃板一侧缓慢灌入分离胶，以避免产生气泡，用无水乙醇压平分离胶液面；待分离胶凝固后，倒掉无水乙醇，使用超纯水多次冲洗分离胶平面，再用滤纸吸干残存超纯水；按如下表所示，配制5％浓缩胶，加入temed混匀后，立即向夹层玻璃板中灌入浓缩胶，灌胶时使用移液枪沿夹层玻璃板一侧贴壁灌入，以防止气泡产生，最后在浓缩胶中插入梳子；室温放置1h，待浓缩胶凝固后小心拔出梳子，用上样缓冲液冲洗梳孔。
[0136]
10％分离胶和5％浓缩胶配方
[0137][0138]
(2)上样：将凝胶板安装固定于电泳槽中，内槽加满新鲜配制的电泳缓冲液，外槽根据凝胶板数量加入对应量的电泳缓冲液；取出冻存的蛋白样品，4℃冰箱缓慢溶解；溶解后，用微量注射器将蛋白样品加入浓缩胶上样孔中，每孔30-50μg蛋白，根据目的蛋白，在两侧加入相应marker。(3)电泳：开始设置电压为80v，观察marker进入分离胶后，调整电压为100v，根据所需目的蛋白，恒压电泳1-3h。得到目的蛋白后断开电源，取出凝胶板。(4)转膜：根据凝胶板大小，裁取大小适宜的pvdf膜，放入甲醛中数秒后，按滤纸-凝胶-膜的顺序制成“三明治”，安装过在电转液浸泡下完成，每加一层使用表面光滑的玻璃管轻轻压走气泡；将安装好的电转板放入电转槽，倒入预冷的转膜液，应没过整张pvdf膜；设置300ma恒定电流转膜1.5h。(5)封闭：转膜后，小心打开电转板夹，取出pvdf膜，根据目的蛋白分子量，安装marker标记位置，剪下目的蛋白条带，并做好标记；将目的蛋白条带放入5％脱脂奶粉中，低速摇床室温封闭2h。(6)孵育一抗、二抗：按照抗体说明书要求配制一抗，将封闭完成的条带放入对应的一抗溶液中，4℃孵育过夜；次日回收一抗，tbst溶液漂洗目的蛋白条带，10min
×
3次；根据一抗种属，按照抗体说明书配制相应二抗，将目的蛋白条带放入对应的二抗溶液中，室温孵育2h；孵育完成后，tbst溶液漂洗母带蛋白条带，10min
×
3次。
[0139]
(7)显影和图像分析：避光，按1∶1比例，将a液与b液混匀，制成发光工作液备用；目的条带蛋白面朝上，加入适量发光工作液，使用bio-rad自动曝光机显影；所得图片保存，进行灰度分析，计算统计各目的蛋白的相对表达量。
[0140]
实验结果如图8和图9所示，如图8所示，梯度浓度橙皮素干预后，abca1方面，与对照组比较，橙皮素10μmol/l、50μmol/l、100μmol/l均显著增加细胞abca1蛋白表达水平，差异有统计学意义(p＜0.05)；与t0901317比较，橙皮素各浓度增加的abca1蛋白表达水平低于t0901317，差异有统计学意义(p＜0.05)；橙皮素各浓度组组间比较，abca1蛋白水平无显著差异(p＞0.05)。sr-bi方面，各浓度橙皮素干预后细胞sr-bi蛋白表达水平表现出一定增加趋势，但与对照组差异尚不构成统计学差异(p＞0.05)；t0901317组与各浓度橙皮素组间比较，差异均无统计学意义(p＞0.05)。
[0141]
如图9所示，梯度浓度橙皮内酯干预后，abca1方面，与对照组比较，橙皮内酯各浓度均显著增加细胞abca1蛋白表达，差异有统计学意义(p＜0.05)；与t0901317比较，橙皮内酯200μmol/l组细胞abca1蛋白表达水平低于t0901317组，差异有统计学意义(p＜0.05)，而橙皮内酯10μmol/l、50μmol/l组细胞abca1蛋白表达水平与t0901317组无显著差异(p＞0.05)。sr-bi方面，与对照组比较，橙皮内酯各浓度均显著增加细胞sr-bi蛋白表达水平，差异有统计学意义(p＜0.05)；与t0901317组比较，橙皮内酯200μmol/l组细胞sr-bi水平低于t0901317，差异有统计学意义(p＜0.05)，而橙皮内酯10μmol/l与t0901317组无显著差异(p＞0.05),橙皮内酯200μmol/l组细胞sr-bi水平有高于t0901317组的趋势，但差异尚不构成统计学意义(p＞0.05)。
[0142]
由本实施例上述实验可知，橙皮素、橙皮内酯均能够显著促进巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白abca1蛋白的表达水平，同时，橙皮内酯能促进巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白sr-bi的表达。
[0143]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种橙皮有效成分在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用；所述橙皮有效成分包括橙皮素和/或橙皮内脂。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠状动脉粥样硬化性心脏病为冠状动脉中巨噬细胞泡沫化所导致的冠状动脉粥样硬化性心脏病。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过抑制巨噬细胞内的胆固醇合成治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病；和/或，通过提高巨噬细胞内的胆固醇流出治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过降低巨噬细胞清道夫受体蛋白的表达抑制巨噬细胞内胆固醇合成。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述巨噬细胞清道夫受体蛋白包括sr-a蛋白。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过提高巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白的表达提高巨噬细胞内胆固醇流出；优选地，所述巨噬细胞胆固醇逆转运相关膜蛋白包括abca1蛋白和sr-bi蛋白。7.一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物，其特征在于，所述药物的原料包括橙皮素和/或橙皮内脂。8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述的药物还包括药学上可接受的载体。9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂中的一种或多种。10.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为汤剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或散剂中的一种或多种。

技术总结
本发明提供了一种橙皮有效成分在制备治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病药物中的应用及包含其的药物，涉及药物新用途技术领域。本发明通过实验研究发现，橙皮中的有效成分橙皮素和橙皮内脂对冠状动脉粥样硬化性心脏病具有良好的治疗效果。上述橙皮素和橙皮内脂能够有效抑制巨噬细胞内的胆固醇合成，同时提高巨噬细胞内的胆固醇流出，从而有效缓解由于游离胆固醇的大量累积所导致的巨噬细胞泡沫化，进而起到对冠状动脉粥样硬化性心脏病进行治疗的作用。作用。


技术研发人员：徐丹苹 吴焕林 陈玄晶
受保护的技术使用者：中山大学附属第八医院（深圳福田）
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/13