一种蛋白测定分析方法与流程

1.本发明属于蛋白质分析化学技术领域，特别是涉及一种蛋白测定分析方法。


背景技术：

2.蛋白测定是生物化学和分子生物学常用的分析手段。由于其重要性，已经有多种成熟的检测方法，其中有几种也被广泛的应用。
3.蛋白质测定一般分为两类：紫外吸收法或荧光法。紫外吸收法可以直接测定体液或蛋白质溶液中的总蛋白，但不能以这种方法测定组织的全细胞裂解物，并且核酸的存在会在与蛋白质相同的光谱范围内吸光，从而干扰蛋白质的检测。与之相反，荧光法通过荧光染料结合进行测定，可以对可见光区域的荧光进行测定，能够避免核酸的这种干扰。不过，即使荧光法有较紫外吸收法避免干扰的优点，但其缺点也是明显的，其需要通过与荧光染料结合来测定，蛋白无法进行回收，在进行微量蛋白测定时，这一缺点就限制了应用。
4.bca法是目前测定蛋白质浓度比较通用的方法，通过蛋白将cu
2+
还原为cu
+
，cu
+
与bca试剂形成紫色的络合物，将该水溶性复合物在562nm处的吸收值，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。虽然该方法被广泛应用，但其间接的测量方法，蛋白无法回收，其较长的反应时间也带来很大的不便。
5.蛋白质含有三种不同的芳香族氨基酸，分别带有苯环、苯酚环和吲哚环。这些基团中的每一个都可以被紫外线激发而发出荧光。生物化学中主要通过色氨酸的荧光来分析蛋白质的结构与功能。色氨酸荧光法(wf)测定总蛋白是一种简单、灵敏和直接的方法，其检测速度快、蛋白可回收、灵敏度高，是一种替代bca检测的行之有效的方法。
6.既往，用于进行色氨酸荧光法测定的设备，大多采用荧光光谱仪。荧光光谱仪体积大，设备昂贵，不利于其应用。另外，使用紫外分光光度计测量或者使用荧光光谱仪测量，需要的样本量比较大，大多是毫升量级，有鉴于此，有必要开发一款基于色氨酸荧光法(wf)的小型化检测设备，耗材简易、速度快，上样量少，以至少部分地解决现有技术中存在的问题。


技术实现要素：

7.本发明在于公开一种蛋白测定分析方法，包括对样品中的蛋白的色氨酸的激发步骤和对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测的步骤，所述样品不需要蛋白进行化学反应产生有色的物质或加入标记物的预处理；
8.所述样品盛放于石英材质的检测管中。
9.在本发明的一些实施方式中，对所述样品中的蛋白的色氨酸的激发步骤通过荧光激发光路进行，所述荧光激发光路包括激发光源，优选还包括滤光片。
10.在本发明的一些实施方式中，对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测的步骤通过荧光检测光路进行，所述荧光检测光路包括荧光检测器件和滤光片，优选还包括发射端透镜。
11.在本发明的一些实施方式中，所述激发光源为发出包括260nm～300nm波长的激发光的光源。
12.在本发明的一些实施方式中，所述荧光检测器件为检测包括320nm～380nm波长的荧光的检测器件。
13.在本发明的一些实施方式中，所述检测管的容量不超过200μl，优选所述检测管为石英毛细管。
14.在本发明的一些实施方式中，所述还包括测定所述样品中的蛋白的紫外吸收的步骤。
15.在本发明的一些实施方式中，测定所述样品中的蛋白的紫外吸收的步骤通过uv测定光路进行，所述uv测定光路包括uv检测器件，优选还包括滤光片。
16.在本发明的一些实施方式中，还包括对所述样品检测后的回收步骤。
17.在本发明的一些实施方式中，包括以下步骤：
18.s11，配置的标准品，加入到检测管中，对标准中的蛋白的色氨酸的激发，对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测，测定标准品的荧光值，制备标准曲线；
19.s12，将待测的蛋白溶液作为样品，加入到检测管中，对样品中的蛋白的色氨酸的激发，对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测，测定样品的荧光值，根据标准曲线计算样品的蛋白含量。
20.在本发明的一些实施方式中，包括以下步骤：
21.将待测的蛋白溶液加入到检测管中，测定紫外吸收值。
22.有益效果：
23.本发明的蛋白测定分析方法，在一些实施方式中，通过检测加注到检测管中蛋白的色氨酸受激发射的直接荧光来进行分析。待检测蛋白可以直接检测，无需加入其他标记物，具有较高的灵敏度，无需反应时间，上样即检测，检测速度快，检测后的蛋白可以选择回收。在一些实施方式中，对于高浓度样本，还可以使用uv测定光路，通过测定待测样本在280nm的吸收峰，用紫外法对总蛋白进行测定。色氨酸荧光法与紫外吸收法的结合，可以对较高动态范围内的样本进行检测。
附图说明
24.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
25.图1为本发明的一种实施方式的蛋白测定分析方法的荧光光路结构示意图(俯视图)；
26.图2为图1的细节图；
27.图3为本发明的一种实施方式的蛋白测定分析方法的荧光光路和紫外光路的结构示意图(俯视图)；
28.图4为本发明的一种实施方式的蛋白测定分析方法的外部结构示意图；
29.图5为本发明的一种实施方式的蛋白测定分析方法的检测管的结构示意图；
30.图6为本发明的一种实施方式的蛋白测定分析方法的色氨酸激发和发射光谱；
31.图7为本发明的一种实施方式的蛋白测定分析方法的蛋白浓度和荧光检测值的标准曲线。
32.其中，1为石英管，10为检测管，11为检测管托架，21为荧光激发光路，22为荧光检
测光路，211为激发光源，212为激发端滤光片，213为激发端透镜，224为发射端透镜1，223为发射端滤光片，222为发射端透镜2，221为荧光接收器件，23为uv检测光路，30为密光机构。
具体实施方式
33.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
34.实施例1
35.本发明的蛋白测定分析方法，包括对样品中的蛋白的色氨酸的激发步骤和对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测的步骤，所述样品不需要蛋白进行化学反应产生有色的物质或加入标记物的预处理。对样品中的蛋白的色氨酸的激发步骤通过荧光激发光路进行，对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测的步骤通过荧光检测光路进行。
36.如图4所示，一种实现蛋白测定分析方法的荧光分析仪，包括检测管10、检测管承托机构、光学检测机构和密光机构30。
37.所述检测管10包括检测管托架11和石英管1组成，如图5所示。所述石英管1可以通过插接、粘合、卡接等方式与检测管托架固定在一起。所述石英管1可以承载待检测的样本，所述检测管托架11与所述检测管承托机构保持位置相对固定。
38.如图1和图2所示，所述光学检测机构包括检测色氨酸含量的荧光检测光路，包括荧光激发光路21和荧光检测光路22。
39.光学检测机构与石英管1呈法向设置，用于对石英管1中的待测样本进行激发及检测。本实施例中，荧光激发光路21与荧光检测光路22呈法向设置。其中211是激发光源(实施例中使用led)，212是激发端滤光片(实施例中光谱是280/20，即从270～290nm)，213是激发端透镜。211发出的激发光通过激发端滤光片212，特定波长的光(270～290nm)通过激发端透镜213汇聚到石英管1中，激发石英管1中待检蛋白中的色氨酸发出荧光。荧光发射光路22与荧光激发光路21以及石英管1在同一平面内，可以收集石英管1受激发射的荧光。具体来说，石英管1受激发出的荧光，经过发射端透镜1 224后平行光进入发射端滤光片223(实施例中光谱是330/20，即从320～340nm)，经发射端滤光片223后，特定波长的荧光(320～340nm)通过发射端透镜2 222汇聚到荧光接收器件221上(实施例为光电倍增管)，其检测到的电信号进行模数转换，进入信道被计算机端接收，进行后续的数据处理及分析。检测光路与激发光路可以呈多个角度，实施例中为90度。
40.本实施例是通过检测加注到检测管中蛋白的色氨酸受激发射的直接荧光来进行分析。
41.所述石英管的形状不限，待检测蛋白可以加注到所述石英管中进行直接检测，无需加入其他标记物，检测后的蛋白可以选择回收。
42.图3所示，所述光学检测机构还可以包括uv测定光路23，测定蛋白含量。uv测定光路23可以测定紫外吸收，与荧光激发光路21呈直线设置，石英管1位于荧光激发光路21与uv测定光路23中间，uv测定光路23还包括检测器件和对应波长的滤光片。对于高浓度样本，还可以使用uv测定光路，通过测定待测样本在280nm的吸收峰，用紫外法对总蛋白进行测定。
检测管周围可以设置uv测定光路。所述uv测定光路可以测定紫外吸收，与所述激发光路呈直线设置，所述检测管位于激发光路与uv测定光路中间，所述uv测定光路至少包括检测器件。实施中激发光路和uv测定光路还可以包括对应波长的滤光片。uv测定光路可以扩展所述分析仪的分析范围。传统的uv测定光路灵敏度较低，无法准确测定低浓度样本，且容易被其他物质干扰，但uv光路具有较高的测定范围，对于高浓度样本，在荧光光路饱和的情况下，可以配合uv光路进行测定。
43.所述密光机构30可以在所述石英管1插入检测管承托机构后对整个机构密光。
44.所述荧光分析仪的工作流程如下：
45.待测样本加入所述检测管10中；
46.打开所述荧光测定分析仪的密光机构30；
47.将所述检测管10放入所述检测管承托机构中；
48.关闭所述荧光测定分析仪的密光机构30；
49.所述光学检测机构的激发光导通，发出中心波长为280nm的激发光；
50.所述激发光入射至所述石英管1中的待测样本；
51.所述待测样本中的色氨酸被激发，发出中心波长为350nm的荧光；
52.所述荧光检测光路接收到色氨酸受激发射的荧光，通过标准曲线计算出待测样本蛋白的含量；
53.所述uv测定光路23接收到通过石英管1后的吸收光，通过计算280nm的吸收情况计算出总蛋白含量。
54.具体来说，
55.(1)使用标准品进行定标或校标；
56.(2)使用待测样本上机测试；
57.(3)通过第(2)步的检测荧光值，配合标准曲线进行蛋白浓度定量。
58.定标的方法如下：
59.(1)准备一系列浓度的标准品(已知浓度的蛋白，蛋白种类不限，作为示例，本实施例采用的是人免疫球蛋白)；
60.(2)将标准品分别加入石英管1中，放入检测仪器中进行数据检测，得到不同浓度标准品对应的荧光数值；
61.(3)将标准品蛋白浓度及检测荧光值生成标准曲线，如图7所示，得到标准曲线的斜率和截距。
62.定量的方法如下：
63.(1)加入待测蛋白，上机得到检测的荧光数值；
64.(2)通过荧光数值，带入标准曲线中，通过已知的斜率和截距，计算得到待测蛋白的浓度值。
65.如图6所述，本发明的荧光分析仪的可以有效对色氨酸激发和发射，和图7所示，本发明的荧光分析仪的蛋白浓度和荧光检测值的标准曲线好。
66.对于高浓度样本，还可以使用uv测定光路23，通过测定待测样本在280nm的吸收峰，用紫外法对总蛋白进行测定。
67.通过上述结构的设计，色氨酸荧光法与紫外吸收法的结合，可以对较高动态范围
内的样本进行检测，低浓度样本检测具有较高的灵敏度。同时直接测定的方法，蛋白可回收，无需反应时间，上样即检测，检测速度快，解决了既往应用上的痛点。
68.以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

技术特征：
1.一种蛋白测定分析方法，其特征在于，包括对样品中的蛋白的色氨酸的激发步骤和对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测的步骤，所述样品不需要蛋白进行化学反应产生有色的物质或加入标记物的预处理；所述样品盛放于石英材质的检测管中。2.根据权利要求1所述的蛋白测定分析方法，其特征在于，对所述样品中的蛋白的色氨酸的激发步骤通过荧光激发光路进行，所述荧光激发光路包括激发光源，优选还包括滤光片。3.根据权利要求1或2所述的蛋白测定分析方法，其特征在于，对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测的步骤通过荧光检测光路进行，所述荧光检测光路包括荧光检测器件和滤光片，优选还包括发射端透镜。4.根据权利要求1-3任一所述的蛋白测定分析方法，其特征在于，所述激发光源为发出包括260nm～300nm波长的激发光的光源；和/或，所述荧光检测器件为检测包括320nm～380nm波长的荧光的检测器件。5.根据权利要求1-4任一所述的蛋白测定分析方法，其特征在于，所述检测管的容量不超过200μl，优选所述检测管为石英毛细管。6.根据权利要求1-5任一所述的蛋白测定分析方法，所述还包括测定所述样品中的蛋白的紫外吸收的步骤。7.根据权利要求1-6任一所述的蛋白测定分析方法，测定所述样品中的蛋白的紫外吸收的步骤通过uv测定光路进行，所述uv测定光路包括uv检测器件，优选还包括滤光片。8.根据权利要求1-7任一所述的蛋白测定分析方法，还包括对所述样品检测后的回收步骤。9.根据权利要求1-8任一所述的蛋白测定分析方法，其特征在于，包括以下步骤：s11，配置的标准品，加入到检测管中，对标准中的蛋白的色氨酸的激发，对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测，测定标准品的荧光值，制备标准曲线；s12，将待测的蛋白溶液作为样品，加入到检测管中，对样品中的蛋白的色氨酸的激发，对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测，测定样品的荧光值，根据标准曲线计算样品的蛋白含量。10.根据权利要求1-9任一所述的蛋白测定分析方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测的蛋白溶液加入到检测管中，测定紫外吸收值。

技术总结
本发明公开了一种蛋白测定分析方法，属于蛋白质分析化学技术领域。该蛋白测定分析方法一种蛋白测定分析方法，其特征在于，包括对样品中的蛋白的色氨酸的激发步骤和对激发后的蛋白的色氨酸的荧光检测的步骤，所述样品不需要蛋白进行化学反应产生有色的物质或加入标记物的预处理；所述样品盛放于石英材质的检测管中。本发明的蛋白测定分析方法，通过检测加注到检测管中蛋白的色氨酸受激发射的直接荧光来进行分析。待检测蛋白可以直接检测，无需加入其他标记物，具有较高的灵敏度，无需反应时间，上样即检测，检测速度快，检测后的蛋白可以选择回收。以选择回收。以选择回收。


技术研发人员：王宪华 钱希江 王健辉 田文双 李天奇
受保护的技术使用者：北京贝泰科技有限公司
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/8/13