一种弗雷登克塞尔根假单胞菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种弗雷登克塞尔根假单胞菌及其应用。


背景技术：

2.异丙甲草胺为酰胺类除草剂，英文名字：metolachlo，分子式：c
15h22
clno2，分子量：283.8，异丙甲草胺是广谱性播后苗前除草剂，主要通过幼芽吸收，向上传导，抑制幼芽与根的生长。作用机制主要抑制发芽种子的蛋白质合成，其次抑制胆碱渗入磷脂，干扰卵磷脂形成。由于禾本科杂草幼芽吸收异丙甲草胺的能力比阔叶杂草强，因而该药防除禾本科杂草的效果远远好于阔叶杂草。异丙甲草胺运用于旱地作物、蔬菜作物和果园、苗圃使用，在多种作物如：大豆、玉米、棉花、花生、马铃薯、白菜、菠菜、蒜、向日葵芝麻、油菜、萝卜、甘蔗等农作物上使用，也可以在果园及其他豆科、十字花科、茄科、菊科和伞形科作物上使用，可防除牛筋草、马唐、狗尾草、棉草等一年生禾本科杂草以及苋菜、马齿苋等阔叶杂草和碎米莎草、油莎草，对禾本科草和阔叶草有较好防效。因此，异丙甲草胺也可用作对退耕土地上的非选择性除草剂。异丙甲草胺其在土壤中持留性和半衰期较长，容易对水稻、小麦、大豆等后茬敏感作物产生药害；污染地下水和地表水，威胁到人类和动物健康以及生态环境。因为长期大范围使用目前已造成了严重的环境污染，在作物生长的土壤、水体中均已检测到异丙甲草胺存在，它不仅破坏生态环境，还严重危害着人类的健康。
3.微生物降解农药的机理主要分为2类，一种是微生物直接作用于农药，然后发生酶促反应，进而降解农药，大多数微生物降解农药都是通过这种机理实现的；另一种是微生物通过改变周围环境而间接影响农药，常见的主要有矿化作用、累积作用、共代谢作用。微生物通过酶促反应降解农药的方式主要有脱氢、还原、水解、氧化等反应类型。
4.近年来，固定化微生物技术快速发展，逐渐将其应用于农药降解、污水处理中，成为一个新的研究领域。因为固定化细胞能够阻碍底物和氧气的扩散，从而降低细胞的酶活性。异丙甲草胺的自身结构稳定，难以降解，不溶于水。其在环境中的迁移率较高，在自然环境中的降解率比较低。传统去除异丙甲草胺一般应用物理和化学方法，如吸附、催化、氧化还原，但这些方法修复成本高、操作过程复杂、降解中间产物不确定，致使其在降解过程中产生更大的污染副产物扩散到水环境、土壤环境、大气环境，造成二次污染等问题。基于此等问题，寻找一种不会产生二次污染的生物降解技术。生物降解方法操作简单、成本低、无二次污染等，在近年来被广泛的研究。目前异丙甲草胺的生物降解主要包括了植物降解以及微生物降解。微生物降解是指利用环境中的微生物把有异丙甲草胺转化成为简单无毒的无机物的方法。所以，筛选高效降解异丙甲草胺的微生物菌株工作被科研人员高度重视，目前已经分离出来的微生物种类主要包括细菌、真菌、放线菌和藻类等。微生物降解中细菌是降解异丙甲草胺的主要群体。自上世纪80年代以来，细菌由于培养简单和强适应能力，而被广泛应用于微生物污染修复方面，在降解异丙甲草胺的微生物中有着极其重要的地位。已经分离出许多可以部分降解甚至完全降解异丙甲草胺的细菌。假单胞菌属(pseudomonas sp.)对土壤环境的适应能力较好，耐碱性和耐旱性较强，在土壤中生长较优，新菌株的发现
对于降解环境中异丙甲草胺有着极其重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种弗雷登克塞尔根假单胞菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该菌株可以高效降解异丙甲草胺及异丙甲草胺污染过的土壤，对土壤修复具有重要意义。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种弗雷登克塞尔根假单胞菌(pseudomonas fredenkscergensis)，该菌已于2023年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.26782。
8.本发明还提供一种所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌在制备降解异丙甲草胺的微生物制剂中的应用。
9.本发明还提供一种微生物制剂，包含所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌。
10.本发明还提供一种所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌在制备土壤修复剂中的应用。
11.本发明还提供一种土壤修复剂，包含所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌。
12.本发明还提供一种发酵培养所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌的方法，包括将所述弗雷登克塞尔根假单胞菌接种lb培养基，经发酵培养获取发酵液的步骤。
13.优选的是，所述发酵培养的温度为26-36℃，发酵时间为12-84h，转速为120-220rpm，初始ph值为5-7。
14.优选的是，所述发酵培养的温度为30℃，发酵时间为48h，转速为180rpm，初始ph值为6。
15.本发明还提供所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌、所述的微生物制剂或者所述的土壤修复剂在土壤修复中的应用。
16.优选的是，所述应用为应用于异丙甲草胺污染的土壤修复中。
17.本发明公开了以下技术效果：
18.本发明从土壤中分离一株弗雷登克塞尔根假单胞菌，经实验发现，该菌株在添加100ml/l的异丙甲草胺的基础盐培养基中培养48h，降解率达到93.9％，说明该菌株对除草剂异丙甲草胺有高效降解能力；施用该菌株发酵液于含异丙甲草胺的土壤中处理35d，降解率达到82.1％，充分说明该菌株可以修复被异丙甲草胺污染过的土壤。本发明为异丙甲草胺污染过的土壤修复提供了新的菌源，以为生物降解土壤中异丙甲草胺，实现土壤修复提供了新方向。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为菌株a
21
的菌落形态；
21.图2为菌株a
21
的显微形态；
22.图3为依据菌株a
21
的16s rdna构建的进化树；图中编号2021-16-2即为菌株a21；
23.图4为发酵温度对菌株a
21
菌数及降解率的影响；
24.图5为发酵时间对菌株a
21
菌数及降解率的影响；
25.图6为摇床转速对菌株a
21
菌数及降解率的影响；
26.图7为初始ph对菌株a
21
菌数及降解率的影响；
27.图8为装瓶量对菌株a
21
菌数及降解率的影响；
28.图9为发酵温度vs初始ph的3d响应面曲线图；
29.图10为发酵温度vs摇床转速的3d响应面曲线图；
30.图11为发酵温度vs瓶装量的3d响应面曲线图；
31.图12为初始ph vs摇床转速的3d响应面曲线图；
32.图13为初始ph vs瓶装量的3d响应面曲线图；
33.图14为摇床转速vs瓶装量的3d响应面曲线图；
34.图15为菌株a
21
对土壤中异丙甲草胺的降解率。
具体实施方式
35.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
36.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
37.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
38.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
39.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
40.实施例1
41.1、供试土壤
42.土壤采集自辽宁省喀左县，为长期施用异丙甲草胺的玉米田表层土(0～20cm)，经风干、除杂、磨碎后，过2mm筛，装入封口袋中于4℃冰箱保存。
43.2、培养基
44.无机盐培养基：k2hpo
4 1.6g，kh2po
4 0.4g，mgso4·
7h2o 0.4g，nacl 0.1g，葡萄糖
3g，异丙甲草胺0.1g，定容至1000m l，ph调至中性(7.0)，121℃高压灭菌30min。
45.lb培养基：胰蛋白胨10g，nacl 10g，酵母浸粉5g，蒸馏水1000ml，ph 7.2，121℃灭菌30min。
46.lba培养基：胰蛋白胨10g，nacl 10g，酵母浸粉5g，蒸馏水1000ml，ph 7.2，琼脂粉15g，121℃灭菌30min。
47.3、分离筛选菌株
48.从上述处理好的土壤样品中称取5g，并将其加入到含有100ml/l异丙甲草胺的100ml无机盐培养基中，32℃、180r/min振荡培养3d。从3d后的发酵液中吸5ml接种到100ml新的无机盐培养基中，此时培养基中异丙甲草胺浓度为200ml/l，按照相同的培养方法并依次增加异丙甲草胺的浓度(300、400、500ml/l)，连续富集15d后培养结束。将最终富集到的培养液分别稀释10-2
、10-3
、10-4
、10-5
和10-6
倍，涂布在含有100ml/l异丙甲草胺的无机盐固体培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养，3d后从平板上挑取长势好的菌落进行纯化。选择降解效果最好的细菌菌株a
21
作为试验目标菌株。
49.4、菌株鉴定结果
50.4.1菌落形态及显微镜形态
51.菌落形态：菌落边缘整齐，乳白色，略有凸起，表面光滑，见图1。
52.显微镜形态：粗杆菌，两端平，见图2。
53.4.2生理生化
54.将纯化好菌株a21，参照《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定。生理生化结果见表1。
55.表1生理生化结果
[0056][0057]
4.3分子生物学鉴定结果
[0058]
16s rdna序列比对及系统发育分析：用细菌16s rdna的引物，即上游引物f(seq id no：1)：5
′‑
cagagtttgatcctggct-3，下游引物r(seq id no：2)：5
′‑
aggaggtgatccagccgca-3，进行16srdna的扩增。
[0059]
扩增体系为：rtaq酶(5u/μl)12.5μl，上游引物和下游引物(2.5μmol/l)各1μl，模板dna 2μl，最后加双蒸水至50μl，混合后瞬间离心，置于pcr仪上98℃变性3min，然后98℃
变性25s，55℃退25s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min反应结束。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观察并拍照记录结果。委托美吉生物公司进行测序。将测序结果输入genbank进行同源性分析，利用mega、clustal等软件进行比对，构建进化树，重复次数为1000次。进化树如图3所示，结合生理生化实验结果显示a
21
为假单胞菌(pseudomonas fredenkscergensis)。
[0060]
菌种原始序列seq id no：3为：
[0061]
tggtaaccgtcctcccgaaggttagactagctacttctggtgcaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattactagcgattccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggttttatgggattagctccacctcgcggcttggcaaccctctgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagcccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccttagagtgcccaccataacgtgctggtaactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcaatgttcccgaaggcaccgatccatctctggaaagttcattggatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcaacttaatgcgttagctgcgccactaagagctcaaggctcccaacggctagttgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagtgtcagtatcagtccaggtggtcgccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgctacacaggaaattccaccaccctctaccatactctagcttgtcagttttgaatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatccaacttaacaaaccacctacgcgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgtcggtaacgtcaagacaccaacgtattaggttaatgcccttcctcccaacttaaagtgctttacaatccgaagaccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggctttcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtgactgatcatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgagccattaccccaccaactagctaatccgacctaggctcatctgatagcgcaaggcccgaaggtcccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcgtccgtttccgagcgttatcccccactaccaggcagattcctaggcattactcacccgtccgccgctctcaagagaagcaagcttctctctaccgctcgactgca。
[0062]
上述分离得到的菌株a
21
，即弗雷登克塞尔根假单胞菌(pseudomonas fredenkscergensis)已于2023年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.26782。
[0063]
实施例2菌株a
21
降解异丙甲草胺发酵条件优化
[0064]
1、发酵温度对菌株a
21
菌数及降解率的影响
[0065]
将菌株a21用接种环接种于无机盐培养基，分别设培养温度为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，于180rpm振荡培养48h后测发酵液中a
21
菌数和异丙甲草胺降解率。
[0066]
结果如图4所示，在温度为30℃时菌株a
21
的菌数和降解率达到最高，分别是90.9
×
108cfu/ml和92.5％。
[0067]
2、发酵时间对菌株a
21
菌数降解率的影响
[0068]
将菌株a21接种到培养基中，于32℃、180rpm条件下分别培养24h、36h、48h、60h、72h、84h后，测发酵液中菌株a
21
菌数(平板菌落计数法)和异丙甲草胺降解率。
[0069]
结果如图5所示，在时间为48h时菌株a
21
的菌数和降解率达到最高，分别是90.1
×
108cfu/ml和92.8％。
[0070]
3、摇床转速对菌株a
21
菌数降解率的影响
[0071]
设定摇床转速分别为140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm于32℃培养48h后，测发酵液中菌株a
21
菌数和异丙甲草胺降解率。
[0072]
结果如图6所示，在转速为180rpm时菌株a
21
的菌数和降解率达到最高，分别是90.3
×
108cfu/ml和92.1％。
[0073]
4、初始ph对菌株a21菌数及降解率的影响
[0074]
设定培养基初始ph分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，于32℃、180rpm培养48h后测发酵液中a
21
菌数和异丙甲草胺降解率。
[0075]
结果如图7所示，在ph为6时a
21
的菌数和异丙甲草胺降解率达到最高，分别是87.1
×
108cfu/ml和92.2％。
[0076]
5、装瓶量对菌株a
21
菌数及降解率的影响
[0077]
分别按照60ml、80ml、100ml、120ml、140ml、160ml装瓶，于32℃、180rpm培养48h后，测发酵液中菌株a
21
菌数和异丙甲草胺降解率。
[0078]
结果如图8所示，在装瓶量为100ml时菌株a
21
的菌数和异丙甲草胺降解率达到最高，分别是88.5
×
108cfu/ml和91.6％。
[0079]
6、box-behnken响应面试验
[0080]
根据单因素试验结果，选取对菌株a
21
降解异丙甲草胺影响显著的因素水平，以降解率为响应值，通过design-expert 8.0.6软件设计4因素3水平box-behnken响应面试验，具体方案如表2所示，以异丙甲草胺降解率为响应值，运用box-benhnken设计29组试验，box-benhnken试验设计及结果，见表2。
[0081]
表2box-benhnken试验设计及结果
[0082]
[0083][0084]
对异丙甲草胺降解率进行二次多元回归方程拟合，得到各因素与响应值之间函数关系的回归方程，根据生成响应面图确定最优的发酵条件。
[0085]
用design-expert 8.0.6软件对表2的异丙甲草胺降解率结果进行二次多元回归拟合，得到各因素与响应值之间函数关系的回归方程，根据生成响应面图确定最优的发酵条件。
[0086]
回归方程为：y＝+93.66+2.85*a+7.18*b+3.38*c+4.68*d-6.45*a*b-3.75*a*c-3.05*a*d-0.85*b*c-1.33*b*d+0.30*c*d-7.40*a
2-6.24*b
2-1.53*c
2-10.26*d2。
[0087]
表3方差分析
[0088]
[0089][0090]
该模型的决定系数r2＝0.9719，校正决定系数a
djr2
＝0.9438，说明试验的实际值和预测值拟合度比较好。由表3可以看出，从对降解率的影响来看，一次项a、b、c、d对降解率的影响均达到极显著水平，影响顺序为b＞d＞c＞a，即：初始ph＞装瓶量＞摇床转速＞发酵温度。
[0091]
7、响应面交互作用分析
[0092]
通过design-expert8.0.6软件，做出两因素之间交互作用的3d响应面曲线图见图9-图14。图9、图11和图14曲面倾斜度比较大，且越接近曲面顶端时，颜色愈深，表示变化越急剧，作用越明显，说明相关两因素间交互作用显著。而图10、图12和图13中曲面的变化相对平缓，说明相关两因素间交互作用不明显。
[0093]
实施例3土壤中异丙甲草胺降解率的测定
[0094]
1、异丙甲草胺含量的测定
[0095]
按照异丙甲草胺检测试剂盒步骤进行。
[0096]
土壤样品处理方法如下：
[0097]
(1)在一个60ml的塑料瓶中，称取10g土壤样品(室温阴干)；
[0098]
(2)加入30ml样品提取液(样品提取液为含75％甲醇的水溶液，如：30ml甲醇+10ml水)，把盖拧紧；
[0099]
(3)剧烈震荡均匀，低速离心30min；
[0100]
(4)室温放置过夜以便样品中的异丙甲草胺充分溶于提取液中；
[0101]
(5)剧烈震荡30min，静置10min；
[0102]
(6)取1ml上清液于试管中；
[0103]
(7)用样品稀释液稀释上述上清液(50倍稀释)，即1ml上清液+49ml样品稀释液。
[0104]
2、降解菌株a
21
的土壤修复试验
[0105]
将风干土壤过筛，制成异丙甲草胺浓度为50ml/kg的污染土壤。试验共设一个处理和一个对照，分别用土样500g，分别设3个重复。污染土壤中接入50ml浓度为1
×
108cfu/ml的菌株a
21
发酵液(上述最优条件下制备的发酵液)，对照组中接入50ml没接菌的培养基。在室温下培养，按照恒重法定期补无菌水，分别于培养的第7d、14d、21d、28d、35d取样，测定土壤中异丙甲草胺含量计算降解率。
[0106]
从图15可以看出，随着培养时间不断延长，土壤中异丙甲草胺的降解率在不断增加，第35天降解率达到82.1％。添加培养基的对照组中也有一部分的异丙甲草胺被降解，这可能是土壤中土著微生物的作用以及光解或水解等作用造成的。此结果充分说明菌株a
21
可以修复被异丙甲草胺污染过的土壤。
[0107]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种弗雷登克塞尔根假单胞菌(pseudomonas fredenkscergensis)，其特征在于，该菌已于2023年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26782。2.一种如权利要求1所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌在制备降解异丙甲草胺的微生物制剂中的应用。3.一种微生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌。4.一种如权利要求1所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌在制备土壤修复剂中的应用。5.一种土壤修复剂，其特征在于，包含权利要求1所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌。6.一种发酵培养权利要求1所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌的方法，其特征在于，包括将所述弗雷登克塞尔根假单胞菌接种lb培养基，经发酵培养获取发酵液的步骤。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为26-36℃，发酵时间为12-84h，转速为120-220rpm，初始ph值为5-7。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为30℃，发酵时间为48h，转速为180rpm，初始ph值为6。9.如权利要求1所述的弗雷登克塞尔根假单胞菌、权利要求3所述的微生物制剂或者权利要求5所述的土壤修复剂在土壤修复中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为应用于异丙甲草胺污染的土壤修复中。

技术总结
本发明公开了一种弗雷登克塞尔根假单胞菌及其应用，属于微生物领域。该菌已于2023年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26782。通过实验发现，该菌株在添加100mL/L的异丙甲草胺的基础盐培养基中培养48h，降解率达到93.9％，该菌株对除草剂异丙甲草胺有高效降解能力；施用该菌株发酵液于含异丙甲草胺的土壤中处理35d，降解率达到82.1％，充分说明该菌株可以修复被异丙甲草胺污染过的土壤。的土壤。的土壤。


技术研发人员：刘晓辉 于淼 李杨 敖静 高晓梅 孙玉禄 宋立群 朱正威 池景良
受保护的技术使用者：辽宁省微生物科学研究院
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/13