一种外源色氨酸在增强枸杞抗热性中的应用

1.本发明涉及植物培育技术领域，具体涉及一种外源色氨酸在增强枸杞抗热性中的应用。


背景技术：

2.温度是影响作物生长发育和农艺性状的主要环境因素。由于目前全球平均气温的变化趋势，提高植物的耐热性正成为未来农业日益不可或缺的特性。
3.枸杞为茄科(solanaceae)、枸杞属(lycium)植物，多分枝灌木植物，又称地骨皮、苟起子、血杞子等。世界约有80种枸杞属植物，我国发现的枸杞属植物有7个种和3个变种，约占全球枸杞资源的1/8。宁夏枸杞在中国栽培面积最大，主要分布在中国西北地区。常生于山坡、荒地、丘陵地、盐碱地、路旁及村边宅旁。枸杞具有很高的药用及食疗价值，能抵抗干旱和盐胁迫，是治理土壤沙漠化且具有极具开发潜力的重要植物资源。
4.枸杞喜冷凉气候，耐寒力很强，其开花最适宜温度为17～22℃，果实发育最适温度为20～25℃，高温缩短了以夏果为主的产量形成期，使花蕾的分化停止，果实生长加速成熟集中，树体养分供应失调，形成小果，采收间距缩短，使树体提前进入夏眠期，尤其是在幼果生长期不耐高温，会缩短幼果生长时间，加重植株营养供应负担，果实变小，产量降低，严重影响农业产量。
5.色氨酸(tryptophan,trp)又名β-吲哚-α-氨基丙酸，植物体内的l-trp不仅参与了蛋白质合成与分解，还是生长素、褪黑素等重要活性物质合成的前体物质。现已知l-trp在提高某些胁迫下作物的生长和产量有着显著作用，比如盐胁迫、干旱胁迫、金属镉胁迫，加强植物对不良环境的适应性，但是目前未见trp在提高植物温度适应性方面的报道，并且外源trp在抗热性下枸杞的生长和耐热性的研究至今未被报道过。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是解决目前宁夏枸杞植株本身抵抗抗热性能力差的问题。目的在于提供一种外源色氨酸在增强枸杞抗热性中的应用，能够明显提高枸杞抵抗抗热性的能力。
7.本发明通过下述技术方案实现：
8.一种外源色氨酸在增强枸杞抗热性中的应用，所述抗热性中的温度为35～50℃。
9.采用上述技术方案的情况下，外源色氨酸能够明显缓解由于高温导致枸杞幼苗在生长发育过程中叶片卷曲黄化、生长抑制以及氧化损伤问题，具体为提供增强抗热相关基因的表达，解决枸杞因高温引起的生长抑制和伤害问题。
10.作为一种可能的设计，所述抗热性中的温度为40℃。
11.作为一种可能的设计，所述色氨酸以其溶液在枸杞植株种植过程中施加，色氨酸溶液的浓度为40～60μmol/l。在该浓度下，缓解效果明显。
12.作为一种可能的设计，所述色氨酸溶液的浓度为50μmol/l。
13.作为一种可能的设计，所述色氨酸溶液的溶剂为非离子表面活性剂的体积浓度为0.01％～0.2％。非离子表面活性剂促进枸杞植株吸收外源色氨酸，从而在达到相同效果的情况下减少外源色氨酸的用量，节约成本。
14.作为一种可能的设计，所述色氨酸溶液喷施于所述枸杞植株上和/或浇灌于种植枸杞植株的基质中。
15.作为一种可能的设计，所述枸杞植株为枸杞幼苗。
16.作为一种可能的设计，所述色氨酸溶液的喷施次数或浇灌次数为1～3次，相邻两次喷施时间间隔24h，耐热性处理的时间为7天。
17.作为一种可能的设计，所述色氨酸为l-色氨酸。
18.作为一种可能的设计，所述色氨酸缓解所述抗热性导致的叶片卷曲黄化、生长抑制以及氧化损伤。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
20.图1为本发明实施例中水培体系构建图；
21.图2为本发明实施例中外源色氨酸对“宁杞7号”枸杞幼苗耐热表型的影响图；
22.图3为本发明实施例中抗热性下枸杞幼苗trp含量变化趋势图；
23.图4为本发明实施例中抗热性下“宁杞7号”枸杞幼苗mda含量变化图；
24.图5为本发明实施例中抗热性下“宁杞7号”幼苗叶片o2·-和h2o2的影响图；
25.图6为本发明实施例中抗热性下“宁杞7号”枸杞幼苗热激转录因子基因表达变化图。
具体实施方式
26.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
27.本发明发明人在研究影响枸杞果实大小和产量时发现高温缩短了以夏果为主的产量形成期，使花蕾的分化停止，果实生长加速成熟集中，树体养分供应失调，形成小果，采收间距缩短，使树体提前进入夏眠期。尤其是在幼果生长期不耐高温，会缩短幼果生长时间，加重植株营养供应负担，果实变小，产量降低，严重影响农业产量。
28.本发明中，前述“高温”是指温度为35～50℃。
29.为了解决高温环境带来的前述影响，使得果实增大的同时提高果实的产量，本发明发明人在知晓了l-色氨酸能够提高植株的盐胁迫能力、干旱胁迫能力以及金属镉胁迫能力的情况下，研究l-色氨酸能够提高枸杞的高温胁迫能力，惊奇地发现对枸杞植株采用外源色氨酸预处理能显著提高其的抵抗高温胁迫能力，缓解抗热性导致的叶片卷曲黄化、生长抑制以及氧化损伤。
30.本发明中，前述“抗热性”是指在某一温度范围或某一温度下的耐热性能，本发明中某一温度范围为35～50℃。一般情况下，抗热性的测试条件为40℃。
31.本发明中，前述“外源色氨酸”是指外部向植株施加的色氨酸，区别于内源色氨酸(植株自身合成的)，色氨酸的具体种类一般为l-色氨酸。
32.本发明中，由于色氨酸施加于枸杞植株的量很少，给直接施加带来难度，因此一般将其和溶剂混合形成色氨酸溶液来使得色氨酸具有较低的浓度，而便于施加。
33.其中，色氨酸溶液的浓度为40～60μmol/l，优选50μmol/l。
34.溶剂一般为含有非离子表面活性剂的水溶液，非离子表面活性剂可以为本领域常规物质，例如吐温－20、吐温－60以及吐温－80等等。水溶液中非离子表面活性剂的体积浓度一般为0.01％～0.2％，优选0.1％。
35.本发明中，色氨酸溶液可以采用喷洒或浇灌的方式；喷洒主要是喷洒于枸杞植株的叶片上，以枸杞叶片滴水为标志停止。
36.本发明中，色氨酸溶液喷洒2次，两次之间的时间间隔一般为24h。抗热性处理7d。
37.实验例
38.1.枸杞抗热研究水培体系的构建
39.本实施例所用“宁杞7号”(l.barbarum)种子于2022年8月采自宁夏农林科学学院枸杞种质资源圃(北纬38
°
38
′
82
″
,西经106
°9′
18
″
)。种子采集后人工去除果肉，漂洗干净，自然风干，储存于4℃冰箱。挑选饱满且大小均一的枸杞种子，蒸馏水浸泡30min后，用75％酒精冲洗45s，之后用次氯酸钠：蒸馏水＝1：3消毒后，冲洗4～5次，播种于ms培养基(ms培养基4.74g/l，蔗糖30g/l，琼脂粉6.5g/l)。置于培养间，25℃，光周期16h/8h，待其生长两周后(图1中a图)，选取长势一致的种子苗，移入24孔水培种植箱中(图1中b图)，生长过程中每间隔7d更换一次水培营养液(hoagland modified nutrient salts，试剂购买于北京酷来搏科技有限公司，nsp1020改良型霍格兰营养液)，保持通氧，培养三周后对水培苗进行高温处理。
40.2.枸杞水培苗处理及取样
41.选取长势良好且基本一致的“宁杞7号”水培苗，实验前一晚对其叶面喷施l-trp，以枸杞叶片滴水为标志停止。所设置的l-trp的浓度为50μmol/l+0.1wt％吐温-20，蒸馏水+0.1wt％吐温-20为对照处理，喷施后于第二天中午10:00将水培苗移入培养箱中进行高温处理，高温条件为：40℃昼夜，空气相对湿度65％，光周期16h/8h，昼夜相对光照强度100％/0％。胁迫1d、3d，后取顶叶下2～5片健康叶片开展试验。在处理前和处理结束时进行生长状况的观察并拍照。
42.取样时，为保证结果的准确性并减少误差，选取植株中部位置叶片，每份样品选择长势一致的材料混匀，设3个生物学重复。
43.3.试验方法
44.3.1叶片中色氨酸含量测定
45.标准物质的配制：配制0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml以及10000ng/ml的标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标品浓度(concentration ratio)为横坐标，峰面积比(area ratio)为纵坐标，绘制标准曲线。
46.3.2色谱质谱条件：数据采集仪器系统为超高效液相质谱联用仪(triple quad5500+qtrap ready)。
47.色谱条件：流动相，a相，超纯水(加入0.04％的甲酸)；b相，乙腈(加入0.04％的甲酸)。样品置于4℃的自动进样器中，流速0.4ml/min，柱温40℃，进样量5μl。梯度洗脱程序：0min a/b为2:98(v/v)，10min a/b为98:2(v/v)，11min a/b为98:2(v/v)，11.1min a/b为2:98(v/v)，13min a/b为2:98(v/v)。
48.质谱条件：电喷雾离子源(electrospray ionization，esi)温度550℃，正离子模式下质谱电压5500v，负离子模式下质谱电压－4500v，气帘气(curtain gas，cur)35psi。在q-trap6500+中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declustering potential，dp)和碰撞能(collision energy，ce)进行扫描检测
49.3.3植物激素的提取：取出超低温保存的生物样本，称取100mg研磨后的样本粉末，用1ml甲醇/水/甲酸(15:4:1,v/v/v)4℃过夜提取。离心后取上清液，氮吹吹干后用400μl 80％甲醇/水溶液复溶，过0.22μm滤膜，置于进样瓶中，用于lc-ms分析。
50.3.4含量测算：将检测到的样本峰面积比值代入标准曲线线性方程进行计算，进一步带入公式计算，最终得到实际样本中该物质的绝对含量数值。
51.样本中激素的含量(ng/g)＝c
×
v/1000/m
52.公式中各字母含义：
53.c：样本中积分峰面积比值代入标准曲线得到的浓度值(ng/ml)；
54.v：复溶时所用溶液的体积(μl)；
55.m：称取的样本质量(g)。
56.3.5丙二醛(mda)含量测定：mda含量采用硫代巴比妥酸法(tba法)，使用南京建成a003-1试剂盒。
57.3.6植物组织中过氧化氢(h2o2)和超氧阴离子(o2·-)的组织化学定位
58.o2·-：叶片浸入在0.5mm nbt、10mm磷酸盐缓冲液中(ph 6.4)中，使叶片完全浸入液体中，将其置于暗处，25℃反应4h以上。之后将叶片置于固定液中(乙醇：乳酸：甘油＝4:1:1)，90℃保温，直至叶片褪色，拍照。
59.h2o2：叶片浸入在1mg/ml dab溶液中(ph 3.8)，使叶片完全浸入液体中，将其置于暗处，25℃反应5～6h以上，直至棕色沉淀出现。之后将叶片置于固定液中，90℃保温，直至叶片褪色，拍照。
60.3.7qrt-pcr
61.(1)枸杞叶片总rna提取：使用天根公司rnaprep pure多糖多酚植物总rna提取试剂盒提取枸杞叶片rna。
62.(2)反转录cdna：使用天根公司fastking cdna第一链合成试剂盒反转录cdna,根据制造商的说明书指导,将模板rna在冰上解冻；5
×
gdna buffer、fq-rt primer mix、10
×
king rt buffer、rnase-free ddh2o在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。按表5.1配制去除基因组dna反应体系,混匀后简短离心，42℃反应3min。按照表5.2配制cdna反转录体系,将去除gdna的反应体系与配制好的反转录mix相混合,充分混匀后简短离心。42℃反应15min,95℃反应3min后即可得到cdna溶液。
63.表1.gdna去除反应体系
64.组成成分使用量5
×
gdnabuffer2μltotalrna-rnase-freeddh2o补足到10μl
65.表2.反转录反应体系
66.组分使用量10
×
kingrtbuffer2μlfastkingrtenzymemix1μlfq-rtprimermix2μlrnase-freeddh2o补足到10μl
67.(3)qrt-pcr检测：参照天根公司rt-qpcr试剂盒说明书进行试验,并在cfx96实时pcr检测系统(bio-rad)上检测。定量pcr反应体系按表3加入，定量pcr引物如表4所示。
68.表3.荧光定量pcr反应体系
[0069][0070]
按照如下反应程序进行试验:
[0071]
反应程序:
[0072][0073]
根据2
‑△△
ct
法计算相对基因表达。相对表达水平表示为三次重复的平均值
±
sd。
[0074]
表4荧光定量pcr引物序列
[0075][0076][0077]
3.8数据处理：采用microsoft excel 2021进行数据处理，origin 2023软件进行绘图，在spss 26软件中采用单因素方差分析(one-way anova)进行各处理间的差异显著性分析，采用duncan’s新复极差法进行多重比较。图表中所有数据均为3个重复的平均值
±
标准差(mean
±
sd)。
[0078]
由图2可知，图2中上面三盆是在25℃下生长时间相同的枸杞幼苗正常生长，左下那一盆也是在25℃下生长，但是生长时间和40℃的时间相同，下面中间那一盆仅在40℃下生长，即未施加了色氨酸，右下和下面中间那一盆的区别为：施加了色氨酸；由图2可知，经过高温胁迫后植株明显受到损伤(下面中间那一盆)，出现叶片卷曲黄化脱落、植株萎蔫、生长缓慢甚至死亡的现象，喷施前述配制色氨酸溶液(右下那一盆)，生长情况得到改善，枸杞幼苗虽然生长缓慢(和左下那一盆相比)，但损伤情况明显减弱。
[0079]
由图3可知，随着时间的延长，受到抗热性时枸杞幼苗色氨酸含量发生明显变化，对照组的枸杞在抗热性1h和3h与0h相比，色氨酸含量均显著下降，而抗热性24h时，实验结果显示色氨酸含量显著上升。这说明在枸杞在抵抗抗热性时色氨酸可能发挥者至关重要的作用。
[0080]
由图4可知，在外施l-trp后，宁杞7号的mda含量相比较高温对照组低，整体呈上升趋势，其中在高温处理1d，trp处理组低于高温对照组30.9％，高温处理3d，trp处理组低于高温对照组128.3％。
[0081]
由于植物在受到抗热性后，发生氧化胁迫，从而使得植株受损，枸杞幼苗中o2·-和h2o2积累增多。在未受到抗热性时植株叶片除了使用双面刀片切叶柄留下的伤口处有蓝色染色外，整个叶片几乎为白色，说明取样时未对叶片造成伤害而影响染色。氮蓝四唑(nbt)可以与超氧阴离子发生反应并形成蓝色的深浅程度来反应某部位受损程度。从图5可以看
出，宁杞7号叶片在抗热性过程中蓝色斑块逐渐变大，颜色也逐渐变深，但经l-trp处理后的枸杞幼苗染色较浅，说明经过施加外源色氨酸能够降低抗热性下幼苗中o2·-的含量，从而缓解有利于缓解抗热性导致的氧化。
[0082]
二氨基联苯胺(dab)染色可与植株产生的h2o2聚合反应生成深棕色物质根据颜色深浅判断h2o2的积累量和植物的受损情况，颜色越深，h2o2的积累量越多，植物受损越严重。由图5可知，l-trp处理组相较于高温对照组染色较浅，说明施加外源l-trp后枸杞幼苗中h2o2含量降低，有利于缓解抗热性导致的氧化，由此可知，经l-trp处理后，抗热性对枸杞幼苗造成的损伤有所缓解。
[0083]
枸杞幼苗中抗热相关基因(主要有lba04g00318、lba12g00428、lba09g01174、lba03g00940)相对表达水平印证了同样的结果。如图6所示，图6中a、b、c和d分别-为“宁杞7号”幼苗抗热性下lba04g00318、lba12g00428、lba09g01174和lba03g00940基因的相对表达水平，40℃抗热性处理三天导致对照组中的枸杞幼苗热激转录因子基因的相对表达量有所下调，但经l-trp处理后热激转录因子的表达量大幅度上升。该结果表示，l-trp可以减轻枸杞幼苗在抵抗抗热性过程中受到的损伤。
[0084]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种外源色氨酸在增强枸杞抗热性中的应用，其特征在于，所述抗热性中的温度为35～50℃。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗热性中的温度为40℃。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述色氨酸以其溶液在枸杞植株种植过程中施加，外源色氨酸溶液的浓度为40～60μmol/l。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述色氨酸溶液的浓度为50μmol/l。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述色氨酸溶液的溶剂为非离子表面活性剂体积浓度为0.01％～0.2％。6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述色氨酸溶液喷施于所述枸杞植株上和/或浇灌于种植枸杞植株的基质中。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述枸杞植株为枸杞幼苗。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述色氨酸溶液的喷施次数或浇灌次数为1～3次，相邻两次喷施时间间隔24h。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述色氨酸为l-色氨酸。10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述色氨酸缓解所述抗热性导致的叶片卷曲黄化、生长抑制以及氧化损伤。

技术总结
本发明公开了一种外源色氨酸在增强枸杞抗热性抵抗性能中的应用，抗热性的温度为35～50℃，外源色氨酸能够明显缓解由于高温导致枸杞幼苗在生长发育过程中叶片卷曲黄化、生长抑制以及氧化损伤问题，具体为增强抗热相关基因的表达，解决枸杞因高温引起的生长问题。解决枸杞因高温引起的生长问题。解决枸杞因高温引起的生长问题。


技术研发人员：慕自新 陈琰 秦垦 秦小雅
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/13