一株pH耐受性提高的东方伊萨酵母及其在低pH发酵中的应用的制作方法

一株ph耐受性提高的东方伊萨酵母及其在低ph发酵中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株ph耐受性提高的东方伊萨酵母及其在低ph发酵中的应用。


背景技术：

2.琥珀酸，学名丁二酸，是一种重要的c4平台化合物。作为合成通用化学品的起始原料，琥珀酸在食品、化学、医药以及其他领域有广泛的应用，琥珀酸被美国能源部列为12种最有潜力大宗生物基化学品中的首位。
3.琥珀酸的传统生产方法是化学合成法，主要有石蜡氧化法、氯乙酸甲酯氰化水解法和五氧化二钒催化加氢法等，但由于石油资源的减少和环境污染日益严重等问题，化学合成方法的弊端日益显现。而通过发酵法生产琥珀酸，能够摆脱对不可再生的战略资源石油的依赖，利用可再生资源，固定二氧化碳减轻温室效应，展现出良好的发展前景。目前研究较多的产琥珀酸的菌种有：产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌等。但大多数细菌菌株需要接近中性ph环境才能获得最佳的发酵性能，琥珀酸发酵时会产生大量有机酸，而有机酸的积累会对菌株造成一定的毒性，从而抑制菌株的生长和生产。常用的手段是在发酵时加入中和添加剂以使发酵环境保持中性。目前固体碳酸镁被认为是最有利于丁二酸发酵的中和添加剂，其会与发酵产物反应形成琥珀酸盐，而琥珀酸碱式盐后续复杂繁冗的分离纯化过程一直是阻碍其大规模生产的难题。因此，如何实现在不添加中和剂的情况下进行发酵对琥珀酸的生产具有重要意义。
4.真核生物如酿酒酵母、解脂耶氏酵母等具有高渗透压的特点，同时可以进行低ph的生物发酵，除去菌体后的发酵液可以直接蒸发结晶，这使产物的下游处理成本大大降低。但酿酒酵母、解脂耶氏酵母等在ph值为4以下时，基本无法生长，而东方伊萨酵母在ph略低于4时仍可生长，因此以东方伊萨酵母作为出发菌株发酵生产酸性物质更具潜力，但目前关于东方伊萨酵母低ph发酵的报道并不多。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一株具有低ph耐受性的东方伊萨酵母，在ph2的条件下仍具有较高的生长活性，且在有机酸的发酵生产中表现优异，为东方伊萨酵母的低ph发酵及后续改造奠定了基础。
6.本发明的第一个目的是提供一株ph耐受性提高的东方伊萨酵母，命名为东方伊萨酵母(issatchenkia orientalis)a2，已于2023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.27045。
7.本发明的第二个目的是提供上述ph耐受性提高的东方伊萨酵母在生物、食品领域中的应用。
8.本发明的第三个目的是提供一种包含上述ph耐受性提高的东方伊萨酵母的组合物。
9.进一步地，所述组合物的形式包括但不限于固态菌剂、液态菌剂等。
10.本发明的第四个目的是提供一种酸性物质发酵生产的方法，应用上述东方伊萨酵母进行发酵生产。
11.进一步地，所述酸性物质包括但不限于有机酸。
12.进一步地，所述有机酸包括但不限于丁二酸。
13.进一步地，发酵生产体系中无需添加ph调节剂。
14.本发明的第五个目的是提供一种无需ph调节剂能够高效生产丁二酸的东方伊萨酵母，以上述ph耐受性提高的东方伊萨酵母为出发菌，敲除了乙酰辅酶a水解酶编码基因，过表达了琥珀酰-coa合成酶和/或延胡索酸还原酶。
15.进一步地，乙酰辅酶a水解酶编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
16.进一步地，琥珀酰-coa合成酶编码基因的核苷酸序列编号为genebank:m86746.1。
17.进一步地，延胡索酸还原酶编码基因的核苷酸序列编号为genebank:kt026107.1。
18.进一步地，在本发明的下述实施例中，均过表达了一个拷贝的琥珀酰-coa合成酶和延胡索酸还原酶，当然本领域技术人员可知，在丁二酸的代谢改造过程中，可根据实际需要强化表达至少一个拷贝数的合成途径相关酶。
19.本发明的第六个目的是提供上述东方伊萨酵母在制备丁二酸或含丁二酸产品中的应用。
20.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
21.本发明提供了一株能够耐受低ph的东方伊萨酵母，在ph为2下生长活性较好，在培养24h后od
600
接近12。在发酵过程中，无需添加ph中和剂，在酸性条件下即可生长并高效生产酸性物质，有利于在不影响生产菌的基础上实现产物的高浓度积累，同时为东方伊萨酵母的后续改造奠定了基础。
22.生物材料保藏
23.东方伊萨酵母(issatchenkia orientalis)a2，所述东方伊萨酵母(issatchenkia orientalis)a2已于2023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27045，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
24.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
25.图1为本发明东方伊萨酵母a2在不同ph下的生长情况。
具体实施方式
26.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
27.下述实施例中涉及的材料如下：
28.菌种与质粒：大肠杆菌fast t1感受态细胞，质粒pbluescript ii sk(-)(购买自stratagene)，jmp114(构建见文献(fickers et al.,2003))。
29.lb培养基为：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，nacl 1％。
30.ypg：酵母粉，1％；蛋白胨，2％；甘油，2％；若为固体培养基则加入2％琼脂粉。
31.ynbg：ynb，0.67％；甘油，2％。
32.下述实施例中涉及的检测方法如下：
33.发酵液中的葡萄糖和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(hplc)分析。检测条件为：色谱柱为hpx-87h(biorad labs,300mm
×
7.8mm)，检测器为示差折光检测器rid-10a，柱温为60℃，流动相为2.5mm h2so4溶液，流速为0.6ml/min。
34.实施例1菌株的筛选
35.土壤来源于酿酒厂附近，采用稀释平板分离法。土壤用无菌水浸出，按不同梯度稀释。取不同稀释度的样液各0.1ml分别涂布于不同的分离培养基平板上，30℃培养2d-3d，挑去平板上数量占优势和形态有一定差异的酵母菌落，经进一步划线分离纯化后，对菌株进行编号、保存备用。分离培养基为酵母菌分离培养基：马丁一孟加拉红培养基。
36.将得到的酵母提取基因组后送公司测序。比对后，将分类为东方伊萨酵母的菌株，在ph 2-4的ypd培养基中进行培养。在不同ph下的生长情况如下表。
37.表1筛选所得东方伊萨酵母在不同ph值下的生长情况
[0038][0039]
其中，+表示菌株存活，-表示菌株死亡。
[0040]
从表1的结果看，相对于其余6株菌，2号和8号菌株在ph为2的环境下仍可生长，测定8号菌株在ph为2-4下的od
600
值(见图1)，可见该菌株在ph为2下18h以后的生长活性逐渐高于在ph为3和ph为4同时段的活性，从而证明该菌株具有较强的耐酸性，将该菌株送保藏。
[0041]
实施例2东方伊萨酵母a2重组菌的构建及发酵
[0042]
1、乙酰辅酶a水解酶(ach)敲除质粒的构建
[0043]
1)同源重组片断的克隆
[0044]
根据ach的基因序列设计上下游片段p和t的引物对：
[0045]
p-f:5'-aggtcgacggtatcgataagcttgaacggtgtacagttac gagc-3'
[0046]
p-r:5'-cctaggatccactagttctagagcgtaggcgtctctcgata ttgt-3’[0047]
t-f:5'-cagcttttgttccctttagtgagggtgatcttgagctactt ggactg-3'
[0048]
t-r:5'-actaaagggaacaaaagctggagctcggttcatacttagc tgttg-3'
[0049]
以东方伊萨酵母的基因组作为模板进行pcr(聚合酶链式反应)体外扩增，利用引物对p-f和p-r获得ach的上游片段，利用引物对t-f和t-r获得ach的下游片段。通过dpni内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片断。
[0050]
2)筛选标记片段ioleu2的克隆
[0051]
引物1:5'-cgctctagaactagtgga-3'
[0052]
引物2:5'-accctcactaaagggaac-3'
[0053]
以质粒jmp114通过pcr(聚合酶链式反应)体外扩增片断。通过dpni内切酶消化后，回收纯化浓缩ioleu2片断。
[0054]
3)载体来源片段的克隆
[0055]
上游引物1:5'-agctccagcttttgttccct-3'
[0056]
下游引物2:5'-tcaagcttatcgataccgtc-3'
[0057]
以质粒pbluescript ii sk(-)通过pcr(聚合酶链式反应)体外扩增载体片断。通过dpni内切酶消化后，回收纯化浓缩线性化载体片断。
[0058]
4)质粒组装
[0059]
3μl线性化pbluescript ii sk(-)片段、4μl上游片段、4μl下游片段、4μl的ioleu2克隆片段与15μl组装反应体系混合后，于50℃反应1h，转化大肠杆菌fast t1感受态细胞，涂布氨苄霉素抗性平板。
[0060]
2、过表达质粒的构建
[0061]
目的基因，结合质粒载体，设计带有同源臂的引物，pcr后产物纯化，测量浓度后使用gibson连接，通过化学法转化至大肠杆菌感受态中，涂kan板后挑取克隆验证，并使用正向引物测序，验证正确后得到对应质粒。
[0062]
1)过表达质粒载体的构建
[0063]
过表达质粒的载体为pki-1，主要包含有一个强启动子uas8b-tef和终止子cyc1、两侧连接lox位点的leu2营养缺陷型基因，其构建步骤为pcr扩增并将启动子uas8b-tef和终止子cyc1融合，随后插入到含有leu2营养缺陷型基因的载体jmp114中。
[0064]
2)目的片段的获得
[0065]
目的片段基因序列，由金唯智进行密码子优化和合成。根据表达质粒pki-1序列设计引物。如表2所示。
[0066]
其中，琥珀酰-coa合成酶基因(scs)来源于酿酒酵母saccharomyces cerevisiae，延胡索酸还原酶基因(frd)来源于布氏锥虫trypanosoma brucei。
[0067]
表2引物序列
[0068][0069]
以合成的基因为模板，使用对应的引物扩增得到携带相应末端同源序列的组装片段，扩增反应体系与条件见表3和表4。
[0070]
表3 2
×
taq pcr扩增反应体系
[0071][0072]
表4 2
×
taq pcr扩增反应条件
[0073][0074]
3)过表达质粒的构建
[0075]
pki-1通过bsp119i内切酶消化后，回收纯化。
[0076]
过表达质粒的构建是利用gibson组装克隆试剂盒将上述载体的酶切片段和目的基因pcr产物连接，构建完成。
[0077]
gibson组装为通过pcr获得具有同源末端序列(15-20bp)的纯化的线性化载体与片段，使用全式金公司购买的-uni seamless cloning and assembly试剂盒进行快速重组，反应体系详见下表。
[0078]
以单片段重组方法为例：
[0079]
克隆载体使用量：[0.02
×
克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)
[0080]
插入片段使用量：[0.04
×
克隆载体碱基对数]ng(0.06pmol)
[0081]
表5gibson组装反应体系
[0082][0083]
反应条件：单片段重组反应，50℃，15min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
[0084]
构得的质粒通过noti内切酶消化后，回收纯化浓缩线性化质粒片段。
[0085]
3、醋酸锂法转化东方伊萨酵母
[0086]
感受态的制备：
[0087]
1)从甘油管取50μl宿主菌液，涂布ypg平板，30℃过夜培养
[0088]
2)刮取适量宿主细胞，重悬悬于1ml te buffer中
[0089]
3)10000rpm离心1min，倒掉上清液
[0090]
4)细胞悬于600μl lithium acetate(0.1m ph 6.0)，30℃水浴、静止培养1h
[0091]
5)3000rpm离心2min，倒掉上清液
[0092]
6)用80-120μl的lithium acetate轻悬细胞。
[0093]
片段转化，筛选重组子
[0094]
1)取40μl感受态细胞，加5μl线性化质粒，加2μl鲑鱼精dna，30℃水浴培养15min
[0095]
2)加350μl peg 4000-lithium acetate(0.1m ph 6.0)及
[0096]
16μl 1m dtt(40mm)，30℃水浴静止培养1h
[0097]
3)加40μl dmso(nearly 10％final)，39℃热击10min
[0098]
4)加600微升lithium acetate(0.1m ph 6.0)，室温放置15min
[0099]
5)取200μl混合液涂布ynbg筛选平板，30℃培养2-3d。
[0100]
6)随机挑选重组子，利用引物进行pcr验证
[0101]2×
taq dna聚合酶：
[0102]
表6 2
×
taq pcr扩增反应体系
[0103][0104]
表7 2
×
taq pcr扩增反应条件
[0105][0106][0107]
4、发酵
[0108]
种子液：冷冻甘油管保存的菌株划线接种于ypg平板，30℃培养30h。
[0109]
发酵：将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的ypg液体培养基的250ml三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。
[0110]
培养液转接到装有50ml发酵培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，6％葡萄糖)的250ml三角瓶中，接种量2％，30℃，200rpm培养24h。发酵结果见下表。
[0111]
表8不同菌株发酵生产丁二酸结果
[0112][0113]
表8中，io-s1相较于出发菌株a1敲除了乙酰辅酶a水解酶基因，减少了丁二酸发酵过程中的乙酸副产物，增加了丁二酸的积累；
[0114]
io-s2相较于出发菌株a1，过表达了酿酒酵母来源的琥珀酰-coa合成酶基因，增强了氧化tca途径的通量，丁二酸的产量较对照菌株io-s1提高了1.25倍；io-s3相较于出发菌株a1，过表达了布氏锥虫来源的延胡索酸还原酶基因，增强了还原tca旁路的碳流量，丁二酸的产量较对照菌株io-s1有一定的提高；
[0115]
并且，在io-s2的基础上过表达布氏锥虫来源的延胡索酸还原酶基因构得的io-s4菌株中，酿酒酵母来源的琥珀酰-coa合成酶基因和布氏锥虫来源的延胡索酸还原酶基因组合应用，产量均高于过表达单个基因的菌株，因此，酿酒酵母来源的琥珀酰-coa合成酶基因和布氏锥虫来源的延胡索酸还原酶基因在提升丁二酸产量上具有意想不到的协同增效作用。
[0116]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变
动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一株ph耐受性提高的东方伊萨酵母，其特征在于：命名为东方伊萨酵母(issatchenkia orientalis)a2，已于2023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.27045。2.权利要求1所述的ph耐受性提高的东方伊萨酵母在生物、食品领域中的应用。3.包含权利要求1所述ph耐受性提高的东方伊萨酵母的组合物。4.一种酸性物质发酵生产的方法，其特征在于：应用权利要求1所述ph耐受性提高的东方伊萨酵母进行发酵生产。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：发酵生产体系中不包括ph调节剂。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述酸性物质为有机酸。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述有机酸包括丁二酸。8.一种无需ph调节剂能够高效生产丁二酸的东方伊萨酵母，其特征在于：以权利要求1所述的ph耐受性提高的东方伊萨酵母为出发菌，敲除了乙酰辅酶a水解酶编码基因，过表达了琥珀酰-coa合成酶和/或延胡索酸还原酶。9.根据权利要求8所述的东方伊萨酵母，其特征在于：所述过表达为导入至少一个拷贝的目的基因。10.权利要求8或9所述的东方伊萨酵母在制备丁二酸或含丁二酸产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一株pH耐受性提高的东方伊萨酵母及其在低pH发酵中的应用，属于生物技术领域。本发明通过筛选从土壤中分离出的东方伊萨酵母，得到一株能够耐受pH2的东方伊萨酵母，命名为东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)A2，已于2023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27045，在发酵过程中无需添加pH中和剂，在低pH下实现了有机酸的高效生产。产。产。


技术研发人员：李承 薛怡芸 姜睿康 李振 张天元
受保护的技术使用者：苏州聚维元创生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/8/13