一种基于ELOVL2基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用

一种基于elovl2基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用
技术领域
1.本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种基于elovl2基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用。


背景技术：

2.剩余采食量(residual feed intake，rfi)被定义为在给定体重和体增重的情况下，动物实际饲料摄入量和预期饲料摄入量之间的差值，因此rfi的数值越大，相对的饲料效率也越低，近些年，越来越多的育种工作者开始采用rfi作为衡量饲料效率的主要指标，并且随着时代发展，这种趋势越来越明显，这是因为使用rfi来进行选育不仅能考虑到日增重和代谢体重，而且对于上市体重等重要经济性状的影响也比较微弱，并且rfi的遗传力在0.2～0.4(chen c，su z，li y，et al.estimation of the genetic parameters of traits relevant to feed efficiency：result from broiler lines divergent for high or low abdominal fat content[j].poult sci，2021，100(2)：461-466；zhang y，guo z b，xie m，et al.genetic parameters for residual feed intake in a random population of pekin duck[j].asian-australas j anim sci，2017，30(2)：167-170.)，属于中等遗传力性状，因此可以使用rfi作为育种时的饲料效率衡量指标。
[0003]
超长链脂肪酸延伸酶2(elovl2)是elovl延伸酶家族成员，elovl家族在长链多不饱和脂肪酸的延伸反应中起重要作用，zhao等对生猪饲料效率进行研究，从约克夏猪肝脏中鉴定了300个转录本，发现猪高低饲料转化率组elovl2基因表达差异显著(zhao y，hou y，liu f，et al.transcriptome analysis reveals that vitamin a metabolism in the liver affects feed efficiency in pigs[j].g3(bethesda)，2016，6(11)：3615-3624.)；zhang等对不同剩余采食量湖羊肝脏长非编码核糖核酸的转录组进行分析，发现elovl2基因在不同rfi的湖羊肝脏中差异表达，并且发现elovl2基因与能量代谢有关，elovl2基因主要功能是调控动物体内脂肪酸合成和脂肪沉积，转录组学分析表明rfi与脂质代谢相关基因的表达水平显著相关，脂肪沉积会消耗能量降低饲料利用率(zhang d y，zhang x x，li g z，et al.transcriptome analysis of long noncoding rnas ribonucleic acids from the livers of hu sheep with different residual feed intake[j].animal，2021，15(2)：100098.)。
[0004]
因此elovl2基因可能是影响鸭饲料效率的重要候选基因，目前elovl2基因研究主要集中在小鼠、鱼类和人，家禽方面研究较少，研究内容主要集中在脂肪酸调控和脂质沉积方面，深入研究elovl2基因变异与表达对肉鸭饲料转化率的影响及其分子机制，对提高肉鸭的饲料效率降低肉鸭的养殖成本有重要的现实意义。
[0005]“强英鸭”属于白羽肉鸭，历经10年自主培育而成，促进了我国肉鸭品种国产化，“强英鸭”商品代鸭早期生长速度快、饲料转化率高、成活率高，40日龄上市，平均体重3.35kg，平均料重比为1.89：1，基于上述内容，提出一种基于elovl2基因鉴定鸭饲料利用率
性状的分子标记及其鉴定方法和应用。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的就在于提供一种基于elovl2基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用，与现有技术相比，针对于鸭的饲料利用率性状相关的候选基因(elovl2基因)的snp(单核苷酸多态性)分子标记，以解决常规表型育种选育进展缓慢，实现早期鉴定饲料利用率性状这一难题。
[0007]
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
[0008]
一种基于elovl2基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，即所述elovl2基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，所述分子标记为g或a，所述分子标记位于所述核苷酸序列的第480位。
[0009]
一种基于elovl2基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记在鉴定鸭饲料利用率性状中的应用。
[0010]
一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，包括以下步骤：
[0011]
(1)提取鸭翅静脉血液总dna；
[0012]
(2)以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，以所述总dna为模板，利用特异性扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；
[0013]
(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序，获得待测鸭的分子标记类型；
[0014]
(4)根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状。
[0015]
作为本发明的进一步优化方案，所述特异性扩增引物的序列为：
[0016]
seq id no.2：forward primer：ggaacccaccaggaaagac；
[0017]
seq id no.3：reverse primer：gtgagccaaggagaccaag。
[0018]
作为本发明的进一步优化方案，所述基因分型检测方法为通过酶切扩增产物获得酶切产物，利用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测，根据图像进行基因分型，若酶切产物：
[0019]
包含1条条带，则为aa型；
[0020]
包含2条条带，则为gg型；
[0021]
包含3条条带，则为ga型。
[0022]
作为本发明的进一步优化方案，若待测鸭分子标记类型为aa型，该鸭饲料利用率性状较差；若待测鸭分子标记类型为gg型，该鸭饲料利用率性状最好；若待测鸭分子标记类型为ga型，该鸭饲料利用率性状中等。
[0023]
作为本发明的进一步优化方案，利用1.5％-2.0％浓度的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测。
[0024]
本发明提具有如下有益效果：
[0025]
本发明通过鉴定该分子标记在鸭基因组中存在的类型，根据基因型对鸭的饲料利用率性状进行选择，建立了一种家禽饲料利用率早期选择的育种方法，该法简单、快速、低成本、不需要特殊的仪器，适合分子标记辅助育种实验的需要。
附图说明
[0026]
图1为部分样品pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
[0027]
图2为部分样品pcr扩增产物经酶切获得的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；
[0028]
图3为鸭elovl2基因中g95803706a位点(为seq id no.1中第480位点)基因型验证测序结果。
具体实施方式
[0029]
下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
[0030]
1、材料
[0031]
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0032]
2、方法
[0033]
2.1引物设计
[0034]
从鸭基因组数据库中找到如seq id no.1所示的elovl2基因对应的dna序列，并以elovl2基因dna部分序列(分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列)为模板，设计特异性扩增引物，特异性扩增引物序列如下所示：
[0035]
seq id no.2：forward primer：ggaacccaccaggaaagac；
[0036]
seq id no.3：reverse primer：gtgagccaaggagaccaag。
[0037]
该引物的可扩增区域的长度为623bp，序列如seq id no.4所示，其中包含g95803706a位点(为seq id no.1中第480位点)g/a突变的分子标记。
[0038]
2.2提取血液总dna
[0039]
选取强英鸭505只，翅静脉采血，提取血液总dna，利用天根生物科技有限公司生产的血液dna提取试剂盒提取鸭翅静脉血样中总dna，提取步骤按照试剂盒说明书进行即可。
[0040]
2.3 pcr扩增
[0041]
利用上海翊圣生物公司生产的mix，通过已合成的测序特异性引物对elovl2基因的目的片段，进行pcr扩增反应，pcr扩增体系如表1所示：
[0042]
表1 pcr扩增体系
[0043]
组分用量dna模板1μlforward primer1μlreveres primer1μlmix10μlddh2o7μl总计20μl
[0044]
pcr反应条件为：95℃预变性5min；第一步95℃变性45s；第二步64.8℃退火45s(退火温度根据引物而设定)；第三步72℃延伸30s，其中第二步到第三步循环31次，共32个循环；72℃延伸10min。
[0045]
2.4 pcr扩增产物检测与测序
[0046]
利用2％质量比的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，如图1所示，在凝胶成像仪成像后获得获得一条长度近似623bp的条带，与预测的长度一致，说明获得了目的片段，将pcr产物送到北京擎科生物科技有限公司(南京)，序列如seq id no.4所示，与预测结果一致。
[0047]
2.5基因分型
[0048]
2.5.1配置如表2所示的酶切体系，酶切条件为37℃水浴1小时，利用北京百奥莱博科技有限公司psp xi限制性内切酶酶切pcr扩增产物；
[0049]
表2酶切体系
[0050]
组分用量pcr扩增产物0.4μlpsp xi0.4μl(5u/μl)buffer2μlddh2o7.2μl总计10μl
[0051]
2.5.2利用1.5％质量比低电压琼脂糖凝胶电泳检测，获得如图2所示的结果(部分结果)；其中，若酶切产物：包含1条条带，为aa型；包含2条条带，为gg型；包含3条条带，为ga型。
[0052]
2.6酶切测序验证
[0053]
将基因酶切分型琼脂糖凝胶电泳图进行统计，获得gg、ga、aa三种分型，对这三种分型分别挑选一个个体进行测序比对，测序比对图如图3所示，测序结果中g突变成a，箭头标出了突变位置，与酶切分型结果一致。
[0054]
2.7效果验证
[0055]
为确定鸭elovl2基因g95803706a位点的g/a多态性与鸭重要表型性状关联性，以2.2中的505只强英鸭为试验材料，统计21～42日龄采食量(adfi)、平均日增重(adg)、代谢体增重(mbw
0.75
)、料重比(fcr)、剩余采食量(rfi)，采用2.5基因分型方法，对505只强英鸭，进行基因分型，结果如表3所示：
[0056]
表3不同表型个体基因型检测结果
[0057][0058]
实验结论：卡方检验结果显示，试验鸭群体基因型处于hardy-weinberg平衡(p》0.05)。
[0059]
2.8统计分析
[0060]
用sas9.4软件中最小二乘分析法分析三种基因型与鸭饲料利用率性状之间的关联性，不同基因型与各性状间的关联分析结果见如表4所示：
[0061]
表4鸭elovl2基因型与鸭饲料利用率性状关联分析
[0062][0063]
注：同行不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，同一行不同大写字母表示差异极显著(p《0.01)。
[0064]
实验结论：从表4中可以看出，对于elovl2基因g95803706a位点而言，aa和ga型个体的日龄采食量(adfi)显著高于gg型个体，aa和ga型个体的料重比(fcr)和剩余采食量(rfi)极显著高于gg型个体，三种基因型在平均日增重(adg)和代谢体增重(mbw0.75)方面无显著差异，由此可得出，gg基因型个体饲料利用率性状最好，ga基因型个体饲料利用率性状中等，aa基因型个体饲料利用率性状较差。
[0065]
上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种基于elovl2基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，其中，所述核苷酸序列的第480位碱基为g或a。2.一种如权利要求1所述的分子标记在鉴定鸭饲料利用率性状中的应用。3.一种利用如权利要求1所述的分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取鸭翅静脉血液总dna；(2)以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物，以所述总dna为模板，利用特异性扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序，获得待测鸭的分子标记类型；(4)根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状。4.根据权利要求3所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，所述特异性扩增引物的序列为：seq id no.2：forward primer：ggaacccaccaggaaagac；seq id no.3：reverse primer：gtgagccaaggagaccaag。5.根据权利要求3所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，所述基因分型检测方法为通过酶切扩增产物获得酶切产物，利用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测，根据图像进行基因分型，若酶切产物：包含1条条带，则为aa型；包含2条条带，则为gg型；包含3条条带，则为ga型。6.根据权利要求5所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，若待测鸭分子标记类型为aa型，该鸭饲料利用率性状较差；若待测鸭分子标记类型为gg型，该鸭饲料利用率性状最好；若待测鸭分子标记类型为ga型，该鸭饲料利用率性状中等。7.根据权利要求5所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法，其特征在于，利用1.5％-2.0％浓度的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测。

技术总结
本发明涉及一种基于ELOVL2基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，所述核苷酸序列的第480位碱基为G或A。本发明通过鉴定该分子标记在鸭基因组中存在的类型，根据基因型对鸭的饲料利用率性状进行选择，建立了一种家禽饲料利用率早期选择的育种方法，该法简单、快速、低成本、不需要特殊的仪器，适合分子标记辅助育种实验的需要。适合分子标记辅助育种实验的需要。适合分子标记辅助育种实验的需要。


技术研发人员：金四华 张泰康 耿照玉 贾富民 方毅 徐嫚 胡晓晴 王鑫 王新 刘星
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/13