胰蛋白酶的制备及活力测定方法与流程

1.本发明涉及胰蛋白酶的制备和测定领域，特别涉及胰蛋白酶的制备及活力测定方法。


背景技术：

2.胰蛋白酶蛋白酶的一种，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用，在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
3.现有的胰蛋白酶在进行制备时，缺少对ph值进行限定的制备方法，以此会导致胰蛋白酶会出现变性的和不稳定的现象发生，同时会导致其纯度。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供胰蛋白酶的制备及活力测定方法，可以有效解决背景技术中的问题。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
6.胰蛋白酶的制备，包括以下操作步骤：
7.s1：准备器材与试剂：器材包括：重组胰蛋白酶原基因序列的质粒、大肠杆菌细胞、食品加工机、高速分散器、研钵、大玻璃漏斗、小塑料桶、布氏漏斗、抽滤瓶、纱布、恒温水浴、秒表、ph计，试剂包括：ph4～4.5乙酸酸化水、2.5mh2so4、5mnaoh4、硫酸铵、氯化钙、2mnaoh、0.8m，ph9.0硼酸缓冲液、0.4mph9.0硼酸缓冲液、0.2mph8.0硼酸缓冲液、2mhcl、0.01mhcl、5m硫酸；
8.s2：胰蛋白酶原的提取与分离：称取1-1.5kg带有重组胰蛋白酶原基因序列的质粒，在冰浴下剥除材料中的脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏，或用高速组织匀浆机捣碎，加1-2倍体积以预冷却的ph2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取，按1g组织相当于1ml体积计算，以此类推，检查提取液中ph，若高于ph3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持ph2.5-3.0之间，在冷室5℃左右搅拌提取18-24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液，滤液呈乳白色，用约300mlph2.5乙酸酸化水再提取残渣一次，时间约为1一2h，合并滤液，此时滤液ph值较高，可用5mh2po4溶液调整ph至2.5-3.0，放置3-5h后，浑浊滤液冷却后，用玻璃漏斗进行自然过滤，滤液呈黄色透明液体，收集滤液，量其总体积，弃去沉淀物；
9.s3：盐析：滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75％饱和度，盐析溶液放冷室中过夜，次日用4000r/min离心机离心，或用布氏漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，可得约20g胰蛋白酶原粗制品；
10.s4：胰蛋白酶原的激活：将胰蛋白酶原粗制品用10倍体积得冷蒸馏水，分多次加入
使滤饼溶解，溶液呈乳白色，量其体积，取出1ml溶液用于测定，溶液中硫酸铵得含量，约为滤饼重得1/4，因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程，按浓度量计算，将已研细的固体cacl2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀，用5mnaoh溶液调ph至8.0，在酶溶液加入约5mg结晶猪胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，置5℃冰箱中使酶原活化；
11.s5：纯化：去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5m硫酸溶液调节滤液ph至2.5-3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，滤液体积约1000ml，加入已经研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40％饱和度，每升滤液加242g硫酸铵，放置5℃冰箱中5-8h，抽滤除去沉淀即可取出。
12.优选的，所述ph9.0硼酸缓冲液:取20ml0.8m硼酸溶液，加80ml0.2m四硼酸钠溶液，混合后，用ph计检查校正，其中0.4mph9.0硼酸缓冲液用ph9.0硼酸缓冲液稀释一倍即可，0.2mph8.0硼酸缓冲液可以取70ml0.2m硼酸溶液，加30ml0.5m四硼酸钠溶液，将其进行混合后，用ph计校正。
13.胰蛋白酶的活力测定方法，所述包括以下操作步骤：
14.a：准备仪器和试剂：仪器包括试管、分光光度计和恒温水浴锅，试剂包括富林试剂、0.55mol/l的碳酸钠溶液、10％的三氯乙酸溶液、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.5％酪素溶液、500ug/l酪氨酸溶液和制出的胰蛋白酶溶液；
15.b：准备五个试管，分别加入0、0.2、0.4、、0.6、0.8、1.0的500ug/l酪氨酸溶液，再按一次分类加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2和0ml的蒸馏水；
16.c:各管中加0.5％酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10％三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55moll碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37℃水浴中显色15分钟，测od680；
17.d：取干燥的试管2支，加入试剂进行测定，试剂包括0.55mol/l的碳酸钠溶液、10％的三氯乙酸溶液、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.5％酪素溶液、500ug/l酪氨酸溶液，并依次加入制备好的胰蛋白酶溶液根据a/15*f测出胰蛋白酶的活力即可。
18.优选的，所述0.55mol/l的碳酸钠溶液需要使用58.3g的无水碳酸钠，将其溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml。
19.优选的，所述0.5％酪素溶液需要称取0.5g的酪素，以0.5mol/l的氢氧化钠1ml湿润，再加少量0.2moll磷酸缓冲液稀释，在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml。
20.优选的，所述a/15*f中，a为样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数，f为酶液稀释倍数。
21.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
22.本发明中胰蛋白酶的最适ph值为8.1，胰蛋白酶的活性在一定的ph值范围内随着ph值的升高而升高，超过最适的ph值时酶活性降低，以此对其ph值进行限定可以对活力值测定的精度起到明显提升，胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为ph8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近，其等电点约为ph10.8，最适ph7.6～8.0，在ph＝3时最稳定，低于此ph时，胰蛋白酶易变性，在ph》5时易自溶，加入ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，以此在制备胰蛋白酶时，可以有效保证其精度和纯度。
具体实施方式
23.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.具体实施例一：
25.胰蛋白酶的制备，包括以下操作步骤：
26.s1：准备器材与试剂：器材包括：重组胰蛋白酶原基因序列的质粒、大肠杆菌细胞、食品加工机、高速分散器、研钵、大玻璃漏斗、小塑料桶、布氏漏斗、抽滤瓶、纱布、恒温水浴、秒表、ph计，试剂包括：ph4～4.5乙酸酸化水、2.5mh2so4、5mnaoh4、硫酸铵、氯化钙、2mnaoh、0.8m，ph9.0硼酸缓冲液、0.4mph9.0硼酸缓冲液、0.2mph8.0硼酸缓冲液、2mhcl、0.01mhcl、5m硫酸，ph9.0硼酸缓冲液:取20ml0.8m硼酸溶液，加80ml0.2m四硼酸钠溶液，混合后，用ph计检查校正，其中0.4mph9.0硼酸缓冲液用ph9.0硼酸缓冲液稀释一倍即可，0.2mph8.0硼酸缓冲液可以取70ml0.2m硼酸溶液，加30ml0.5m四硼酸钠溶液，将其进行混合后，用ph计校正。
27.s2：胰蛋白酶原的提取与分离：称取1-1.5kg带有重组胰蛋白酶原基因序列的质粒，在冰浴下剥除材料中的脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏，或用高速组织匀浆机捣碎，加1-2倍体积以预冷却的ph2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取，按1g组织相当于1ml体积计算，以此类推，检查提取液中ph，若高于ph3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持ph2.5-3.0之间，在冷室5℃左右搅拌提取18-24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液，滤液呈乳白色，用约300mlph2.5乙酸酸化水再提取残渣一次，时间约为1一2h，合并滤液，此时滤液ph值较高，可用5mh2po4溶液调整ph至2.5-3.0，放置3-5h后，浑浊滤液冷却后，用玻璃漏斗进行自然过滤，滤液呈黄色透明液体，收集滤液，量其总体积，弃去沉淀物。
28.s3：盐析：滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75％饱和度，盐析溶液放冷室中过夜，次日用4000r/min离心机离心，或用布氏漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，可得约20g胰蛋白酶原粗制品。
29.s4：胰蛋白酶原的激活：将胰蛋白酶原粗制品用10倍体积得冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，溶液呈乳白色，量其体积，取出1ml溶液用于测定，溶液中硫酸铵得含量，约为滤饼重得1/4，因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程，按浓度量计算，将已研细的固体cacl2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀，用5mnaoh溶液调ph至8.0，在酶溶液加入约5mg结晶猪胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，置5℃冰箱中使酶原活化。
30.s5：纯化：去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5m硫酸溶液调节滤液ph至2.5-3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，滤液体积约1000ml，加入已经研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40％饱和度，每升滤液加242g硫酸铵，放置5℃冰箱中5-8h，抽滤除去沉淀即可取出。
31.具体实施例二：
32.胰蛋白酶的活力测定方法，包括以下操作步骤：
33.a：准备仪器和试剂：仪器包括试管、分光光度计和恒温水浴锅，试剂包括富林试剂、0.55mol/l的碳酸钠溶液、10％的三氯乙酸溶液、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.5％酪素溶液、
500ug/l酪氨酸溶液和制出的胰蛋白酶溶液，0.55mol/l的碳酸钠溶液需要使用58.3g的无水碳酸钠，将其溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml，0.5％酪素溶液需要称取0.5g的酪素，以0.5mol/l的氢氧化钠1ml湿润，再加少量0.2moll磷酸缓冲液稀释，在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml。
34.b：准备五个试管，分别加入0、0.2、0.4、、0.6、0.8、1.0的500ug/l酪氨酸溶液，再按一次分类加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2和0ml的蒸馏水。
35.c:各管中加0.5％酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10％三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55moll碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37℃水浴中显色15分钟，测od680。
36.d：取干燥的试管2支，加入试剂进行测定，试剂包括0.55mol/l的碳酸钠溶液、10％的三氯乙酸溶液、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.5％酪素溶液、500ug/l酪氨酸溶液，并依次加入制备好的胰蛋白酶溶液根据a/15*f测出胰蛋白酶的活力即可，a/15*f中，a为样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数，f为酶液稀释倍数。
37.具体实施例三：
[0038][0039][0040]
a/15*f＝0.7336/15-13＝0.6358，以此可以得出胰蛋白酶的活力。
[0041]
本发明中胰蛋白酶的最适ph值为8.1，胰蛋白酶的活性在一定的ph值范围内随着ph值的升高而升高，超过最适的ph值时酶活性降低，以此对其ph值进行限定可以对活力值
测定的精度起到明显提升，胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为ph8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近，其等电点约为ph10.8，最适ph7.6～8.0，在ph＝3时最稳定，低于此ph时，胰蛋白酶易变性，在ph》5时易自溶，加入ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，以此在制备胰蛋白酶时，可以有效保证其精度和纯度。
[0042]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：包括以下操作步骤：s1：准备器材与试剂：器材包括：重组胰蛋白酶原基因序列的质粒、大肠杆菌细胞、食品加工机、高速分散器、研钵、大玻璃漏斗、小塑料桶、布氏漏斗、抽滤瓶、纱布、恒温水浴、秒表、ph计，试剂包括：ph4～4.5乙酸酸化水、2.5mh2so4、5mnaoh4、硫酸铵、氯化钙、2mnaoh、0.8m，ph9.0硼酸缓冲液、0.4mph9.0硼酸缓冲液、0.2mph8.0硼酸缓冲液、2mhcl、0.01mhcl、5m硫酸；s2：胰蛋白酶原的提取与分离：称取1-1.5kg带有重组胰蛋白酶原基因序列的质粒，在冰浴下剥除材料中的脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞碎胰脏，或用高速组织匀浆机捣碎，加1-2倍体积以预冷却的ph2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取，按1g组织相当于1ml体积计算，以此类推，检查提取液中ph，若高于ph3.0时应及时用10％乙酸调节，使提取液维持ph2.5-3.0之间，在冷室5℃左右搅拌提取18-24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液，滤液呈乳白色，用约300mlph2.5乙酸酸化水再提取残渣一次，时间约为1一2h，合并滤液，此时滤液ph值较高，可用5mh2po4溶液调整ph至2.5-3.0，放置3-5h后，浑浊滤液冷却后，用玻璃漏斗进行自然过滤，滤液呈黄色透明液体，收集滤液，量其总体积，弃去沉淀物；s3：盐析：滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75％饱和度，盐析溶液放冷室中过夜，次日用4000r/min离心机离心，或用布氏漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，可得约20g胰蛋白酶原粗制品；s4：胰蛋白酶原的激活：将胰蛋白酶原粗制品用10倍体积得冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，溶液呈乳白色，量其体积，取出1ml溶液用于测定，溶液中硫酸铵得含量，约为滤饼重得1/4，因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程，按浓度量计算，将已研细的固体cacl2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀，用5mnaoh溶液调ph至8.0，在酶溶液加入约5mg结晶猪胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，置5℃冰箱中使酶原活化；s5：纯化：去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5m硫酸溶液调节滤液ph至2.5-3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，滤液体积约1000ml，加入已经研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40％饱和度，每升滤液加242g硫酸铵，放置5℃冰箱中5-8h，抽滤除去沉淀即可取出。2.根据权利要求1所述的胰蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述ph9.0硼酸缓冲液:取20ml0.8m硼酸溶液，加80ml0.2m四硼酸钠溶液，混合后，用ph计检查校正，其中0.4mph9.0硼酸缓冲液用ph9.0硼酸缓冲液稀释一倍即可，0.2mph8.0硼酸缓冲液可以取70ml0.2m硼酸溶液，加30ml0.5m四硼酸钠溶液，将其进行混合后，用ph计校正。3.胰蛋白酶的活力测定方法，其特征在于：包括以下操作步骤：a：准备仪器和试剂：仪器包括试管、分光光度计和恒温水浴锅，试剂包括富林试剂、0.55mol/l的碳酸钠溶液、10％的三氯乙酸溶液、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.5％酪素溶液、500ug/l酪氨酸溶液和制出的胰蛋白酶溶液；b：准备五个试管，分别加入0、0.2、0.4、、0.6、0.8、1.0的500ug/l酪氨酸溶液，再按一次分类加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2和0ml的蒸馏水；c:各管中加0.5％酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10％三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55moll碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37℃水浴中显色15分钟，测od680；
d：取干燥的试管2支，加入试剂进行测定，试剂包括0.55mol/l的碳酸钠溶液、10％的三氯乙酸溶液、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.5％酪素溶液、500ug/l酪氨酸溶液，并依次加入制备好的胰蛋白酶溶液根据a/15*f测出胰蛋白酶的活力即可。4.根据权利要求3所述的胰蛋白酶的活力测定方法，其特征在于：所述0.55mol/l的碳酸钠溶液需要使用58.3g的无水碳酸钠，将其溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml。5.根据权利要求3所述的胰蛋白酶的活力测定方法，其特征在于：所述0.5％酪素溶液需要称取0.5g的酪素，以0.5mol/l的氢氧化钠1ml湿润，再加少量0.2moll磷酸缓冲液稀释，在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml。6.根据权利要求3所述的胰蛋白酶的活力测定方法，其特征在于：所述a/15*f中，a为样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数，f为酶液稀释倍数。

技术总结
本发明公开了胰蛋白酶的制备及活力测定方法，包括以下步骤：S1：准备器材与试剂；S2：胰蛋白酶原的提取与分离；S3：盐析；S4：胰蛋白酶原的激活；S5：纯化；S7：测定。本发明所述的胰蛋白酶的制备及活力测定方法，本发明中胰蛋白酶的最适PH值为8.1，胰蛋白酶的活性在一定的PH值范围内随着PH值的升高而升高，超过最适的PH值时酶活性降低，以此对其PH值进行限定可以对活力值测定的精度起到明显提升，胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近，其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH＝3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，加入Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，以此在制备胰蛋白酶时，可以有效保证其精度和纯度。以有效保证其精度和纯度。


技术研发人员：谢应波 张庆 张华 罗桂云 曹云 孙秋艳
受保护的技术使用者：上海泰坦科技股份有限公司
技术研发日：2023.05.16
技术公布日：2023/8/13