一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法与流程

一种检测依诺肝素钠肝素酶ii酶解组分的方法
技术领域
1.本发明属于肝素技术领域，尤其涉及一种检测依诺肝素钠肝素酶ii酶解组分的方法。


背景技术：

2.肝素在临床上作为一种抗凝、抗血栓药物使用。目前肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。依诺肝素钠是由肝素原料药作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症(心绞痛、心肌梗塞)等疾病的首选药物，并且安全性更高，副作用更小。
3.依诺肝素钠肝素酶ii酶解，肝素酶ii有更广的特异性，能降解少量肝素和硫酸乙酰肝素的含2-o-硫酸化和2-oh的糖醛酸糖苷键，为了解依诺肝素钠内部结构提供数据。但现有技术中采用液相色谱进行检测时，由于依诺肝素钠肝素酶ii酶解产物分子量小，且成分多，分离度不好，且多次检测时保留时间会出现前移现象，影响检测灵敏度。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种检测依诺肝素钠肝素酶ii酶解组分的方法，灵敏度高，分离度好。
5.为了达到上述目的，本发明提供了一种检测依诺肝素钠肝素酶ii酶解组分的方法，包括如下步骤：
6.1)将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液；
7.2)采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；
8.采用液相色谱进行检测时，使用流动相a和流动相b进行梯度洗脱；所述流动相a为116.88g/l的氯化钠水溶液；所述流动相b为5.844g/l的氯化钠水溶液；
9.3)计算相对峰面积大于1％的组分含量。
10.优选的，步骤2)中进行梯度洗脱时的过程如下：
11.时间/min流动相a/％流动相b/％00100100100253070404060606040701000751000760100850100
。
12.优选的，步骤2)中采用液相色谱进行检测时检测条件如下表所示：
13.柱箱温度30℃流速1.0ml/min运行时间85min进样体积50μl检测器uv检测器，232nm。
14.优选的，步骤2)中采用液相色谱进行检测时，分析柱为propac
tm
pa1 analytical column；保护柱为propac
tm
pa1 guard column。
15.优选的，步骤2)中采用液相色谱进行检测时采用硅胶化学键合强碱性季铵盐阴离子交换固定相为色谱柱填充剂。
16.优选的，步骤1)中所述酶解包括如下步骤：
17.将待检测肝素样品溶解，将得到的溶解液过滤，得到待酶解检测样品溶液；取待酶解检测样品溶液，用肝素酶ⅱ溶液进行酶解，得到待检测肝素酶解液。
18.优选的，采用0.22μm滤膜进行过滤。
19.优选的，所述酶解温度为20～30℃，酶解时间为45～50h。
20.优选的，所述肝素酶ⅱ的浓度为0.1～0.5iu/μl。
21.优选的，步骤3)中采用面积归一化法计算组分含量。
22.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
23.1、本发明提供的方法检测灵敏度高，分离度好。
24.2、本发明提供的方法使色谱柱耐用性极好，每根色谱柱大约运行500针，是普通sax柱的10倍左右。
25.3、本发明提供的方法色谱图重复性好，常规检测方法，色谱柱随检测数量的增加保留时间迁移，此方法的洗脱梯度及色谱柱有效改善保留时间前移现象。
26.4、本发明中所涉及的仪器设备均为常规仪器设备，使得本发明方法可广泛应用于企业、机构等日常检测。
27.5、本发明中检测方法易于学习、操作简便、容易分析，便于推广使用。
附图说明
28.图1为实施例1中的编号为1的依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图；
29.图2为实施例1中的编号为2的依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图；
30.图3为实施例1中的编号为3的依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图；
31.图4为实施例1中多批次的依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图；
32.图5为对比例1中的编号为1的依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图；
33.图6为对比例1中的多批次的依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图。
34.图7为对比例2中的依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图。
35.图8为对比例3中的依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图。
具体实施方式
36.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.本发明提供了一种检测依诺肝素钠肝素酶ii酶解组分的方法，包括如下步骤：
38.1)将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液；
39.2)采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；
40.采用液相色谱进行检测时，使用流动相a和流动相b进行梯度洗脱；所述流动相a为116.88g/l的氯化钠水溶液；所述流动相b为5.844g/l的氯化钠水溶液；
41.3)计算相对峰面积大于1％的组分含量。
42.本发明将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液。在本发明中，所述酶解优选包括如下步骤：
43.将待检测肝素样品溶解，将得到的溶解液过滤，得到待酶解检测样品溶液；
44.取待酶解检测样品溶液，用肝素酶ⅱ溶液进行酶解，得到待检测肝素酶解液。
45.在本发明中，优选采用0.22μm滤膜进行过滤。在本发明中，进行酶解时，所述酶解的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述酶解的时间优选为45～50h，更优选为48h。
46.在本发明中，所述肝素酶ii优选为cas no：149371-12-0。
47.在本发明中，所述肝素酶ⅱ的浓度优选为0.1～0.5iu/μl。
48.得到待检测肝素酶解液后，本发明采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；采用液相色谱进行检测时，使用流动相a和流动相b进行梯度洗脱；所述流动相a为116.88g/l的氯化钠水溶液；所述流动相b为5.844g/l的氯化钠水溶液。
49.本发明中，采用116.88g/l的氯化钠水溶液作为流动相a，5.844g/l的氯化钠水溶液作为流动相b，可以更好的保护液相系统，延长仪器使用寿命。采用该方式进行梯度进行洗脱，可以更快、准确的对组分进行检测。后期用流动相b进行洗脱，可以将色谱柱内样品洗脱完全并延长色谱柱的使用寿命。可以理解的是，在本发明限定的流动性及梯度洗脱范围内，可以有效改善保留时间前移现象及使组分充分分离，提高分离度。
50.在本发明中，采用液相色谱进行检测时，分析柱优选为propac
tm
pa1analytical column；保护柱优选为propac
tm
pa1 guard column。在本发明中，采用该分析柱耐用性极好，每根色谱柱大约运行500针，是普通sax柱的10倍左右。
51.在本发明中，采用液相色谱进行检测时优选采用硅胶化学键合强碱性季铵盐阴离子交换固定相为色谱柱填充剂。
52.在本发明中，所述梯度洗脱时的过程优选如下表1所示：
53.表1
54.时间/min流动相a/％流动相b/％00100100100253070404060
606040701000751000760100850100。
55.在本发明中，根据梯度洗脱，可以将不同分子量的组分根据出峰时间进行检测，后期用流动相b洗脱可以延长柱子的使用寿命，减少色谱峰迁移现象。
56.在本发明中，采用液相色谱进行检测时检测条件如下表2所示：
57.表2
58.柱箱温度30℃流速1.0ml/min运行时间85min进样体积50μl检测器uv检测器，232nm。
59.在本发明中，优选采用面积归一化法计算组分含量。
60.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
61.实施例1
62.1、仪器
63.高效液相色谱仪、电子天平、酸度计
64.2、试剂与试液
65.表3试剂与试液
66.试剂名称规格来源磷酸二氢钠优级纯天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸优级纯国药集团化学试剂有限公司高氯酸钠优级纯acros organics醋酸钙分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司牛血清蛋白含量≥98％vetec冰乙酸分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸二氢钾优级纯国药集团化学试剂有限公司肝素酶ⅱ0.1iu/支艾德豪克
67.3、样品处理
68.称取20mg样品，加1ml纯化水溶解，用0.22μm滤膜过滤，作为待酶解检测样品。
69.4、样品酶解
70.4.1醋酸钠钙ph7.0的溶液配制：称取醋酸钙32mg和牛血清蛋白10mg于纯化水60ml中，加冰乙酸580μl，用2mol/l氢氧化钠调ph7.0，转移至100ml容量瓶中，用纯化水稀释至刻度，用0.22μm滤膜过滤。
71.4.2磷酸二氢钾7.0缓冲液配制：称取kh2po4、68mg和牛血清蛋白10mg于纯化水30ml中，完全溶解后转移至50ml容量瓶中，用2mol/l koh调ph7.0，用纯化水稀释至刻度，用0.22μm滤膜过滤。
72.4.3肝素酶ⅱ溶液配制：使用磷酸二氢钾7.0缓冲液溶解肝素酶ⅱ使成0.3iu/ml，漩涡混合器混合，使用前储存在-20℃。
73.4.5供试品溶液准备：取预先配制的20mg/ml待测样品水溶液，加入醋酸钠钙ph7.0的溶液70μl，再加入肝素酶ⅱ溶液100μl，漩涡混合器混合，在25℃水浴中放置48小时，作为供试品溶液。
74.5、检测
75.采用液相色谱对供试品溶液进行检测，具体色谱条件如表4所示，洗脱梯度如表5所示，其中流动相a为116.88g/l的氯化钠水溶液；流动相b为5.844g/l的氯化钠水溶液。
76.表4色谱条件
77.参数参数值保护柱propac
tm
pa1 guard column(4
×
50mm)分析柱propac
tm
pa1 analytical column(4
×
250mm)柱箱温度30℃流速1.0ml/min运行时间85min进样体积50μl检测器uv检测器，232nm
78.表5洗脱梯度
79.时间/min流动相a/％流动相b/％00100100100253070404060606040701000751000760100850100
80.分别对三批次依诺肝素钠样品进行酶解，采用此液相色谱对3批依诺肝素钠样品的酶解液进行检测(分别编号为1、2、3)，3批依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图分别依次如图1～3所示，三批依诺肝素钠肝素酶ii酶解组分如表6所示。采用此液相色谱对同序列多批次依诺肝素钠肝素酶ii酶解叠加图如图4所示。由图4可以看出，本发明提供的方法重复性好，能够有效改善保留时间前移现象。
81.表6依诺肝素钠酶ii酶解组分
[0082][0083]
对比例1
[0084]
与实施例1的区别在于，采用液相色谱对供试品溶液进行检测，具体洗脱梯度方式不同，如表7所示。
[0085]
表7洗脱梯度
[0086][0087][0088]
采用此液相色谱对3批依诺肝素钠酶解液中编号1的进行检测，依诺肝素钠肝素酶
ii酶解谱图如图5所示，酶解组分如表8所示。由图1和5对比可以看出，本发明提供的方法，检测色谱峰更多，分离度好。
[0089]
表8依诺肝素钠酶ii酶解组分
[0090][0091]
采用此液相色谱对同序列多批次依诺肝素钠肝素酶ii酶解叠加图如图6所示。由图6可以看出，该采用该梯度洗脱方式进行洗脱，保留时间有前移现象。
[0092]
对比例2
[0093]
与实施例1的区别在于，使用磷酸二氢钾7.0缓冲液溶解肝素酶ⅱ使成0.7、iu/ml，待酶解样品为实施例1中编号1的样品，其他操作与实施例1完全相同。
[0094]
采用此液相色谱对3批依诺肝素钠酶解液中编号1的进行检测，依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图如图7所示，酶解组分如表9所示。由图1和7对比可以看出，酶浓度过高，导致过渡酶解，检测色谱峰减少。
[0095]
表9依诺肝素钠酶ii酶解组分
[0096][0097]
对比例3
[0098]
与实施例1的区别在于，流动相b为1mol/l高氯酸钠，其他操作与实施例1完全相同。采用此液相色谱对3批依诺肝素钠样品的酶解液中编号1的进行检测，依诺肝素钠肝素酶ii酶解谱图如图8所示，酶解组分如表10所示。由图1和8对比可以看出，本发明提供的方法，检测色谱峰更多，分离度好。
[0099]
表10依诺肝素钠酶ii酶解组分
[0100]
[0101][0102]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种检测依诺肝素钠肝素酶ii酶解组分的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液；2)采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；采用液相色谱进行检测时，使用流动相a和流动相b进行梯度洗脱；所述流动相a为116.88g/l的氯化钠水溶液；所述流动相b为5.844g/l的氯化钠水溶液；3)计算相对峰面积大于1％的组分含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行梯度洗脱时的过程如下：时间/min流动相a/％流动相b/％00100100100253070404060606040701000751000760100850100。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中采用液相色谱进行检测时检测条件如下表所示：。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中采用液相色谱进行检测时，分析柱为propac
tm
pa1 analytical column；保护柱为propac
tm
pa1 guard column。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中采用液相色谱进行检测时采用硅胶化学键合强碱性季铵盐阴离子交换固定相为色谱柱填充剂。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述酶解包括如下步骤：将待检测肝素样品溶解，将得到的溶解液过滤，得到待酶解检测样品溶液；取待酶解检测样品溶液，用肝素酶ⅱ溶液进行酶解，得到待检测肝素酶解液。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用0.22μm滤膜进行过滤。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶解温度为20～30℃，酶解时间为45～50h。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述肝素酶ⅱ的浓度为0.1～0.5iu/μl。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用面积归一化法计算组分含量。

技术总结
本发明提供了一种检测依诺肝素钠肝素酶II酶解组分的方法，属于肝素技术领域。所述方法包括如下步骤：1)将待检测肝素样品进行酶解，得到待检测肝素酶解液；2)采用液相色谱检测待检测肝素酶解液的组分含量；采用液相色谱进行检测时，使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；所述流动相A为116.88g/L的氯化钠水溶液；所述流动相B为5.844g/L的氯化钠水溶液；3)计算相对峰面积大于1％的组分含量。本发明提供的方法灵敏度高，分离度好，能够有效改善保留时间前移现象。时间前移现象。时间前移现象。


技术研发人员：赵娟 董磊 李辉辉 艾自明 王秀萍 郭朝辉 郭晴怡
受保护的技术使用者：东营天东制药有限公司
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/13