筛选DNA聚合酶突变株微流控芯片及其方法与流程

筛选dna聚合酶突变株微流控芯片及其方法
技术领域
1.本技术涉及生物领域，具体涉及蛋白质工程技术领域，特别是涉及一种筛选dna聚合酶突变株微流控芯片及其方法。


背景技术：

2.蛋白质定向进化是指通过建立突变体文库与高通量筛选方法，快速提升蛋白的特定性质，蛋白质定向进化是目前蛋白质工程最为常用的蛋白质设计改造策略。通过蛋白质定向进化可以引导蛋白质的性能朝着人们需要的方向改进，从而大幅缩短蛋白质进化的过程。筛选是蛋白质改造过程中至关重要一步，有效高效的筛选方案可大步提高蛋白质定向进化成功率。
3.传统技术中，蛋白质改造过程中筛选方法一般包括人工筛选、分隔式自我复制技术(compartmentalized self-replication，csr)以及qpix高通量克隆筛选系统。其中，人工筛选的方法，工作量极大，无法实现高通量的需求。csr是通过油与水的混合，形成一个个小的油包水体系，油包水体系里面含有携带酶的突变体的大肠杆菌和反应体系。在扩增所需温度循环下，具有高活性的突变体以自身为模板，进行扩增，无义突变体被淘汰。反应结束后，可收集被富集的dna变体，得到突变基因。csr技术需要多步操作，且具有一定操作难度。qpix高通量克隆筛选系统拥有白光和荧光成像，自动化挑取微生物菌落，实现样品涂布，文库筛选和管理，通量点膜等，但使用qpix高通量克隆筛选系统则需要借助大型筛选设备，成本高。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种筛选dna聚合酶突变株微流控芯片。本发明的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片能够实现扩增液滴生成、核酸扩增和核酸回收一体化操作，快速实现不同条件下对正向突变dna聚合酶高通量筛选。
5.本技术一实施例提供了一种筛选dna聚合酶突变株微流控芯片。
6.一种筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，包括芯片主体，所述芯片主体上具有上样孔、进液孔、扩增腔室、分离腔室、进液腔室、磁珠腔室以及回收腔室，所述上样孔与所述扩增腔室连通，所述扩增腔室、所述分离腔室、所述进液腔室、所述磁珠腔室以及所述回收腔室依次顺序连通，所述进液孔与所述分离腔室相通。
7.在其中一些实施例中，所述芯片主体上设置加热部，所述加热部用于加热所述扩增腔室内的液体，所述加热部包括第一加热片、第二加热片以及第三加热片，所述第一加热片、所述第二加热片以及所述第三加热片依次顺序分布以分布用于调控核酸扩增过程中的变性温度、退火温度以及延伸温度。所述加热部加热片的数量及温度设置依照扩增所需温度条件进行相应改变。
8.在其中一些实施例中，所述上样孔的数量为多个，多个所述上样孔分别通过上样通道与所述扩增腔室相通。
9.在其中一些实施例中，所述扩增腔室包括多个呈同心圆分布的圆环状的扩增子腔室，各个所述扩增子腔室均连通出液通道。
10.在其中一些实施例中，所述分离腔室弯折呈迂回状结构，且存在多个矩阵结构用于液滴结构破碎。
11.在其中一些实施例中，所述分离腔室的数量为多个，相邻的所述分离腔室之间设置有缓存腔室。
12.在其中一些实施例中，所述芯片主体包括盖板、第一内板、第二内板以及底板，所述盖板、所述第一内板、所述第二内板以及所述底板依次层叠连接；其中，所述盖板上贯穿有所述上样孔以及所述进液孔，所述第一内板上贯穿有与所述上样孔对应的第一连通孔以及与所述分离腔室相通的第二连通孔，所述第一内板上还设置有所述分离腔室、所述进液腔室、所述磁珠腔室以及所述回收腔室，所述第二内板上设置有所述扩增腔室以及出液通道，所述扩增腔室通过所述出液通道与所述第二连通孔相通。
13.在其中一些实施例中，所述上样孔包括第一孔道以及第二孔道，所述第一孔道的两侧分别设置有至少一个所述第二孔道，所述第一孔道用于供水相注入，所述第二孔道用于供油相注入。
14.在其中一些实施例中，所述筛选dna聚合酶突变株微流控芯片还包括磁性结构，所述磁性结构用于固定磁珠腔室内的磁珠的位置；
15.和/或，所述进液腔室与所述分离腔室之间的通道上设置有柱式微阀。
16.本技术一实施例还提供了一种筛选dna聚合酶突变株方法。
17.一种筛选dna聚合酶突变株方法，采用所述筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，包括如下步骤：
18.步骤(1)突变库建立，对dna聚合酶的基因片段进行随机突变，将突变的多个基因片段均连接至表达载体后，均转入宿主表达细胞中进行诱导表达；
19.步骤(2)将诱导表达后的菌液用扩增缓冲液洗涤至少一次后稀释形成稀释菌液；
20.步骤(3)控制稀释菌液经过其中一个上样孔上样，控制油相由另一个上样孔上样，使得稀释菌液与油相形成油包水样的含有单个菌体的液滴；
21.步骤(4)控制扩增腔室的温度，以自身突变的基因片段作为模板，以dna突变聚合酶作为反应所需的dna聚合酶，以两侧引物作为扩增引物进行多轮扩增，得到扩增产物；
22.步骤(5)控制乙醚由进液孔进入并与扩增后的扩增产物混合后进入分离腔室，通过分离腔室实现扩增产物的油相与水相分离，所述分离腔室的所有液体进入进液腔室；
23.步骤(6)来自所述分离腔室的水相进入进液腔室后，与进液腔室中裂解液混合进行裂解反应，裂解反应后的核酸产物进入磁珠腔室，核酸产物被磁珠吸附；
24.步骤(7)通过磁性结构固定磁珠腔室内的磁珠的位置，对磁珠进行进行漂洗；
25.步骤(8)对磁珠进行进行洗脱得到终产物，终产物经回收腔室进行回收。
26.在其中一些实施例中，所述筛选dna聚合酶突变株方法还包括如下步骤：
27.步骤(9)对所述回收腔室回收的终产物酶切后连接至载体进行测序。
28.在其中一些实施例中，所述筛选dna聚合酶突变株方法还包括如下步骤：
29.步骤(10)将所述回收腔室回收的终产物转入表达菌株后，重复步骤(1)-步骤(8)重复进行富集筛选。
30.上述筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，实现了在dna聚合酶突变株筛选过程中的生物、化学等整个反应和分析过程集成到一块芯片上，自动完成整个需要在实验室完成的复杂的实验过程，包括样品制备、反应、分离、检测等基本操作流程，可以在一块芯片内可以实现高通量检测，因而在高通量筛选方面具有具有巨大优势。
31.上述筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，相比传统技术，具有如下有益效果：
32.1)利用微流控芯片结构，均匀的生成液滴，将突变株与扩增体系均匀的包被在液滴中，每个突变株释放自身合成的dna突变聚合酶作为反应所需的dna聚合酶，以两侧引物作为扩增引物，以自身突变基因为模板进行多轮扩增。本发明适用于不同条件下正向dna突变聚合酶的筛选，包括快速扩增性能、强耐受抑制物性、高盐等特性等。
33.2)微流控液滴生成技术生成油包水结构，将每一个突变株与相应的反应体系(如含有抑制物、高盐等)均匀的包裹在独立的空间内，高效提高扩增反应，减少交叉影响。
34.3)通过一个芯片实现突变株的高效筛选。利用微流控芯片技术，实现突变株输入芯片，突变核酸输出芯片，实现多步一体化整合，将dna聚合酶突变株筛选与终产物回收集合于一张芯片，将多步实验步骤简单化。
35.4)在扩增腔室内，可以通过加热部控制扩增腔室的温度，具体地，扩增腔室的位置处设置有第一加热片、所述第二加热片以及所述第三加热片，以用于调控核酸扩增过程中的变性温度、退火温度以及延伸温度，实现不同位置温度的间隔控制，实现温度循环，达到扩增的效果，省去使用昂贵的大型温度循环装置，降低成本，增加可操作性。
36.5)通过本发明中的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，可以实现对多种dna聚合酶的正向筛选，包括taq dna聚合酶、高保真聚合酶以及恒温扩增聚合酶等。
附图说明
37.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.为了更完整地理解本技术及其有益效果，下面将结合附图来进行说明。其中，在下面的描述中相同的附图标号表示相同部分。
39.图1为本发明一实施例所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片示意图；
40.图2为本发明一实施例所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片爆炸图；
41.图3为本发明一实施例所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片的加热部示意图；
42.图4为本发明实施例2所述的电泳检测示意图，图4中，数字1为微流控芯片反应后从回收腔室处收集的终产物；数字2为taq酶基因片段对照(普通pcr扩增结果)；
43.图5为本发明实施例4中突变酶a与野生型酶扩增活性电泳检测示意图；
44.图6为本发明实施例5中突变酶b与野生型酶在含盐环境下扩增活性荧光定量pcr检测示意图；
45.图7为本发明实施例5中突变酶b与野生型酶在含盐环境下扩增活性荧光定量pcr检测示意图；
46.图8为本发明实施例6中不同方法筛选后的突变酶库活性荧光定量pcr对比图。
47.附图标记说明
48.10、筛选dna聚合酶突变株微流控芯片；100、盖板；101、第一孔道；102、第二孔道；103、进液孔；104、微阀通孔；105、洗脱漂洗通孔；106、外排通孔；200、第一内板；201、第一连通孔；202、第二连通孔；203、分离腔室；204、进液腔室；205、磁珠腔室；206、回收腔室；207、缓冲腔室；208、微阀腔室；300、第二内板；301、扩增腔室；302、出液通道；303、第一腔室；304、第二腔室；400、底板；510、第一加热片；520、第二加热片；530、第三加热片。
具体实施方式
49.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
50.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
51.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
52.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
53.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
54.需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
55.在本发明的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
56.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
57.本技术实施例提供一种筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10，以解决现有的蛋白质改造过程中筛选方法存在的人工筛选工作量极大、csr技术需要多步操作且具有一定操作难度、qpix高通量克隆筛选需要借助大型筛选设备成本高的问题中的至少一种问题。以下将结合附图对筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10进行说明。
58.本技术实施例提供的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10，示例性的，请参阅图1所示，图1为本技术实施例提供的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10的结构示意图。本技术的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10能够用于高效筛选dna聚合酶突变株筛选用途，例如，taq dna聚合酶突变株筛选用途，还可以用于高保真聚合酶突变株筛选以及恒温扩增聚合酶突变株筛选等。
59.为了更清楚的说明筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10的结构，以下将结合附图对筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10进行介绍。
60.示例性的，请参阅图1所示，图1为本技术实施例提供的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10的结构示意图。
61.一种筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10，包括芯片主体，芯片主体上具有上样孔、进液孔103、扩增腔室301、分离腔室203、进液腔室204、微阀腔室208、磁珠腔室205以及回收腔室206，上样孔与扩增腔室301连通，扩增腔室301、分离腔室203、进液腔室204、微阀腔室208、磁珠腔室205以及回收腔室206依次顺序连通，进液孔103与分离腔室203相通。
62.在其中一些实施例中，筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10在使用时，可以通过第三方控温部件对扩增腔室301进行控温，需要说明的是，控温部件可以实现扩增腔室301的温度按照扩增程序的温度需要进行循环变化。控温部件可以多个加热金属片，不同的加热金属片的温度根据需要进行设置。
63.在其中一些实施例中，芯片主体上设置加热部，加热部用于加热扩增腔室301内的液体，加热部包括第一加热片510、第二加热片520以及第三加热片530，第一加热片510、第二加热片520以及第三加热片530依次顺序分布以分布用于调控核酸扩增过程中的变性温度、退火温度以及延伸温度。第一加热片510、第二加热片520以及第三加热片530均可以是加热金属片。参见图1所示，扩增腔室301对应的位置处，沿着顺时针方向，第一加热片510、第二加热片520、第三加热片530依次顺序分布。第一加热片510、第二加热片520以及第三加热片530的数量及温度设置分别依照扩增所需温度条件进行相应改变。
64.在其中一些实施例中，上样孔的数量为多个。多个上样孔分别通过上样通道与扩增腔室301相通，第一加热部与上样通道的位置对应，第一加热部通过对上样通道加热以实现对进入扩增腔室301内的液体进行加热。
65.在其中一些实施例中，扩增腔室301包括多个呈同心圆分布的圆环状的扩增子腔室，各个扩增子腔室均连通出液通道302。多个圆环状的扩增子腔室能够大大提高扩增效率。另外，圆环状的扩增子腔室的设计，能够实现扩增子腔室内的扩增反应液循环流动，提高扩增效率。
66.在其中一些实施例中，分离腔室203弯折呈迂回状结构。优选地，分离腔室203中含有矩阵结构用于液滴结构破碎。例如，参见图1所示，分离腔室203呈m形状弯折。
67.在其中一些实施例中，分离腔室203的数量为多个，相邻的分离腔室203之间设置有缓存腔室。参见图1所示，分离腔室203的数量为两个，两个分离腔室203之间设置有缓冲腔室207。
68.在其中一些实施例中，参见图2所示，芯片主体包括盖板100、第一内板200、第二内板300以及底板400。盖板100、第一内板200、第二内板300以及底板400依次层叠连接；其中，盖板100上贯穿有上样孔以及进液孔103，第一内板200上贯穿有与上样孔对应的第一连通孔201以及与分离腔室203相通的第二连通孔202，第一内板200上还设置有分离腔室203、进液腔室204、微阀腔室208、磁珠腔室205以及回收腔室206，第二内板300上设置有第一腔室303、第二腔室304、扩增腔室301以及出液通道302，扩增腔室301通过出液通道302与第二连通孔202相通。第一腔室303与第二孔道102相通，第二腔室304与第一孔道101相通，第一腔室303、第二腔室304还与扩增腔室301相通。
69.在其中一些实施例中，上样孔包括第一孔道101以及第二孔道102。第一孔道101的两侧分别设置有至少一个第二孔道102，第一孔道101用于供水相以及核酸扩增反应体系注入，第二孔道102用于供油相注入。参见图1所示，第一孔道101的两侧分别设置有一个第二孔道102。
70.在其中一些实施例中，筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10还包括磁性结构。磁性结构用于固定磁珠腔室内的磁珠的位置。
71.在其中一些实施例中，微阀腔室208上设置有柱式微阀，对通道进行封闭。
72.本技术一实施例还提供了一种筛选dna聚合酶突变株方法。
73.一种筛选dna聚合酶突变株方法，采用筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10，包括如下步骤：
74.步骤(1)突变库建立，通过易错pcr(error prone pcr)或dna改组(dna shuffle)等技术对dna聚合酶的基因片段进行随机突变，将突变的多个基因片段均连接至表达载体后(如pet28a等)，均转入宿主表达细胞中(bl21等)进行诱导表达，并收集形成一个突变库；将突变库菌液过夜活化后，按照1：100接入新鲜lb培养基中进行培养，至od
600
为1.0时，加入1mm iptg进行诱导表达6h。
75.步骤(2)将诱导表达后的菌液用扩增缓冲液洗涤至少一次后稀释形成稀释菌液；其中，扩增缓冲液可以选择为pbs溶液。例如，稀释菌液的浓度为104cfu/μl。
76.步骤(3)控制稀释菌液经过其中一个上样孔上样，控制油相由另一个上样孔上样，使得稀释菌液与油相形成油包水样的含有单个菌体的液滴。
77.步骤(4)控制第一加热片510的温度、第二加热片520的温度以及第三加热片530的温度，其中第一加热片510的温度设置为95℃，第二加热片的温度设置为55℃，第三加热片530的温度为72℃，在扩增腔室301内，以自身突变的基因片段作为模板，以dna突变聚合酶作为反应所需的dna聚合酶，以两侧引物作为扩增引物进行多轮扩增，得到扩增产物。
78.步骤(5)控制乙醚由进液孔103进入并与扩增后的扩增产物混合后进入分离腔室203，通过分离腔室203实现扩增产物的油相与水相分离，分离腔室203的所有液体进入进液腔室204。
79.步骤(6)来自分离腔室203的水相进入进液腔室204后，与洗脱漂洗通孔105进入的裂解液混合进行裂解反应，裂解反应后的核酸产物进入磁珠腔室205。
80.步骤(7)通过磁性结构如磁铁对磁珠进行的位置进行固定，对磁珠进行漂洗；漂洗时漂洗液通过与进液腔室204相通或者与磁珠腔室205相通的洗脱漂洗通孔105加入磁珠腔室205内。
81.步骤(8)对磁珠进行进行洗脱得到终产物，终产物经回收腔室206进行回收。洗脱时洗脱液通过与进液腔室204相通或者与磁珠腔室205相通的洗脱漂洗通孔105加入洗脱腔室内。
82.在其中一些实施例中，筛选dna聚合酶突变株方法还包括如下步骤：
83.步骤(9)对回收腔室206回收的终产物酶切后连接至载体进行测序。其中的载体可以根据实际需要进行设置。
84.在其中一些实施例中，筛选dna聚合酶突变株方法还包括如下步骤：
85.步骤(10)将回收腔室206回收的终产物转入表达菌株后，重复步骤(1)-步骤(8)重复进行富集筛选。
86.在其中一些实施例中，油相含有油以及表面活性剂。油包括但不限于kerosene(煤油)、lubricating oil(润滑油)、cyclohexane(环己烷)、hydrocarbon oils(烃类油)、mineral oil(矿物油)以及fluorocarbon oils(氟碳油)中的一种或几种；其中，表面活性剂包括但不限于tween 20、span 80等；表面活性剂以5％比例混入油中最终形成上述的油相。
87.上述筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10，实现了在dna聚合酶突变株筛选过程中的生物、化学等整个反应和分析过程集成到一块芯片上，自动完成整个需要在实验室完成的复杂的实验过程，包括样品制备、反应、分离、检测等基本操作流程，可以在一块芯片内可以实现高通量检测，因而在高通量筛选方面具有具有巨大优势。
88.实施例1
89.本实施例提供了一种筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10。
90.参见图1及图2所示，一种筛选dna聚合酶突变株微流控芯片10，包括芯片主体。本实施例中，芯片主体的制备材料为pdms及玻璃。芯片主体包括由上至下依次分布的盖板100、第一内板200、第二内板300以及底板400。盖板100、第一内板200、第二内板300以及底板400依次层叠连接。
91.盖板100上贯穿有上样孔、进液孔103、微阀通孔104、漂洗液通孔、洗脱漂洗通孔105以及外排通孔106。上样孔包括第一孔道101以及第二孔道102，第一孔道101的两侧分别设置有一个第二孔道102。第一孔道101以及第二孔道102均与扩增腔室301连通，扩增腔室301、分离腔室203、微阀腔室208、进液腔室204、磁珠腔室205以及回收腔室206依次顺序连通，进液孔103与分离腔室203相通。进液腔室204与分离腔室203之间的通道上设置有柱式微阀。其中，微阀通孔104与微阀腔室208相通，漂洗液通孔与磁珠腔室205相通，洗脱漂洗通孔与磁珠腔室205相通相通，外排通孔106与回收腔室206相通。需要说明的是，在另一个示例中，漂洗液通孔与洗脱漂洗通孔105可以是共用一个通孔(如图2中所示的洗脱漂洗通孔105)即可，也即漂洗、洗脱可以在一个腔室如磁珠腔室205内进行。
92.第一内板200上贯穿有与上样孔对应的第一连通孔201以及与分离腔室203相通的
第二连通孔202，第一内板200上设置有分离腔室203、进液腔室204、磁珠腔室205以及回收腔室206，第二内板300上设置有第一腔室303、第二腔室304、扩增腔室301以及出液通道302。第一腔室303与第二孔道102相通，第二腔室304与第一孔道101相通，第一腔室303、第二腔室304还与扩增腔室301相通。扩增腔室301通过出液通道302与第二连通孔202相通。扩增腔室301包括多个呈同心圆分布的圆环状的扩增子腔室，各个扩增子腔室均连通出液通道302。分离腔室203呈m形状弯折的迂回状结构。分离腔室203的数量为两个，两个分离腔室203之间设置有缓冲腔室207。
93.芯片主体上设置加热部，参见图3所示，加热部包括第一加热片510、第二加热片520以及第三加热片530，第一加热片510、第二加热片520以及第三加热片530依次顺序分布以分布用于调控核酸扩增过程中的变性温度、退火温度以及延伸温度。
94.实施例2
95.本实施例提供了一种筛选taq dna聚合酶突变株方法。
96.一种筛选taq dna聚合酶突变株方法，采用实施例1中的筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10，包括如下步骤：
97.步骤(1)突变库建立，通过易错pcr(error prone pcr，ep pcr)或dna改组(dna shuffle)等技术对dna聚合酶的基因片段(包括taq聚合酶，bst酶等)进行随机突变，将突变的多个基因片段均连接至表达载体后(如pet28a等)，均转入宿主表达细胞中(bl21等)进行诱导表达，并收集形成一个突变库；将突变库菌液过夜活化后，按照1：100接入新鲜lb培养基中进行培养，至od
600
为1.0时，加入1mm iptg进行诱导表达6h。
98.步骤(2)将诱导表达后的菌液离心后重悬于含有0.5％盐浓度的pcr buffer中，pcr buffer含有taq酶两侧引物f及引物r，菌液浓度稀释形成104cfu/μl的稀释菌液；其中，扩增缓冲液可以选择为pbs溶液。
99.步骤(3)控制水相(水相为上述的稀释菌液)以1.2μl/min的速度由上样泵经过第一孔道101上样，控制油相以6μl/min的速度由上样泵经过第二孔道102上样，使得含有稀释菌液的水相与油相形成油包水样的含有单个菌体的均匀液滴。
100.步骤(4)控制第一加热片510的温度、第二加热片520的温度以及第三加热片530的温度，其中第一加热片510的温度设置为95℃，第而加热片的温度设置为55℃，第三加热片530的温度为72℃，在扩增腔室301内，以自身突变的基因片段作为模板，以dna突变聚合酶作为反应所需的dna聚合酶，以两侧引物作为扩增引物进行多轮扩增，得到扩增产物。
101.步骤(5)控制乙醚由进液孔103进入并与扩增后的扩增产物混合后进入分离腔室203，通过分离腔室203实现扩增产物的油相与水相分离，分离腔室203的所有液体进入进液腔室204。
102.步骤(6)来自分离腔室203的水相进入进液腔室204后，与进液腔室204中裂解液混合进行裂解反应，保持进液腔室204与分离腔室203之间的通道上设置有柱式微阀开启，裂解反应后的核酸产物进入磁珠腔室205，磁珠腔室205内的磁珠被磁性结构吸附，废液经过磁珠腔室205以及回收腔室206后经由与回收腔室206相通的外排通孔106外排，外排之后，进液腔室204与分离腔室203之间的通道上设置有柱式微阀关闭。
103.步骤(7)对磁珠腔室205内的磁珠进行漂洗；漂洗时通过与进液腔室204相通或者与磁珠腔室205相通的漂洗液通孔加入磁珠腔室205内。
104.步骤(8)对磁珠腔室205内的磁珠洗脱得到终产物，终产物经回收腔室206进行回收。洗脱时通过与进液腔室204相通或者与磁珠腔室205相通的洗脱漂洗通孔加入洗脱腔室内。
105.步骤(9)将回收腔室206回收的终产物转入表达菌株后，重复步骤(1)-步骤(8)重复进行富集筛选，过三次循环反应。
106.步骤(10)对回收腔室206回收的终产物，酶切后连接至载体进行测序。终产物经测定浓度为13.2ng/μl，终产物经电泳检测与预期片段一致，电泳检测参见图4所示，图4中，数字1为微流控芯片反应后从回收腔室206处收集的终产物；数字2为taq酶基因片段对照(普通pcr扩增结果)，图4的结果说明本实施例的筛选taq dna聚合酶突变株方法可以用于dna突变聚合酶片段的扩增。
107.实施例3
108.本实施例提供了一种筛选taq dna聚合酶突变株方法。
109.本实施例的筛选taq dna聚合酶突变株方法采用实施例1中的筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10，本实施例的筛选taq dna聚合酶突变株方法与实施例2基本相同，其区别在于，油相与水相的速度不同。
110.通过设定不同的油相速度及水相速度，使用实施例1的高效筛选taq dna聚合酶突变株的微流控芯片进行三轮扩增，对获得的终产物核酸浓度进行测定，对结果进行分析，每经过一轮筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10反应，终产物的核酸浓度相应提高，参见表1所示，说明经过实施例1的高效筛选taq dna聚合酶突变株的微流控芯片筛选后的突变株在群体中的比例逐步提升，且具有更高的扩增效率。
111.表1扩增富集效果(单位ng/μl)
[0112] 第一轮第二轮第三轮条件1：油相6μl/min；水相1.2μl/min8.318.343.2条件2：油相4μl/min；水相0.8μl/min5.215.634.2
[0113]
实施例4
[0114]
本实施例提供了一种筛选taq dna聚合酶突变株方法。
[0115]
本实施例的筛选taq dna聚合酶突变株方法采用实施例1中的筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10，本实施例的筛选taq dna聚合酶突变株方法与实施例2基本相同，其区别在于，本实施例中，将taq酶片段进行eppcr突变后连接至pet28a表达载体，将酶连产物转入bl21(de3)表达菌株并收集突变库。将突变库菌株进行过夜活化，第二天以1:100的比例转接入含有卡那霉素(50μg/ml)新鲜lb培养基中，培养至od
600
为1.0后，加入iptg 1mm进行诱导6h，收集菌体。将菌体离心后pbs洗剂一次，最终重悬于pcr buffer中(pcr buffer含有taq酶两侧引物f及引物r)，将菌体浓度稀释至104cfu/μl形成稀释菌液。按照实施例2的步骤(3)-步骤(9)进行2轮富集筛选，最终得到的终产物连入pet28质粒，转入bl21菌株。随机挑选20个克隆测序分析后，将其中获得的克隆a进行纯化表达，与野生型酶同时进行pcr实验(调整初始浓度一致后，2倍倍比稀释4个浓度)，结果发现突变酶a相较野生型酶有较强的扩增活性，扩增的终产物通过电泳检测，电泳检测结果见图5所示，由图5可知，采用筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10富集的终产物的浓度较高。
[0116]
实施例5
[0117]
本实施例提供了一种筛选taq dna聚合酶突变株方法。
[0118]
本实施例的筛选taq dna聚合酶突变株方法采用实施例1中的筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10，本实施例的筛选taq dna聚合酶突变株方法与实施例4基本相同，其区别在于，本实施例中，最终得到的终产物连入pet28质粒，转入bl21菌株。随机挑选挑选20个克隆分别进行小量蛋白纯化，将获得的粗酶在含盐条件下进行活性测试，获得突变株b具有较强的扩增活性。将突变酶b与野生型酶进行荧光定量pcr(qpcr法)测试，检测结果见图6、图7所示，由图6、图7可知，结果显示突变酶b在不同盐浓度(0.5％盐溶液、1％盐溶液)下相比野生型酶均具有较强的荧光信号和较好的扩增曲线，代表经过筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10筛选得到的突变酶b扩增性能更为优异。
[0119]
实施例6
[0120]
本实施例提供了一种筛选taq dna聚合酶突变株方法。
[0121]
本实施例的筛选taq dna聚合酶突变株方法采用实施例1中的筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10，本实施例的筛选taq dna聚合酶突变株方法与实施例4相同，本实施例中，将收集的突变库lib1(参见附图8所示)与传统人工定向筛选方法收集的突变库lib2(参见附图8所示)以及野生型taq酶(参见附图8所示)进行扩增活性测试，由图8可知，使用实施例1中的筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10收集的突变库具有更优异的扩增曲线，说明采用实施例1中的筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10富集得到的突变酶的扩增活性较野生型酶有明显提升，且优于传统方法收集的lib2中突变酶。
[0122]
综上，上述筛选taq dna聚合酶突变株微流控芯片10，相比传统技术，具有如下有益效果：
[0123]
1)利用微流控芯片结构，均匀的生成液滴，将突变株与扩增体系均匀的包被在液滴中，每个突变株释放自身合成的dna突变聚合酶作为反应所需的dna聚合酶，以两侧引物作为扩增引物，以自身突变基因为模板进行多轮扩增。本发明适用于具有耐受抑制物、高盐等特性等不同条件下具有高扩增活性的正向dna突变聚合酶的筛选。
[0124]
2)微流控液滴生成技术生成油包水结构，将每一个突变株与相应的反应体系(如含有抑制物、高盐等)均匀的包裹在独立的空间内，高效提高扩增反应，减少交叉影响。
[0125]
3)通过一个芯片实现突变株的高效筛选。利用微流控芯片技术，实现突变株输入芯片，突变核酸输出芯片，实现多步一体化整合，将dna聚合酶突变株筛选与终产物回收集合于一张芯片，将多步实验步骤简单化。
[0126]
4)在扩增腔室301内，可以通过加热部控制扩增腔室301的温度，具体地，扩增腔室301的位置处设置有第一加热片510、第二加热片520以及第三加热片530，以用于调控核酸扩增过程中的变性温度、退火温度以及延伸温度，实现不同位置温度的间隔控制，实现温度循环，达到扩增的效果，省去使用昂贵的大型温度循环装置，降低成本，增加可操作性。
[0127]
5)通过本发明中所述芯片，可以实现对多种dna聚合酶的正向筛选，包括taq dna聚合酶、高保真聚合酶以及恒温扩增聚合酶等。
[0128]
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
[0129]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存
在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0130]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，其特征在于，包括芯片主体，所述芯片主体上具有上样孔、进液孔、扩增腔室、分离腔室、进液腔室、磁珠腔室以及回收腔室，所述上样孔与所述扩增腔室连通，所述扩增腔室、所述分离腔室、所述进液腔室、所述磁珠腔室以及所述回收腔室依次顺序连通，所述进液孔与所述分离腔室相通。2.根据权利要求1所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，其特征在于，所述芯片主体上设置加热部，所述加热部用于加热所述扩增腔室内的液体，所述加热部包括第一加热片、第二加热片以及第三加热片，所述第一加热片、所述第二加热片以及所述第三加热片依次顺序分布以分布用于调控核酸扩增过程中的变性温度、退火温度以及延伸温度。3.根据权利要求2所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，其特征在于，所述上样孔的数量为多个，多个所述上样孔分别通过上样通道与所述扩增腔室相通。4.根据权利要求2所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，其特征在于，所述扩增腔室包括多个呈同心圆分布的圆环状的扩增子腔室，各个所述扩增子腔室均连通出液通道。5.根据权利要求1-4任意一项所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，其特征在于，所述分离腔室弯折呈迂回状结构，分离腔室中含有矩阵结构用于液滴结构破碎。6.根据权利要求1-4任意一项所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，其特征在于，所述分离腔室的数量为多个，相邻的所述分离腔室之间设置有缓存腔室。7.根据权利要求1-4任意一项所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，其特征在于，所述芯片主体包括盖板、第一内板、第二内板以及底板，所述盖板、所述第一内板、所述第二内板以及所述底板依次层叠连接；其中，所述盖板上贯穿有所述上样孔以及所述进液孔，所述第一内板上贯穿有与所述上样孔对应的第一连通孔以及与所述分离腔室相通的第二连通孔，所述第一内板上还设置有所述分离腔室、所述进液腔室、所述磁珠腔室以及所述回收腔室，所述第二内板上设置有所述扩增腔室以及出液通道，所述扩增腔室通过所述出液通道与所述第二连通孔相通。8.根据权利要求1-4任意一项所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，其特征在于，所述上样孔包括第一孔道以及第二孔道，所述第一孔道的两侧分别设置有至少一个所述第二孔道，所述第一孔道用于供水相注入，所述第二孔道用于供油相注入。9.根据权利要求1-4任意一项所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，其特征在于，所述筛选dna聚合酶突变株微流控芯片还包括磁性结构，所述磁性结构用于固定磁珠腔室内的磁珠的位置；和/或，所述进液腔室与所述分离腔室之间的通道上设置有柱式微阀。10.一种筛选dna聚合酶突变株方法，其特征在于，采用权利要求1-9任意一项所述的筛选dna聚合酶突变株微流控芯片，包括如下步骤：步骤(1)突变库建立，对dna聚合酶的基因片段进行随机突变，将突变的多个基因片段均连接至表达载体后，均转入宿主表达细胞中进行诱导表达；步骤(2)将诱导表达后的菌液用扩增缓冲液洗涤至少一次后稀释形成稀释菌液；步骤(3)控制稀释菌液经过其中一个上样孔上样，控制油相由另一个上样孔上样，使得稀释菌液与油相形成油包水样的含有单个菌体的液滴；步骤(4)控制扩增腔室的温度，以自身突变的基因片段作为模板，以dna突变聚合酶作为反应所需的dna聚合酶，以两侧引物作为扩增引物进行多轮扩增，得到扩增产物；
步骤(5)控制乙醚由进液孔进入并与扩增后的扩增产物混合后进入分离腔室，通过分离腔室实现扩增产物的油相与水相分离，所述分离腔室的所有液体进入进液腔室；步骤(6)来自所述分离腔室的水相进入进液腔室后，与进液腔室中裂解液混合进行裂解反应，裂解反应后的核酸产物进入磁珠腔室，核酸产物被磁珠吸附；步骤(7)通过磁性结构固定磁珠腔室内的磁珠的位置，对磁珠进行进行漂洗；步骤(8)对磁珠进行洗脱得到终产物，终产物经回收腔室进行回收。11.根据权利要求10所述的筛选dna聚合酶突变株方法，其特征在于，还包括如下步骤：步骤(9)对所述回收腔室回收的终产物酶切后连接至载体进行测序。12.根据权利要求10所述的筛选dna聚合酶突变株方法，其特征在于，还包括如下步骤：步骤(10)将所述回收腔室回收的终产物转入表达菌株后，重复步骤(1)-步骤(8)重复进行富集筛选。

技术总结
本发明公开了一种筛选DNA聚合酶突变株微流控芯片及其方法，筛选DNA聚合酶突变株微流控芯片包括芯片主体，所述芯片主体上具有上样孔、进液孔、扩增腔室、分离腔室、进液腔室、磁珠腔室以及回收腔室，所述上样孔与所述扩增腔室连通，所述扩增腔室、所述分离腔室、所述进液腔室、所述磁珠腔室以及所述回收腔室依次顺序连通，所述进液孔与所述分离腔室相通。本发明的筛选DNA聚合酶突变株微流控芯片能够实现扩增液滴生成、核酸扩增和核酸回收一体化操作，快速实现不同条件下对正向突变DNA聚合酶高通量筛选。筛选。筛选。


技术研发人员：王玉宁 吴力强 王刚 钱纯亘
受保护的技术使用者：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/13