一种用于工业生产现制液体胶原蛋白肽的生产工艺及应用的制作方法

1.本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种用于工业生产现制液体胶原蛋白肽的生产工艺及应用。


背景技术：

2.胶原蛋白肽是一类以富含胶原蛋白的新鲜动物组织(包括皮、骨、筋、腱、鳞等)为原料，经过提取、水解、精制生产的、相对分子质量低于10000da的产品。胶原蛋白肽具有美容护肤、抗高血压、胃粘膜保护，预防和抑制关节炎、骨质疏松等诸多功效。胶原蛋白肽作为原料制备得到的胶原蛋白饮品更是受到年轻女性的追捧。
3.胶原蛋白肽的制备方法主要有，酶水解法、化学法、微生物发酵法和基因法。而化学法主要停留在实验室的小试研究，且研究成本较高；微生物发酵法的发酵时间较长，对发酵条件要求较苛刻，受多种发酵因素的影响，所制备得到的发酵产物成分不均一、多且杂；基因工程法中，基因的表达效率较低，且容易出现表达错误造成安全性问题。胶原蛋白肽最主要的一个特征就是小分子的含量高，若分子量高则会导致难以消化吸收。而酶水解可以将胶原蛋白水解成众多小片段的低分子量的胶原蛋白肽，具有更高的几率穿过肠屏障，使得生物活性增加，抗原性降低。
4.中国发明专利cn102533913b公开了一种采用共固定化双酶水解鱼鳞胶原蛋白制备抗氧化活性肽的方法，先采用交联法固定化双酶，对鱼鳞进行浸泡预处理，除去鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白，利用共固定化酶对鱼鳞蛋白进行定向水解，得到鱼鳞蛋白酶解液，脱色脱腥，经超滤分离、真空浓缩、冷冻干燥等后处理得到活性肽。该方法酶解效率高，酶可以多次利用，酶解产物易于纯化；为淡水鱼废弃物的有效利用提供了一条新途径；且活性肽产品可用于药品、食品和化妆品等领域。
5.中国发明专利cn114045323a公开了一种多级酶解工艺制备鱼皮鱼鳞胶原蛋白肽粉的方法，包括步骤：将鱼皮鱼鳞清洗、破碎制成原料浆料后加氢氧化钠，超声处理，得初级水解料液；加碱性蛋白酶，得一级生化降解料液；再加入碱性蛋白酶，得到二级生化降解料液；加胶原蛋白酶得到三级生化降解料液；加中性蛋白酶、风味酶反应，得四级生化降解料液；加木瓜蛋白酶、胱氨酸、氯化钙溶液、葡萄糖酸钙，得到五级生化降解料液；过滤，得胶原蛋白肽胶液；加活性炭粉脱色、离心、冷冻干燥，即得胶原蛋白肽粉。该发明采用多级酶解工艺，经过脱腥处理，使用超声波辅助，再提高酶活性，水解度，利用率高，水解彻底，制成的胶原蛋白肽粉气味良好，产量高。
6.为了减少细菌的污染并且延长保质期，胶原蛋白肽原料多是以胶原蛋白原液经喷雾干燥得到的粉末形式存在。胶原蛋白肽粉末生产过程是要经过喷雾干燥的处理，喷雾干燥是要经过180℃左右的热风处理，高温处理会使胶原蛋白肽产生一定剂量的杂环胺，对消费者的健康安全形成隐患。而原料到胶原蛋白肽粉再到液体胶原蛋白肽的制作，生产商为了节约成本，往往使用快到保质期限的胶原蛋白肽粉，消费者喝到的胶原蛋白肽饮中的活性成分已大量流失，且口感发生了改变，安全健康指数下降。而且，酶水解胶原蛋白对酶的
50min，得到酶解蛋白肽溶液。
30.进一步优选地，所述灭酶提取，具体为：将所述酶解液升温至90℃保温45min，得到酶解蛋白肽溶液。
31.优选地，步骤(4)中，所述酶解蛋白肽溶液降温至50℃。
32.优选地，步骤(4)中，所述活性炭的添加量为鱼鳞质量的2-10％。
33.进一步优选地，所述活性炭的添加量为鱼鳞质量的6-8％。
34.优选地，步骤(4)中，所述过滤设备为陶瓷膜过滤设备和纳滤膜设备。
35.进一步优选地，所述陶瓷膜过滤设备的孔径为200nm，压力为0.4mpa；所述纳滤膜设备的纳滤膜孔径为200d。
36.优选地，步骤(4)中，所述灭菌处理具体为，灭菌温度为80-98℃，灭菌20-50min。
37.进一步优选地，所述灭菌处理具体为，灭菌温度为95℃，灭菌30min。
38.另一方面，本发明提供一种液体胶原蛋白肽，由上述制备方法所制备得到。
39.最后，本发明提供上述制备方法所制备得到的液体胶原蛋白肽在制备胶原蛋白肽饮品中的应用。
40.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
41.1、本发明提供了一种液体胶原蛋白肽的制备方法，鱼鳞经过润涨、酶解、灭酶提取、吸附等工艺制备得到液体胶原蛋白肽，其中酶解步骤中，在碱性条件下一次性加入碱性蛋白酶、中性木瓜蛋白酶，不仅简化了酶解工艺，而且经酶解得到的液体胶原蛋白肽中分子量在250-500da的肽段比例高，补水及抗氧化效果好。
42.2、本发明的液体胶原蛋白肽的制备方法中，无浓缩喷雾步骤，通过对特定条件的酶解、吸附，使液体胶原蛋白肽具有较好的口感，无异味风味。
43.3、本发明的液体胶原蛋白肽经过高温灭菌后具有很好的稳定性，不易染菌，且无杂环胺等物质，安全健康。
附图说明
44.图1是本发明制备得到的液体胶原蛋白肽与市售胶原蛋白肽粉溶解后的图。
具体实施方式
45.以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本技术要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本技术的发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本技术要求保护的范围之中。
46.下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
47.下述实施例中，所述鱼鳞为脱钙脱色预处理的鱼鳞，来源于罗非鱼鱼鳞、草鱼鱼鳞、黑鱼(班鱼)鱼鳞。碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶厂家为丹尼斯克(中国)有限公司、南宁东恒华道生物科技有限责任公司、山东隆科特酶制剂有限公司、诺维信(中国)投资有限公司。
48.本发明中所述的原料和实际，不同厂家的产品以及不同型号的产品对效果不具有显著性影响。
49.实施例1
50.(1)润涨：将1kg鱼鳞同6kg蒸馏水混合，加热水温至87℃，在搅拌转速为70rpm的条件下搅拌2h得到预处理液；
51.(2)酶解：将预处理液室温放置冷却到50℃，加入5％naoh调节ph至7.1后，加入碱性蛋白酶4.9g，中性木瓜蛋白酶4.1g，在温度为50℃下搅拌酶解5h得到酶解液；
52.(3)灭酶提取：将酶解液升温至90℃保温45min得到酶解蛋白肽液；
53.(4)吸附：蛋白肽液降温至50℃后加入70g的活性炭搅拌，搅拌20min后依次通过孔径为200nm，压力为0.4mpa的陶瓷膜过滤设备和孔径为200d的纳滤膜设备，在温度为95℃灭菌30min得到液体胶原蛋白肽。
54.实施例2-4
55.实施例2-4与实施例1不同的是，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶与中性木瓜蛋白酶的重量比不同，具体比例如下所示：
[0056] 碱性蛋白酶，g中性蛋白酶，g碱性蛋白酶：中性蛋白酶实施例14.94.11.2:1实施例2632:1实施例34.54.51:1实施例46.42.62.5:1
[0057]
其余步骤和参数均与实施例1相同。
[0058]
实施例5
[0059]
与实施例4不同的是，步骤(2)中，酶解的温度为60℃。其余步骤和参数均与实施例4相同。
[0060]
实施例6
[0061]
与实施例4不同的是，步骤(2)中，ph为6.8。其余步骤和参数均与实施例4相同。
[0062]
实施例7-9
[0063]
与实施例4不同的是，步骤(2)中，酶解的时间不同，具体酶解时间如下所示：
[0064] 酶解时间，h实施例45h实施例72h实施例84h实施例96h
[0065]
其余步骤和参数均与实施例4相同。
[0066]
对比例1-2
[0067]
与实施例4不同的是，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶与中性木瓜蛋白酶的重量比不同，具体比例如下所示：
[0068] 碱性蛋白酶，g中性蛋白酶，g碱性蛋白酶：中性蛋白酶对比例12.26.61:2.7对比例24.14.91:1.2
[0069]
其余步骤和参数均与实施例4相同。
[0070]
对比例3-4
[0071]
与实施例4不同的是，步骤(2)中，酶解的时间不同，具体酶解时间如下所示：
[0072] 酶解时间，h对比例37h对比例48h
[0073]
其余步骤和参数均与实施例4相同。
[0074]
对比例5
[0075]
与实施例4不同的是，步骤(2)中，酶解的温度为40℃。其余步骤和参数均与实施例4相同。
[0076]
对比例6
[0077]
与实施例4不同的是，步骤(2)中，ph为8.0。其余步骤和参数均与实施例4相同。
[0078]
对比例7
[0079]
与实施例4不同的是，步骤(2)中，所使用的酶不同，将中性木瓜蛋白酶替换为中性蛋白酶，所述中性蛋白酶是是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的酶，酶活力为20万u/g。
[0080]
其余步骤和参数均与实施例4相同。
[0081]
试验1胶原蛋白肽分子量测定
[0082]
对实施例和对比例得到的液体胶原蛋白肽进行肽分子量测定。
[0083]
测定方法：根据gb/t22492法检测其肽分子量的分布，检测波长220nm。各分子量范围所占比例(％)的检测结果见表1。
[0084]
表1
[0085]
[0086][0087]
液体胶原蛋白肽分子量在245-500为最优的分子量范围，此肽段范围内稳定的胶原三肽结构极易被人体吸收，且吸收率高，具有很好的抗氧化及补水效果，有效激活皮肤真皮层中胶原纤维母细胞合成胶原蛋白，胶原三肽含量越高，效果越好。
[0088]
从表1中可以看出，在实施例1-4和对比例1-2中，实施例2和实施例4中分子量在245-500的比例最高，实施例1和实施例3次之，对比例1-2的比例最低。其中，实施例4约为对比例1-2的2.2倍。可见碱性蛋白酶和中性蛋白酶的比例对于分子量有着重要的影响。
[0089]
实施例7-实施例9和对比例3-4的结果可知，酶解时间亦对分子量的比例有着重要的影响，虽然酶解时间长，小分子含量偏高，但上述实施例7-9和对比例3-4中，部分小分子肽的是没有补水及抗氧化功效的，因此，并不是酶解时间越长效果越好。
[0090]
试验2补水效果测试
[0091]
1.试验对象：共计320名女性受试者，年龄在30-50岁，皮肤水分均≤12％。
[0092]
2.样品：共有16组样品，分别为实施例1-9和对比例1-7。
[0093]
3.仪器：油脂水分测试仪(德国ck sd27)
[0094]
4.试验方法：采用双盲随机分组，组间和自身两种对照设计，将320名受试者随机分为16组，每组20名人员。每组服用对应实施例1-9和对比例1-7的样品，每日1次，每次1瓶(50ml)。连续观察35天。试验期间16组受试者不得服用其它保持皮肤水分的物品且正常饮食。
[0095]
5.皮肤水分指标测定
[0096]
测试前额眉间皮肤的水分。测定环境在宽敞、通风条件良好，温度、湿度等空间环境稳定的检查室进行。在安静状态下用洁净棉球蘸蒸馏水清洁被测部位，擦干后15min进行水份的测定，试验前后测定工作由同一台仪器、同一人操作。
[0097]
6.试验数据统计
[0098]
结果用均值
±
标准差表示，试食前后自身比较用配对t检验，组间比较用成组t检验。
[0099]
7.结果及分析
[0100]
皮肤水分变化情况见表2。试验前后皮肤水分变化比较，％，均值
±
标准差。
[0101]
表2
[0102][0103][0104]
注：实验前后比较，经t检验，**表示p《0.01，*表示p《0.05；实施例1和对比例1分别同实施例4比较，经t检验##表示p《0.01；实施例1同对比例1比较，经t检验，&&表示p《0.01。
[0105]
(1)实施例1，实施例2，实施例4，实施例5，实施例8试食后皮肤水分与试食前比较差异有非常显著性(p《0.01)，实施例3，实施例6，实施例7和实施例9试食后皮肤水分与试食前比较差异有显著性(p《0.05)，对比例1-7试食后皮肤水分与试食前比较无显著差异性，说明实施例19组样品均有显著增加皮肤水分的作用，对比例1-7样品增加皮肤水分效果不明显，补水效果可能需要更长的服用时间。
[0106]
(2)实施例2和实施例4水分增量t检验分析比较，均无显著性关系，说明实施例2和实施例4的样品对于增加皮肤水分的作用无差别，效果一样；实施例1和实施例3水分增量t检验分析比较，无显著性关系，说明这两组样品增加皮肤水分的效果一样。
[0107]
(3)实施例4同实施例1和对比例1水分增量t检验分析比较，均显著性相关(p《0.01)，说明实施例4的样品在增加皮肤水分方面，效果显著好于实施例1和对比例1；实施例1水分增量与对比例1水分增量t检验分析比较，显著性相关(p《0.01)，说明实施例1的样品在增加皮肤水分方面，与对比例1有显著性差异，实施例1要优于对比例1。表明碱性蛋白酶
的比例和中性蛋白酶的比例对于补水效果的影响有至关影响。
[0108]
试验3液体胶原蛋白肽抗氧化实验测试
[0109]
对实施例1-9和对比例1-7制备得到的液体胶原蛋白肽进行抗氧化实验。
[0110]
1、羟自由基清除率测试
[0111]
方法：取1.0ml1,10-菲啰啉(1.865mmol/l)与2.0ml样品液于具塞试管中混合，加入1.0mlfeso
4.
7h20(1.865mmol/l)，最后加入1.0mlh2o2溶液(0.03％，v/v)启动反应，将试管置于37℃水浴中反应60min，于536nm处测量反应混合液吸光度，并以蒸馏水代替样品液做阴性对照，以蒸馏水代替过氧化氢作为空白对照。
[0112]
样品对oh自由基的清除活性按下式计算：
[0113]
oh自由基清除率(％)＝(d-d0/(d
0-d1)
×
100％；
[0114]
式中：d为样品吸光度，d1为阴性对照吸光度，d0为空白对照吸光度，取五次测量的平均值检测结果如表3所示。
[0115]
2、o
2-自由基清除活性的测定
[0116]
取1ml样品溶液置于试管中，加入1ml氯化硝基四氮蓝(nbt，2.52mmol/l)和1ml烟腺哈二核酸(624mmol/l)，添加1ml吩嗪硫酸甲酯溶液(pms，120μmol/l)启动反应，于25℃下反应5min后测量产物560nm处吸光度，同时以蒸馏水代替样品液做空白对照样品液对o
2-自由基的清除活性按下式计算：
[0117]o2-自由基清除率(％)＝(c
0-c)/c0×
100％；
[0118]
式中：c0为空白对照吸光度，c为样品吸光度，取五次测量的平均值检测结果如表3所示。
[0119]
3、dpph自由基清除率实验方法：取2.5ml样品液置于试管中，加入2.5ml溶于95％乙醇的dpph溶液(0.1mmol)，将混合物激烈振荡10s，然后置于室温下反应30min，反应结束后，于517nm下测量反应混合物吸光度，同时以2.5ml蒸水代替样品液做空白对照。
[0120]
样品液对dpph自由基清除活性按如下方式计算：
[0121]
dpph自由基清除率(％)＝(b
0-b)/b0×
100％；
[0122]
式中：b0为空白对照吸光度，b为样品吸光度，取五次测量的平均值检测结果如表3所示。
[0123]
表3
[0124]
[0125][0126]
注：同实施例4相比，经t检验，**表示p《0.01，*表示p《0.05；对比例1-7同实施例1相比，经t检验，##表示p《0.01，#表示p《0.05
[0127]
实施例1-3和对比例1-2同实施例4数据相比，其中羟自由基消除率和超氧阴离子消除率实施例2同实施例4比较具有显著性差异，其余均有极显著性差异，而dpph自由基消除率实施例2同实施例4无差异，其余均为极显著性差异，表明抗氧化活性对于碱性蛋白酶和中性蛋白酶的比例更为敏感。
[0128]
实施例4同实施例7-9相比，只实施例8的dpph自由基消除率同实施例4无显著性差异，实施例8的羟自由基消除率同实施例4具有显著性差异，其余均为及显著性差异；对比例3-4同实施例1相比，均具有极显著性差异，表明酶解时间对于抗氧化活性有影响，最佳为5h。
[0129]
试验4试服口感测定
[0130]
实施例4得到的液体胶原蛋白肽口感同市售胶原蛋白肽粉末口感测评。
[0131]
1、评定方法
[0132]
评定小组由10人组成，5名男生，5名女生，年龄在25-35之间，小组人员编号1-10，均身体健康，无不良嗜好，对色、香、味有较强的分辨力和较高的灵敏度，室温下进行品评，每次感官评定前用温水漱口以保持口腔清爽。本实验由气味、滋味、苦味3个因素构成，对每个因素的评价按优、中、差三个等级相应分数评定。
[0133]
2、样品准备
[0134]
(1)样品1：实施例4生产的样品，每份50ml，含有5g胶原蛋白肽；
[0135]
(2)样品2：市售胶原蛋白肽粉(型号：j018，厂家：安达市旭朗生物科技有限公司)，每份取5g胶原蛋白肽，加水定容至50ml。
[0136]
3、感官评定参考标准，具体见表4。
[0137]
表4
[0138][0139]
4、感官评定结果
[0140]
具体感官评定结果见表5：
[0141]
表5
[0142][0143]
由以上结果可知，两个样品在气味、滋味、苦味上无显著性差异，说明胶原蛋白肽液体在感官上是合格的。
[0144]
图1是本发明实施例4所制备的液体胶原蛋白肽与市售胶原蛋白肽粉溶解后的图，其中，
①
号试管为山西隆贝生物科技有限公司的型号为j018胶原蛋白肽；
②
号试管为实施例4制备得到液体胶原蛋白肽；
③
号试管为山西隆贝生物科技有限公司的型号为j018胶原蛋白肽粉末溶解后在90℃下灭菌30min后状态图；
④
号试管为实施例4灭菌条件为90℃-30min的自制胶原蛋白肽；
⑤
号试管为山西隆贝生物科技有限公司的型号为j018胶原蛋白肽粉末溶解后调节ph为4.0的状态图；
⑥
号试管为实施例4制备得到的液体胶原蛋白肽调节ph至4.0的状态图。从图1中可以看出，本发明所制备的液体胶原蛋白肽无沉淀析出，状态稳定。
[0145]
试验5杂环胺检测
[0146]
对实施例4得到的液体胶原蛋白肽和山东隆贝生物科技有限公司，批号为c-yl-220820的胶原蛋白肽进行杂环胺的检测，参照标准gb5009.243-2016进行杂环胺的检测。
[0147]
检测结果见表6：
[0148]
表6
[0149]
检测项目实施例4隆贝胶原蛋白肽
2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4.5-f]喹啉(meiq)未检出(《0.1ug/kg)0.73ug/kg2-氨基-3,8二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(meiqx)未检出(《0.3ug/kg)未检出(《0.3pg/kg)2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[45-f](4,8-dimeiqx)未检出(《0.2ug/kg)未检出(《0.2pg/kg)2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(7,8-dimeiqx)未检出(《0.2pg/kg)未检出(《0.2pg/kg)2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4,5-b]吡啶(phip)未检出(《0.1ug/kg)0.35ug/kg
[0150]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种液体胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括步骤：(1)润涨：鱼鳞与水混合，加热搅拌，得到预处理液；(2)酶解：将预处理液冷却至45-60℃，加入氢氧化钠调节ph至6.8-7.4，加入碱性蛋白酶、中性木瓜蛋白酶进行酶解2-6h，得到酶解液；所述碱性蛋白酶与鱼鳞的重量比为0.2-0.7％：1；所述中性木瓜蛋白酶与鱼鳞的重量比为0.25-0.7％:1；(3)灭酶提取：将酶解液升温至70-95℃保温20-50min，得到酶解蛋白肽溶液；(4)吸附：酶解蛋白肽溶液降温至45-55℃后，添加活性炭并搅拌15-25min后，通过过滤设备后，经灭菌处理得到液体胶原蛋白肽。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述鱼鳞与水的固液比为1:4-8，g/ml；所述加热搅拌，具体为：加热至80-90℃，在转速为65-80rpm的条件下搅拌1-3h。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶与中性木瓜蛋白酶的重量比为1-2.6:1。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶与鱼鳞的重量比为0.6-0.65％:1；所述中性木瓜蛋白酶与鱼鳞的重量比为0.2-0.3％:1。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶、中性木瓜蛋白酶的酶活力为15万-25万u/g。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述灭酶提取，具体为：将所述酶解液升温至80-90℃保温40-50min，得到酶解蛋白肽溶液。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述活性炭的添加量为鱼鳞质量的2-10％。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述过滤设备为陶瓷膜过滤设备和纳滤膜设备；所述陶瓷膜过滤设备的孔径为200nm，压力为0.4mpa；所述纳滤膜设备的纳滤膜孔径为200d。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述灭菌处理具体为，灭菌温度为80-98℃，灭菌20-50min。10.权利要求1-9任一项所述的制备方法所制备得到的液体胶原蛋白肽在制备胶原蛋白肽饮品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种用于工业生产现制液体胶原蛋白肽的生产工艺及应用，涉及食品生物技术领域。该生产工艺将鱼鳞加热润涨后进行酶解，在碱性蛋白酶和中性木瓜蛋白酶的作用下得到酶解液，然后灭酶提取、吸附、灭菌后得到液体胶原蛋白肽。本发明能够高效的将鱼鳞大分子胶原蛋白酶解成分子量在250-500Da范围内肽段比例高的胶原蛋白肽，且补水及抗氧化效果佳，胶原蛋白肽的口感好，具有较高的稳定性，无杂环胺等物质，安全健康。将其应用于胶原蛋白肽饮品的制备中，深受消费者的喜爱。深受消费者的喜爱。深受消费者的喜爱。


技术研发人员：林峰 马涛 杨晓娜 董伟 张雨浩
受保护的技术使用者：未名太研生物科技（绍兴）有限公司
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/8/13