一种复方中药益生菌的发酵方法及其产物

1.本发明属于益生菌发酵技术领域，具体涉及一种复方中药四味穿心莲益生菌的发酵方法及其产物。
技术背景
2.中草药经发酵后具有增加有效成分含量、降低毒副作用、改善药物适口性、调节动物肠道菌群平衡等优点，传统发酵是利用植物中原有的天然菌种进行发酵，操作方法粗糙，可复制性较低，全凭经验制作，不能满足工业化生产需要。利用现代生物技术对发酵过程中的工艺条件包括培养基组分、发酵菌种、温度和ph等，液体发酵产物对益生菌和动物机体都有着良好的互作关系，可显著提高中药有效成分的提取率，可能产生新的活性物质，从而达到增强药效，节省药材资源，保护环境的效果。
3.然而当下中药发酵仅限于益生菌对单味中药发酵方法的研究。复方中药四味穿心莲由穿心莲、大青叶、辣蓼、葫芦茶四味中药组成，该方具有解热、抗炎、抗肿瘤、保护心肌细胞、保肝利胆等多种药理作用。该方在作为兽药使用时，主要用于治疗仔猪和雏鸡的大肠杆菌病、沙门氏菌病、猪丹毒。当下，该方在临床应用的主要是散剂，存在吸收不充分、起效慢，且中药提取物存在有机试剂残留问题。目前，对该方及方中单味药的发酵工艺均未见报道。


技术实现要素：

4.本发明目的在于：提供一种可以满足工业化生产需要的复方中药益生菌的发酵方法及其产物。
5.一种复方中药益生菌的发酵方法，包括以下步骤：s1按照重量份9:3:4:4的比例，分别称取穿心莲、辣蓼、葫芦茶、大青叶，粉碎后置入发酵罐中混匀；s2向发酵罐中加入s1中药粉末混合物重量三倍以上的液体培养基，与中药粉末充分混匀，调节初始ph值为4-8；s3将发酵罐升温到110℃以上，高压灭菌20 min，晾凉；s4在无菌基质中接种益生菌菌种并活化，将发酵罐内混合物重量的1%—20%的活化好的益生菌菌种倒入发酵罐中混匀，置摇床上发酵。
6.优选地，步骤s2所述的液体培养基由以下按重量份的组分组成：营养肉汤16g-20g，cacl20.07g-0.2g，mgso4·
7h2o 0.05g-0.5g，mncl2·
4h2o 0.1g-0.5g，蒸馏水100ml。
7.进一步优选地，液体培养基由以下按重量份的组分组成：营养肉汤18%，cacl20.075g，mgso4·
7h2o 0.1 g，mncl2·
4h2o 0.2g，蒸馏水100 ml。
8.优选地，步骤s4所述无菌基质接种的益生菌菌种为酵母菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌、丁酸梭菌中的一种或几种；发酵温度为20℃—40 ℃；摇床转速为0 r/min—200 r/min；发酵时间为24 h— 72 h。
9.优选地，所述的益生菌菌种为枯草芽孢杆菌和/或酵母菌。
10.前述任一种复方中药益生菌的发酵方法所获得的产物。
11.前述任一种发酵方法所获得的产物在兽药上的应用。
12.本发明是在经单因素实验获得对中药四味穿心莲益生菌发酵产物中绿原酸、芦丁含量影响最大的因素是枯草芽孢杆菌、初始ph值、接菌量、摇床速度的基础上，经正交表l9(34)设计三因素三水平实验，分析优化获得复方中四味穿心莲发酵产物最优制备方法。本发明通过对发酵过程中的工艺条件的探索，使得复方中药四味穿心莲液体发酵产物对益生菌和动物机体都有着良好的互作关系，可显著提高其有效成分的提取率，从而达到增强药效，节省药材资源，保护环境的效果。
具体实施方式
13.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
14.本发明对复方中药四味穿心莲益生菌发酵方法进行单因素实验，获得的数据如下：1 发酵菌种的筛选由表1可知，四味穿心莲散在经过枯草芽孢杆菌发酵后芦丁与绿原酸含量最高，显著高于其他菌种(p《0.05)。
15.表1 不同发酵益生菌对发酵产物中芦丁与绿原酸含量的影响
16.注：同列数据标有不同小写字母表示差异显著，p《0.05；下同。
17.2 最佳发酵时间的确定
18.如表2所示，对比不同时间发酵益生菌的芽孢生成率，72 h枯草芽孢杆菌芽孢生成率显著性高于其他时间(p《0.05)，确定最佳发酵时间为72 h。
19.表2 益生菌芽孢生成率（%）
20.3 发酵温度对发酵体系的影响
21.如表3可知，在37℃时枯草芽孢杆菌在od
600
nm处的吸光度值显著性高于其他组(p《0.05)，其生长情况最好。
22.表3 不同发酵温度对益生菌生长的影响
23.4初始ph值对发酵体系的影响
24.如表4在ph值为5时，枯草芽孢杆菌 od
600
nm值显著性高于其他组(p《0.05)，表明在该ph值条件下更适宜枯草芽孢杆菌生长。
25.表4 不同初始ph值对益生菌生长的影响
26.5枯草芽孢杆菌接种量对发酵体系的影响
27.如表5可知，在接菌量为15 %时，绿原酸和芦丁含量显著高于其他组(p《0.05)。
28.表5 不同接菌量对发酵产物中绿原酸和芦丁含量的影响
29.6装液量对发酵体系的影响
30.如表6所知，在装液量为60 %时，绿原酸和芦丁含量显著高于其他组(p《0.05)。
31.表6 不同装液量对发酵产物中绿原酸和芦丁含量的影响
32.7转速对发酵体系的影响
33.如表7可知，在转速为150 r/min时，发酵产物中绿原酸和芦丁含量显著高于其他组(p《0.05)。
34.表7 不同转速对发酵产物中绿原酸和芦丁含量的影响
35.8单因素试验结论
36.由以上结果可以筛选出最优单因素条件为：发酵时间72 h、温度37 ℃、初始ph值为5、接菌量15 %、装液量60 %、转速150 r/min。综合考虑，枯草菌最适宜的生长温度为37 ℃，生成芽孢时间为72h，ph值、接菌量和转速对细菌生长和化学成分含量更显著，故正交试验选择差异最显著的ph值、接菌量和转速作为最终考察因素。
37.9 正交优化结果
38.根据单因素试验结果，将ph值、接菌量、转速作为最终考察因素，见表8，正交试验结果和极差分析结果如表9。
39.表8 正交试验因素水平表
40.表9 正交表l9(34)试验设计及分析结果
41.表10 单因素方差分析结果
42.由表10可知，3个因素对发酵产物中绿原酸和芦丁的含量均无显著差异。则可以通过表9中的极差(r)分析结果。r值越大，相对应的因素对结果影响作用也越大，所以对发酵产物中绿原酸和芦丁含量影响的主次顺序为c》b》a，即接菌量对发酵产物中绿原酸和芦丁含量影响最大，其次是转速，影响最小的是ph值；根据k值确定最佳发酵工艺为a1b2c3，即ph值4.8、转速150 r/min、接菌量18 %。经最佳发酵工艺制备的发酵产物中绿原酸和芦丁含量分别为55.67
±
3.40 μg/ml、83.00
±
2.45 μg/ml。
实施例
43.分别称取穿心莲1.8 g、辣蓼0.6 g、葫芦茶0.8 g、大青叶0.8 g，10 000 r/min粉碎2.0min，获得复方中药四味穿心莲混合物粉末；复方中药四味穿心莲益生菌发酵产物的制备方法，包括以下步骤：1.将4g复方中药粉末与30ml液体培养基混匀，液体培养基组分包括营养肉汤18g，
cacl20.075g，mgso4·
7h2o 0.1 g，mncl2·
4h2o 0.2g，蒸馏水100 ml；2.用浓盐酸调节初始ph为4.8，121℃高压灭菌20 min；3.在超净台无菌基质中接种10
10
cfu/ml的枯草芽孢杆菌和酵母菌菌种，将5.4ml活化后菌种置发酵罐中混匀，发酵罐放在摇床上；4.设置摇床转速为120 r/min、发酵温度为37℃，发酵24h。
实施例
44.分别称取穿心莲9 g、辣蓼3 g、葫芦茶4 g、大青叶4 g，10 000 r/min粉碎2.0min，获得复方中药四味穿心莲中药粉末；复方中药四味穿心莲益生菌发酵产物的制备方法，包括以下步骤：1.将20g复方中药粉末与150ml液体培养基混匀，液体培养基组分包括营养肉汤18g，cacl20.075g，mgso4·
7h2o 0.1 g，mncl2·
4h2o 0.2g，蒸馏水100 ml；2.用浓盐酸调节初始ph为5.3，121℃高压灭菌20 min，3.在超净台无菌基质中接种10
10
cfu/ml枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌，将27ml活化后菌种置发酵罐中混匀，发酵罐放在摇床上；4.设置摇床转速为150 r/min、发酵温度为37℃，发酵48h。
实施例
45.分别称取穿心莲18 g、辣蓼6 g、葫芦茶8 g、大青叶8 g，10 000 r/min粉碎2.0min，获得复方中药四味穿心莲中药粉末；复方中药四味穿心莲益生菌发酵产物的制备方法，包括以下步骤：1.将40g复方中药粉末与300ml液体培养基混匀，液体培养基组分包括营养肉汤18g，cacl20.075g，mgso4·
7h2o 0.1 g，mncl2·
4h2o 0.2g，蒸馏水100 ml；2.用浓盐酸调节初始ph为5.8，121℃高压灭菌20 min；3.在超净台无菌基质中接种10
10
cfu/ml枯草芽孢杆菌和酵母菌和凝结芽孢杆菌，将54ml活化后菌种置发酵罐中混匀，发酵罐放在摇床上；4.设置摇床转速为180 r/min、发酵温度为37℃，发酵72h。
实施例
46.分别称取穿心莲1.8 g、辣蓼0.6 g、葫芦茶0.8 g、大青叶0.8 g，10 000 r/min粉碎2.0min，获得复方中药四味穿心莲中药粉末；复方中药四味穿心莲益生菌发酵产物的制备方法，包括以下步骤：1.将4 g复方中药粉末置入50 ml发酵罐中，加入30 ml液体培养基混匀，液体培养基组分包括营养肉汤18g，cacl20.075g，mgso4·
7h2o 0.1 g，mncl2·
4h2o 0.2g，蒸馏水100 ml；2.用浓盐酸调节初始ph值为4.8，121℃高压灭菌20 min；3.在超净台无菌基质中接种枯草芽孢杆菌，将液体培养基重量18%的活化好的菌液倒入发酵罐，混匀后置摇床中；4.设置摇床转速为150 r/min，37℃发酵72h。
47.测定本实施例4所获得的益生菌发酵产物中含有绿原酸0.041%、芦丁0.062%；本实施例发酵产物对大肠杆菌的最小杀菌浓度和最小抑菌浓度均为31.25 mg/ml；将本实施例所得发酵产物给雏鸡灌服，按0.1~0.5 g/只，每天2次，连用3 天，对人工感染大肠杆菌spf雏鸡的治愈率达70~80 %，显著降低患病雏鸡血液中促炎因子il-1β、il-6、tnf-α含量（p《0.05）。

技术特征：
1.一种复方中药益生菌的发酵方法，包括以下步骤：s1按照重量份9:3:4:4的比例，分别称取穿心莲、辣蓼、葫芦茶、大青叶，粉碎后置入发酵罐中混匀；s2向发酵罐中加入s1中药粉末混合物重量三倍以上的液体培养基，与中药粉末充分混匀，调节初始ph值为4-8；s3将发酵罐升温到110℃以上，高压灭菌20 min，晾凉；s4在无菌基质中接种益生菌菌种并活化，将发酵罐内混合物重量的1%—20%的活化好的益生菌菌种倒入发酵罐中混匀，置摇床上发酵。2.根据权利要求1所述的复方中药益生菌的发酵方法，其特征在于：步骤s2所述的液体培养基由以下按重量份的组分组成：营养肉汤16g-20g，cacl
2 0.07g-0.2g，mgso4·
7h2o 0.05g-0.5g，mncl2·
4h2o 0.1g-0.5g，蒸馏水100ml。3.根据权利要求2所述的复方中药益生菌的发酵方法，其特征在于：液体培养基由以下按重量份的组分组成：营养肉汤18%，cacl
2 0.075g，mgso4·
7h2o 0.1 g，mncl2·
4h2o 0.2g，蒸馏水100 ml。4.根据权利要求1或2所述的复方中药益生菌的发酵方法，其特征在于：步骤s4所述无菌基质接种的益生菌菌种为酵母菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、粪肠球菌、丁酸梭菌中的一种或几种；发酵温度为20℃—40 ℃；摇床转速为0 r/min—200 r/min；发酵时间为24 h— 72 h。5.根据权利要求4所述的复方中药益生菌的发酵方法，其特征在于：所述的益生菌菌种为枯草芽孢杆菌和/或酵母菌。6.权利要求1或2所述的复方中药益生菌的发酵方法所获得的产物。7.权利要求3所述的复方中药益生菌的发酵方法所获得的产物。8.权利要求4所述的复方中药益生菌的发酵方法所获得的产物。9.权利要求5所述的复方中药益生菌的发酵方法所获得的产物。10.权利要求6-9任一项所述发酵方法所获得的产物在兽药上的应用。

技术总结
本发明涉及四味穿心莲益生菌的发酵方法及其产物。包括以下步骤：S1按照重量份9:称取穿心莲、辣蓼、葫芦茶、大青叶，粉碎混匀；S2向发酵罐中加入液体培养基，调节初始pH值为4-8；S3将发酵罐升温到110℃以上，高压灭菌20 min；S4接种益生菌菌种并活化，倒入发酵罐中混匀，置摇床上发酵。发酵方法所获得的产物及其在兽药上的应用。本发明使得复方中药四味穿心莲液体发酵产物对益生菌和动物机体都有着良好的互作关系，可显著提高其有效成分的提取率，从而达到增强药效，节省药材资源，保护环境的效果。保护环境的效果。


技术研发人员：蒋红 孙弋雅 王宏军 单文琪 江庆国 谭艳平 马鸣潇
受保护的技术使用者：锦州医科大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/13