一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用与流程

1.本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用。


背景技术：

2.近年来针对各种疾病的细胞疗法取得了重大进展，但依旧存在许多挑战，例如作为常规的货架产品，很多细胞产品需要按批进行长期的低温（-80℃）或深低温（-196℃）储存，使用前还需要对细胞进行复苏清洗以除去冻存液组分，即便如此，所含组分（dmso等）残留有可能影响安全性和治疗效果；而对于鲜活的细胞产品，常温或冷藏保存的细胞因时间短（通常不超过24h）导致应用范围受限。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用。
4.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种细胞的低温、常温保存方法，包括如下步骤：步骤1：收获培养的细胞前，将富含糖酵解抑制剂的溶液加入培养液中进行孵育、消化后，离心收集细胞；步骤2：将步骤1收集的细胞，以富含海藻糖的溶液制备细胞悬液孵育、离心，经pbs缓冲液洗涤后收集细胞；步骤3：将步骤2收集的细胞加入细胞保存液中，置于低温2-8℃下保存或室温18-30℃下保存。
5.进一步，所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸或6-氨基烟酰胺中的一种；所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-100nm；所述的糖酵解抑制剂使用磷酸盐缓冲液或无血清基础培养基配制；所述的步骤1中的孵育步骤的温度为37℃，时间为30-60min；所述的步骤1中消化步骤为酶消化方法；所述的步骤1中的离心步骤的离心力为2000g，时间为5min。
6.进一步，所述的步骤2中的富含海藻糖的溶液为含有3-5 w/v%海藻糖的pbs缓冲液；所述的步骤2中的孵育步骤的温度为4℃，时间为3-5min。
7.进一步，步骤3中加入细胞保存液后细胞的浓度为2-20
×
106细胞/ml。
8.进一步，所述的步骤3中的细胞保存液包括如下组分：人血白蛋白20-40 w/v%，低分子肝素钙30-100iu/ml，硫胺素焦磷酸 10-50nm，非必须氨基酸1-3 v/v%，余量为勃脉力a注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液的混合液；所述的非必须氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸中的至少一种。
9.进一步，所述的细胞为干细胞或免疫细胞。
10.本发明还提供了一种细胞保存液，该保存液包括如下组分：人血白蛋白
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20-40 w/v%，
低分子肝素钙
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30-100iu/ml，硫胺素焦磷酸
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10-50nm；非必须氨基酸
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1-3 v/v%，余量为勃脉力a注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液的混合液。
11.进一步，所述的非必须氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸中的至少一种。
12.本发明还提供了一种保存细胞，该细胞由所述的方法保存而成。
13.本发明还提供了一种所述的细胞的低温、常温保存方法的应用，所述的方法在生物样本库的样本保存和/或制备细胞药物领域中的应用。
14.不同于超低温储存，细胞的低温或常温储存以及运输仍然为细胞代谢提供条件。因此对于细胞代谢的缓慢过渡性抑制有助于细胞冷藏的长时间低代谢保存。因此，该保存方法首先在细胞收获前的细胞悬液，以代谢抑制剂进行细胞低代谢预适应过程，可减少细胞从代谢旺盛状态进入快速停止状态的细胞损伤，包括细胞凋亡以及细胞死亡；其次通过海藻糖等非细胞渗透剂进行细胞清洗预适应，经过两步预适应，细胞在简单的保存液中能保持更长久的细胞活率以及细胞性能。此外，细胞保存液成分为临床药用级成分，非常适用于鲜活细胞治疗产品的保存和运输，具有非常广泛的市场应用价值。
15.相对于现有技术，本发明具有以下优势：本发明所述的细胞保存液及细胞保存方法可以解决现有鲜活细胞制剂仅能维持细胞活性不超过24小时，无法长时间储存的问题，该方法整个过程操作简单，具有很高的安全性，可以满足鲜活细胞产品的常温（18-30℃）或低温（2-8℃）长时间储存，将有助于细胞产品的临床使用。
附图说明
16.图1为本发明实施例4实验组3接种12h后细胞贴壁图；图2为本发明实施例4实验组3接种24h后细胞贴壁图；图3为本发明实施例4实验组3接种60h后细胞贴壁图；图4为本发明实施例4实验组6接种12h后细胞贴壁图；图5为本发明实施例4实验组6接种24h后细胞贴壁图；图6为本发明实施例4实验组6接种60h后细胞贴壁图。
具体实施方式
17.除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
18.本发明实施例所述的非必须氨基酸购买自gibco（货号：11140076）。
19.下面结合实施例来详细说明本发明。
20.实施例1：细胞收获前对糖酵解抑制剂的筛选与优化按照三因素三水平的doe实验设计对糖酵解抑制剂的种类、浓度、作用时间进行优化。细胞收获前，弃去培养上清，加入含有不同浓度的糖酵解抑制剂，于培养箱中继续孵育
30-90min，然后经过消化后离心收获细胞。加入细胞保存液，将细胞悬液置于水平摇床上，速度为20rpm/min。将两组分别置于4℃和25℃。48h后，检测25℃样品细胞存活率；72h后，检测4℃样品细胞存活率。其中细胞保存液成分为人血白蛋白20w/v%，低分子肝素钙65iu/ml，硫胺素焦磷酸 20nm；非必须氨基酸2 v/v%， 注射用生理盐水。其中糖酵解抑制剂分别为a（2-脱氧葡萄糖）、b （3-溴丙酮酸）和c（6-氨基烟酰胺）。
21.表1 实验分组设置
22.表2 实验结果
23.spss软件分析可知：k
糖酵解a
=84.22；k
糖酵解b =81.03；k
糖酵解c
= 90.54；极差r
糖酵解
=9.51；k
浓度20
=85.38；k
浓度50
=85.45；k
浓度100
=84.96；极差r
细胞
=0.49；k
时间30
=85.91；k
时间60
=86.57 ；k
时间90
= 83.31；极差r
时间
=3.26；其中：r
糖酵解剂
＞r
时间
＞r
浓度
，不同糖酵解剂的预处理对细胞冷藏和冷鲜保存均有促进作用，其中6-氨基烟酰胺保护作用最强。在实验范围内浓度似乎影响不大，考虑细胞使用安全性，建议不超过100nm即可，因处于非消化状态糖酵解抑制物浓度对细胞活力保护影响最大。作用时间延长导致保护力的下降，最优保护时间为60min。
24.最优实验组合为6-氨基烟酰50 nm，作用时间30min。
25.此外，虽然未分析细胞在25℃，48h的细胞活力，但较对照组均有提升。
26.实施例2：海藻糖预处理对细胞冷藏保护作用的筛选与优化按照三因素三水平的doe实验设计对海藻糖的浓度、作用时间以及细胞浓度三个条件进行优化，正常收获培养的细胞后，洗涤两次，在第一次洗涤时加入不同浓度海藻糖预处理。清洗结束后，加入细胞保存液，将细胞悬液置于水平摇床上，速度为20rpm/min。将两组分别置于4℃和25℃。对照组为无海藻糖的pbs缓冲液，48h后，检测25℃样品细胞存活率；
72h后，检测4℃样品细胞存活率（以此组为数据分析关键点）细胞保存液成分为含人血白蛋白20w/v%的注射用生理盐水。
27.表3 doe实验条件设计
28.表4 实验分组情况
29.spss软件分析可知：k
海藻糖3
=72.04；k
海藻糖5
=71.91；k
海藻糖8
=70.63；极差r
海藻糖
=1.40；k
细胞2
=71.12；k
细胞10
=71.62；k
细胞20
=711.84；极差r
细胞
=0.72；k
时间10
=72.37；k
时间20
=72.70；k
时间30
= 69.51；极差r
时间
=3.18；其中：r
时间
＞r
海藻糖
＞r
细胞
，和对照组相比，海藻糖预处理提高了细胞冷藏和常温保存的活率。其中作用时间延长到10分钟，显示出了保护力减弱的趋势。细胞浓度对活率影响因素较小，因此考虑趋势范围内浓度均可实现。活率随海藻糖浓度增加而下降的趋势，因此建议海藻糖浓度不超过5min。
30.最优组合为第三组和第六组，条件分别为海藻糖浓度为3%，作用时间5min，细胞浓度为20
×
106。以及海藻糖浓度为5%，作用时间3min，细胞浓度为20
×
106。
31.此外，各实验组细胞在25℃条件下，48h的存活率也显示出了与对照组提升的效果，支持常温保存应用。
32.实施例3：对冷藏组分进行筛选剂的筛选与优化按四因素三水平的doe实验设计对低分子肝素钙的浓度、白蛋白浓度以及硫胺素焦磷酸以及溶媒四个组分条件进行优化，正常培养收获细胞后，最后一次加入不同5w/v%海藻糖预处理后，加入不同配比细胞保存液，将细胞悬液置于水平摇床上，速度为20rpm/min。将两组分别置于4℃和25℃。对照组为不添加溶媒，不添加肝素钙，不添加tpp等，48h后，检测25℃样品细胞存活率；72h后，检测4℃样品细胞存活率（以此组为数据分析关键点）。
33.表5 doe实验条件设计
34.表6 实验分组情况
35.spss软件分析可知：k
肝素钙20
=82.96；k
肝素钙50
=86.70.37；k 肝素钙100
=87.69；极差r
肝素钙
=4.73；k
白蛋白20
=84.02；k
白蛋白30
=85.56；k
白蛋白40
=85.77；极差r
白蛋白
=3.54；k
tpp10
=86.21；k
tpp20
=85.67；k
tpp50
= 85.46；极差r
tpp
=0.75；k
溶媒1
=85.90；k
溶媒2
=85.83；k
溶媒3
= 85.61；极差
溶媒
=0.30；其中：r
肝素钙
＞r
白蛋白
＞r
tpp
＞r
溶媒
。和对照组1、2、3相比，实验组所选成分均有提高。其中肝素钙的对细胞影响较大。考虑到治疗的安全性建议不超过100iu/ml。白蛋白作为细胞保护剂以及防聚团效果，在30%体积分数具有最好的保护效果。高浓度细胞活率略有下降。tpp对细胞活力提升有一定帮助，和无tpp组相比明显。溶媒对细胞活力影响基本没有，因此可以考虑实验所用溶媒配比或独立使用。
36.最优实验组合为肝素钙100iu/ml；白蛋白体积分数30%；硫胺素焦磷酸 20nm，以右旋糖苷40做溶媒，含2%neaa。
37.此外，该存存体系支持常温细胞保存，细胞活率在48h仍保持80%左右存活率实施例4：发明方法的组合验证以实施例1-实施例3筛选最优条件进行细胞保存。分为完全预处理工艺、无步骤1糖酵解预处理工艺、无步骤2海藻糖预处理工艺、以及本技术方案全工艺组合四组。其中步骤1工艺为：细胞收获前以50 nm 6-氨基烟酰孵育30min；步骤2工艺为：含质量分数5%的海藻糖 pbs缓冲液重悬细胞，细胞浓度为10
×
106，作用时间5min。新鲜细胞保存液：其成分为
含肝素钙65iu/ml；白蛋白体积分数30%；硫胺素焦磷酸 20nm， 2%neaa，以勃脉力a和右旋糖苷40（6：4混合液）做溶媒。将细胞悬液置于水平摇床上，速度为20rpm/min。将两组分别置于4℃和25℃。48h后，检测25℃样品细胞存活率；72h后，检测4℃样品细胞存活率重复三组实验，实验结果如下表所示。
38.表7 实验结果
39.结果表明：通过对间充质干细胞细胞的预处理以及细胞保存液的组合，对细胞冷藏和常温保存具有显著的保护作用。全工艺处理后，实验组细胞再接种后细胞仍可正常贴壁、增殖，如图1-图6所示。因此该技术也支持细胞的常温和低温保存应用。
40.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种细胞的低温、常温保存方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：收获培养的细胞前，将富含糖酵解抑制剂的溶液加入培养液中进行孵育、消化后，离心收集细胞；步骤2：将步骤1收集的细胞，以富含海藻糖的溶液制备细胞悬液孵育、离心，经pbs缓冲液洗涤后收集细胞；步骤3：将步骤2收集的细胞加入细胞保存液中，置于低温2-8℃下保存或室温18-30℃下保存。2.根据权利要求1所述的细胞的低温、常温保存方法，其特征在于：所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸或6-氨基烟酰胺中的一种；所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-100nm；所述的糖酵解抑制剂使用磷酸盐缓冲液或无血清基础培养基配制；所述的步骤1中的孵育步骤的温度为37℃，时间为30-60min；所述的步骤1中消化步骤为酶消化方法；所述的步骤1中的离心步骤的离心力为2000g，时间为5min。3. 根据权利要求1所述的细胞的低温、常温保存方法，其特征在于：所述的步骤2中的富含海藻糖的溶液为含有3-5 w/v%海藻糖的pbs缓冲液；所述的步骤2中的孵育步骤的温度为4℃，时间为3-5min。4.根据权利要求1所述的细胞的低温、常温保存方法，其特征在于：步骤3中加入细胞保存液后细胞的浓度为2-20
×
106细胞/ml。5. 根据权利要求1所述的细胞的低温、常温保存方法，其特征在于：所述的步骤3中的细胞保存液包括如下组分：人血白蛋白20-40 w/v%，低分子肝素钙30-100iu/ml，硫胺素焦磷酸 10-50nm，非必须氨基酸1-3 v/v%，余量为勃脉力a注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液的混合液；所述的非必须氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸中的至少一种。6.根据权利要求1所述的细胞的低温、常温保存方法，其特征在于：所述的细胞为干细胞或免疫细胞。7.一种细胞保存液，其特征在于：该保存液包括如下组分：人血白蛋白
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20-40 w/v%，低分子肝素钙
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30-100iu/ml，硫胺素焦磷酸
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10-50nm；非必须氨基酸
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1-3 v/v%，余量为勃脉力a注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液的混合液。8.根据权利要求7所述的细胞保存液，其特征在于：所述的非必须氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸中的至少一种。9.一种低温、常温保存的细胞，其特征在于：该细胞由权利要求1-6中任一项所述的方法保存而成。10.一种权利要求1-6中任一项所述的细胞的低温、常温保存方法的应用，其特征在于：所述的方法在生物样本库的样本保存和/或制备细胞药物领域中的应用。

技术总结
本发明提供了一种细胞、细胞保存液、保存方法及应用，该细胞保藏方式包括冷藏或常温保存前的糖酵解抑制剂预处理以及海藻糖预处理过程，细胞保存液包括如下组分：人血白蛋白、低分子肝素钙、非必须氨基酸、硫酸铵焦磷酸、以及博脉力A注射液（Plasma lyte A）和右旋糖酐40-葡萄糖注射液的混合物。本发明所述的细胞保存液及细胞保藏方法可以解决现有鲜活细胞保存时间短，无法长时间运输等问题。同时，该保存方法可以满足鲜活细胞产品的常温（18-30℃）或低温（2-8℃）长时间储存，有助于细胞产品的临床使用，整个过程中全部使用注射剂和药用辅料，具有很高的安全性。具有很高的安全性。具有很高的安全性。


技术研发人员：曹宁 徐萌 冀美超 张楠 靳明军
受保护的技术使用者：九天览月生物科技（天津）有限公司
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/8/13