一种抗EGFR&CD3双靶点抗体生物学活性的检测方法与流程

一种抗egfr＆cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学、生物制药等技术领域，具体涉及一种抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法。


背景技术：

2.表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，egfr)属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，rtk)erbb家族。erbb受体家族，也被称为egf受体家族或i型受体家族，包括表皮生长因子(egf)受体(egfr)或erbb1/her1、erbb2/her2、erbb3/her3和erbb4/her4。在所有rtk中，egfr是第一个被发现的，也是第一个被证明与癌症相关的rtk。因此，egfr也是所有rtk中研究最深入的。erbb受体在均二聚或异二聚后被激活。因此，异质二聚是一种重要的机制，允许所有erbb受体在响应配体刺激时被激活。激活的erbb受体与许多信号蛋白结合，并刺激多种信号通路的激活，在许多癌症中，尤其是乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌中，erbb受体过度表达或突变。erbb受体的过表达和过活化与预后不良、耐药、肿瘤转移和生存率降低有关。erbb受体，尤其是egfr和erbb2(her2)已经成为发展癌症治疗的主要靶点。egfr表达较为广泛，比如哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等均有表达。egfr信号通路参与调节多种细胞进程，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥了重要的作用。当egfr发生过表达或激活突变时，持续激活的egfr信号通路会导致细胞异常增殖，这是导致癌症发生的重要诱因之一。egfr的信号通路调节肿瘤细胞的增值、血管生成、侵袭、转移及细胞凋亡抑制，其扩增和激酶结构域的突变已在癌症患者中被发现，而且均与癌症患者对抗egfr药物的耐药反应密切相关(参考文献pmid：29256471、28791631、11597399、24295852、31639425)。已上市以egfr为靶点的药物既有小分子抑制剂又有单克隆抗体。其中小分子抑制剂(如gefitinib、nilotinib)的适应症以非小细胞肺癌、乳腺癌(egfr/her2双靶点)为主，单抗(如cetuximab、panitumumab)适应症以结直肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌为主。
3.cd3作为t淋巴细胞(t-lymphocyte)的标记物，是一种多聚蛋白复合体。在t细胞表面，cd3分子与t细胞受体(tcr)以非共价键结合形成tcr/cd3受体复合物。cd3包括四种亚型，分别为cd3δ、cd3ε、cd3γ和cd3ζ，其中cd3δ/cd3ε、cd3γ/cd3ε以异源二聚体形式存在。tcr的细胞质端缺乏信号传递能力，依赖cd3蛋白复合物启动细胞内信号传递。cd3亚基有一个n端细胞外区域，一个跨膜结构域和一个细胞质尾部，免疫受体酪氨酸激活基序(itams)位于细胞质尾部。其中cd3ε、cd3γ和cd3δ的胞外结构域包含一个类似免疫球蛋白的结构域，因此被认为是免疫球蛋白超家族的一部分。cd3ε、cd3γ和cd3δ亚基的胞质段只包含一个itam，而cd3ζ亚基的胞质区域包含三个itam，所以一个cd3复合体总共有10个itam，这使得tcr/cd3受体复合物对抗原结合非常敏感。第一个被fda批准上市抗cd3ε单抗是muromonab，用于实体器官移植中诱导免疫抑制以预防和治疗排斥反应。不仅如此，在近些年cd3ε还作为肿瘤靶向治疗中双特异性抗体靶点之一，这种类型的双特异性抗体又称t细胞导向的双特异性抗体(t cell-engaging bsab，bstce)。
4.虽然双抗工艺比单抗要复杂的多，也尚不成熟，但是双抗因高应答率、高特异性、低毒性、成本适中等特征，且基于临床的联合用药的数据，双靶点药物已开始商业化抢跑。设计和开发非天然双特异性抗体是提高抗体药物药效、降低耐药性的一种高效的策略，尤其是对提高癌症治疗的疗效。相对于单抗，双特异性抗体可介导两个不同的靶点作用机制，起到协同作用，这是单抗所不具备的优势。双特异性抗体的技术门槛和研发成本较高，构建阶段可能会遇到表达量低、稳定性差的障碍，开发评价阶段可能会遇到模型建立难的问题。双特异性抗体的作用机制主要有三种：介导免疫细胞杀伤、双靶点信号阻断、促进蛋白形成功能性复合体。cd3 bsab诱导效应t细胞的激活和细胞毒活性，使过表达靶点的恶性细胞裂解，属于介导免疫细胞杀伤范畴。cd3 bsab通过结合t细胞上的cd3和癌细胞上的肿瘤相关抗原(taa)来激活t细胞。因此，所有可用的t细胞都可以结合到靶表达的肿瘤细胞，而不受其t细胞受体(tcr)的主要组织相容性复合体(mhc)特异性的影响。tcr-cd3复合物的激活导致t细胞的活化，以及在t细胞和肿瘤细胞之间形成一个细胞溶解突触，导致穿孔素和颗粒酶的释放和随后的肿瘤细胞杀伤(参考文献pmid：31544847、30381448、31175342)。
5.目前，基于cd3靶点和抗肿瘤靶点联合的双抗药物已经成为研发的热点，egfr&cd3双靶点抗体，已有相关药物申报临床试验，比如时迈药业的smet12和智康弘义的bc3448。但是在评价抗egfr&cd3双靶点抗体(anti-cd3&egfr bsab)体外生物学活性时，需要激活t细胞，然后对egfr靶细胞进行杀伤，而现有的实验体系需要分离人外周血单核细胞(hpbmc)作为效应细胞(cn104774268b、pmid：26323605、32188928、16397041)，而且不能同时兼顾双靶点的功效，不能同时检测到t细胞激活并杀伤靶细胞的联合效应。另外，该实验体系操作繁琐、成本高昂，而且不同供体或批次间的hpbmc活性存在较大差异，导致实验结果重复性差。也有的实验体系采用动物模型，实验周期长，成本高(wo 2021/104430 a1)。


技术实现要素：

6.为解决现有技术问题，本发明提供了一种抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法。该检测方法通过加入抗egfr&cd3双靶点抗体后，抗体结合效应细胞后激活效应细胞，同时抗egfr&cd3双靶点抗体将高表达egfr和报告基因的单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase拉近到效应细胞的周围，激活的效应细胞可以杀伤单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase，很好的检测双靶点egfr&cd3双抗的协同效应。
7.本发明的具体技术方案如下：
8.本发明提供的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，其特征在于，包括：构建人egfr表达载体，采用人egfr表达载体和报告基因cmv-luciferase质粒构建单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase，加入抗egfr&cd3双靶点抗体共培养效应细胞和单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase后，检测luciferase信号值是否随抗egfr&cd3双靶点抗体浓度的增加而降低。
9.本发明提供的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，还具有这样的技术特征，其中，构建人egfr表达载体的具体方法为：通过pcr克隆或化学合成的方法获得人egfr的编码区核酸序列，通过dna重组反应或限制性内切酶酶切并配合t4连接酶，将人egfr的编码区核酸序列克隆至过表达载体，得到人egfr表达载体。
10.本发明提供的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，还具有这样的技术
特征，其中，过表达载体为pcdna3.1或pcmv3。
11.本发明提供的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，还具有这样的技术特征，其中，采用人egfr表达载体和报告基因cmv-luciferase质粒构建单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase的具体方法为：在电转条件或转染试剂的介导下，将人egfr表达载体和报告基因cmv-luciferase质粒转入宿主细胞，培养一段时间后加入抗生素进行抗性筛选；通过有限稀释或单细胞打印方法获得单克隆细胞；采用facs和化学发光法，筛选出目的基因高表达的单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase。
12.本发明提供的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，还具有这样的技术特征，其中，宿主细胞为永生细胞系、癌细胞系或原代癌细胞系，包括cho-k1、hek293、u87mg、ht-29、a549、ncih460、mda-mb231、hela或pc-3，抗生素为g418、puromycin、neomycin或hygromycin b。
13.本发明提供的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，还具有这样的技术特征，其中，效应细胞为具有杀伤活性的免疫细胞系，包括hut-78、jurkat、ccrf-cem、h9或molt-4。
14.发明的作用与效果
15.与现有技术相比，本发明提供的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，采用单克隆稳转细胞株组合(高表达cd3的jurkat效应细胞和单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase)，在评价抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性时，无需反复购买原代细胞或实验动物，降低成本的同时避免了供体或个体之间的个体差异；无需像原代细胞那样需要分离单核细胞并用细胞因子处理才能得到分化的效应细胞；简便的操作使用流程可以很大程度上降低操作者出错的可能性；无需染色或标记，避免不同批次、品牌试剂的差异性和在试剂长期保存过程中出现的性能衰减所造成的实验结果差异；实验耗时短，可快速得到实验数据，配合多孔板可实现高通量的检测。即本发明的检测方法具有操作简便、耗时短、成本低廉、可高通量、性能稳定和重复性好等优势，同时最重要的优势是能够体现抗egfr&cd3双靶点抗体的协同效应生物学功能。
附图说明
16.图1是本发明实施例的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法的示意图。
17.图2是本发明实施例的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法的原理模拟图。
18.图3是本发明实施例的jurkat效应细胞表达cd3的流式测试图。
19.图4是本发明实施例的宿主细胞cho-k1、单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase表达egfr的流式测试图。
20.图5是本发明实施例的抗egfr&cd3双靶点抗体介导的jurkat效应细胞对单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase的杀伤测试图。
具体实施方式
21.在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
22.在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
23.下述实施例中所采用的试剂为普通商业途径购得，未注明的实验操作及实验条件参考本领域的常规操作及常规条件。
24.以下结合实施例和附图来说明本发明的具体实施方式。
25.《实施例》
26.本实施例提供了一种抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，该检测方法包括：构建人egfr表达载体，采用人egfr表达载体和报告基因cmv-luciferase质粒(购置于promega，货号e132a)构建单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase，加入抗egfr&cd3双靶点抗体共培养高表达cd3的jurkat效应细胞(jurkat-cd3，购置于中国科学院细胞库，细胞名称jurkat,clone e6-1；目录号：scsp-513)和单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase后，检测luciferase信号值是否随抗egfr&cd3双靶点抗体浓度的增加而降低。
27.其中，构建人egfr表达载体的具体方法为：
28.通过pcr克隆或化学合成的方法获得人egfr的编码区核酸序列seq id no:2，通过dna重组反应或限制性内切酶酶切并配合t4连接酶，将人egfr的编码区核酸序列克隆至合适的过表达载体(如pcdna3.1或pcmv3)，得到人egfr表达载体。
29.其中，人egfr基因序列如seq id no:1所示，人egfr蛋白的氨基酸序列如seq id no:2(uniprot:p00533)所示。
30.其中，采用人egfr表达载体和报告基因cmv-luciferase质粒构建单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase的具体方法为：
31.在电转条件或转染试剂的介导下，将人egfr表达载体和报告基因cmv-luciferase质粒转入宿主细胞(永生细胞系、癌细胞系或原代癌细胞系，包括cho-k1、hek293、u87mg、ht-29、a549、ncih460、mda-mb231、hela或pc-3)，本实施例所用宿主细胞为cho-k1，培养一段时间后加入相应抗生素(g418、puromycin、neomycin或hygromycin b)进行抗性筛选；通过有限稀释或单细胞打印方法获得单克隆细胞；采用facs和化学发光法，筛选出目的基因(egfr和报告基因)高表达的单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase。
32.其中，加入抗egfr&cd3双靶点抗体(anti-cd3&egfr bsab)，与jurkat效应细胞和单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase共培养后，检测luciferase信号值是否随抗egfr&cd3双靶点抗体浓度的增加而降低，具体过程为：
33.将2
×
105个/ml单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase以50μl/孔细胞加到96孔中，在37℃、5％ co2培养箱中过夜培养。第二天加入25μl系列梯度稀释抗egfr&cd3双靶点抗体到细胞实验板中，同时制备2
×
106个/ml jurkat效应细胞(jurkat-cd3)(1640培养基，含10％ fbs)，以25μl/孔细胞加到96孔中，在37℃、5％ co2湿润培养箱中培养该细胞板6h，然后在各孔中添加100μl one-glo luciferase assay(promega，e6120)。10分钟后，酶标仪检测化学发光信号luminescence。以抗egfr&cd3双靶点抗体的浓度为x轴，读取的luminescence值作为y轴，四参数拟合曲线，得到一个luminescence值随抗egfr&cd3双靶点抗体浓度的增加而降低的倒“s”曲线。
34.本实施例所用抗egfr&cd3双靶点抗体(anti-cd3&egfr bsab)的氨基酸序列如seq id no:3所示，seq id no:3为：
35.qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsggsvssgdyywtwirqspgkglewighi
36.yysgntnynpslksrltisidtsktqfslklssvtaadtaiyycvrdrvtgafdi
37.wgqgtmvtvssggggsgggsgggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqd
38.isnylnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftisslqped
39.iatyfcqhfdhlplafgggtkveikggggsggggsggggsggggsqvqlqqs
40.gaelarpgasvkmsckasgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgyt
41.nynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldyw
42.gqgttltvssggggsggggsggggsqivltqspaimsaspgekvtmtcsasss
43.vsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgsgtsysltisgmeae
44.daatyycqqwssnpftfgsgtkleinggggshhhhhh
45.其中：qvqlq：egfr heavy chain，
46.diqmtqs：egfr light chain，
47.qvqlqq：cd3 heavy chain，
48.qivltqspai：cd3 light chain，
49.ggsgg：linker，
50.hhhhhh：his tag for purification。
51.图1是本发明实施例的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法的示意图。
52.图2是本发明实施例的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法的原理模拟图。
53.由图2可知，当加入抗egfr&cd3双靶点抗体后，抗体结合jurkat效应细胞后激活效应细胞，同时抗egfr&cd3双靶点抗体将高表达egfr和报告基因的单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase拉近到jurkat效应细胞的周围，激活的效应细胞可以杀伤单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase，随着抗体浓度的增加，jurkat效应细胞激活程度越高越多，对单克隆稳转靶细胞的杀伤越明显，报告基因cmv-luciferase信号就会降低。
54.对上述实施例提供的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法进行功能验证，具体如下：
55.将上述实施例中的jurkat效应细胞、宿主细胞cho-k1、单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase分别进行流式测试cd3、egfr的表达情况。测试方法为：
56.首先分别取对数生长期jurkat效应细胞、宿主细胞cho-k1、单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase用1％ bsa的pbs重悬细胞制成5
×
105cells/ml约1ml 37℃孵育30min,离心去上清，用1％ bsa的pbs清洗3次，然后分别加入用1％ bsa的pbs稀释的cd3抗体(2μg/ml)、egfr抗体(2μg/ml)，加入100ul后重悬上述清洗离心后的细胞，37℃孵育1h，接着用1％bsa的pbs再次清洗细胞3次。最后添加200-500ul 1％bsa的pbs重悬细胞，在流式细胞分析仪上进行分析，分析结果如图3、4所示。
57.图3是本发明实施例的jurkat效应细胞表达cd3的流式测试图。
58.图4是本发明实施例的宿主细胞cho-k1、单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase表达egfr的流式测试图。
59.由图3、4可知，jurkat效应细胞高表达cd3，宿主细胞cho-k1不表达egfr，而单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase可高表达egfr。
60.图5是本发明实施例的抗egfr&cd3双靶点抗体介导的jurkat效应细胞对单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase的杀伤测试图。
61.由图5可知，当加入测试样品抗egfr&cd3双靶点抗体、human igg、cd3 ab和egfr ab时，随着抗egfr&cd3双靶点抗体(anti-cd3&egfr bsab)浓度的增加，luciferase信号值降低。而human igg、cd3 ab和egfr ab浓度的增加对luciferase信号值影响不大。这也证明了该体系的专属性，只有抗egfr&cd3双靶点抗体可以引起jurkat效应细胞杀伤单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase。
62.以上是对实施例的详细描述，方便本领域的技术人员能正确理解和使用本发明。凡本领域的技术人员依据本发明在现有技术基础上，不经过创新性的劳动，仅通过分析、类推或有限列举等方法得到的改进或修改技术方案，都应该在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，其特征在于，包括：构建人egfr表达载体，采用所述人egfr表达载体和报告基因cmv-luciferase质粒构建单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase，加入抗egfr&cd3双靶点抗体共培养效应细胞和所述单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase后，检测luciferase信号值是否随抗egfr&cd3双靶点抗体浓度的增加而降低。2.根据权利要求1所述的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，其特征在于，其中，所述构建人egfr表达载体的具体方法为：通过pcr克隆或化学合成的方法获得人egfr的编码区核酸序列，通过dna重组反应或限制性内切酶酶切并配合t4连接酶，将所述人egfr的编码区核酸序列克隆至过表达载体，得到所述人egfr表达载体。3.根据权利要求2所述的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，其特征在于，其中，所述过表达载体为pcdna3.1或pcmv3。4.根据权利要求1所述的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，其特征在于，其中，所述采用所述人egfr表达载体和报告基因cmv-luciferase质粒构建单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase的具体方法为：在电转条件或转染试剂的介导下，将所述人egfr表达载体和所述报告基因cmv-luciferase质粒转入宿主细胞，培养一段时间后加入抗生素进行抗性筛选；通过有限稀释或单细胞打印方法获得单克隆细胞；采用facs和化学发光法，筛选出目的基因高表达的所述单克隆稳转靶细胞chok1-egfr-cmv-luciferase。5.根据权利要求4所述的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，其特征在于，其中，所述宿主细胞为永生细胞系、癌细胞系或原代癌细胞系，包括cho-k1、hek293、u87mg、ht-29、a549、ncih460、mda-mb231、hela或pc-3，所述抗生素为g418、puromycin、neomycin或hygromycin b。6.根据权利要求1所述的抗egfr&cd3双靶点抗体生物学活性的检测方法，其特征在于，其中，所述效应细胞为具有杀伤活性的免疫细胞系，包括hut-78、jurkat、ccrf-cem、h9或molt-4。

技术总结
本发明提供了一种抗EGFR&CD3双靶点抗体生物学活性的检测方法，该检测方法包括：构建人EGFR表达载体，采用人EGFR表达载体和报告基因CMV-luciferase质粒构建单克隆稳转靶细胞CHOK1-EGFR-CMV-luciferase，加入抗EGFR&CD3双靶点抗体共培养效应细胞和单克隆稳转靶细胞CHOK1-EGFR-CMV-luciferase后，检测Luciferase信号值是否随抗EGFR&CD3双靶点抗体浓度的增加而降低。与现有技术相比，该检测方法采用单克隆稳转细胞株组合(效应细胞和单克隆稳转靶细胞CHOK1-EGFR-CMV-luciferase)，在评价抗EGFR&CD3双靶点抗体生物学活性时，具有操作简便、耗时短、成本低廉、可高通量、性能稳定和重复性好等优势，同时最重要的优势是能够体现抗EGFR&CD3双靶点抗体的协同效应生物学功能。学功能。学功能。


技术研发人员：崔灵英 潘腾飞
受保护的技术使用者：宁波甲贝医药科技有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/14