Oligo(dT)beads试剂在富集和纯化双链DNAPolyA中的应用的制作方法

oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用。


背景技术：

2.oligo(dt)磁珠为磁珠表面共价偶联oligo(dt)。磁珠尺寸均匀，在溶液中可灵活移动，这使得微珠捕获表面能够在mrna捕获阶段与整个总rna样品快速连续地相互作用，进而oligo(dt)与真核生物mrna尾部的poly a互补配对，可用于高效地从任何总真核生物rna或直接从动植物组织或细胞裂解物中快速分离出完整、高纯度的mrna。
3.oligo(dt)磁珠的应用主要是利用oligo(dt)磁珠与含有poly a的mrna结合达到从复杂总mrna中富集mrna的目的(genet mol biol.2023 jan 6；45(4):e20210379；biol proced online.2022 dec 27；24(1):26)。michael beverly(anal bioanal chem.2018 feb；410(6):1667-1677)利用rnase t1处理体外转录合成的mrna，酶切得到游离的poly a mrna片段，再利用oligo(dt)磁珠从溶液中富集poly a mrna片段，进而利用质谱手段检测出poly a mrna片段中a的数量。
4.目前市售的oligo(dt)磁珠，如thermo公司的dynabeads
tm mrna纯化试剂盒(用于从总rna制备液中纯化mrna)，货号61006；neb公司的oligo d(t)25magnetic beads，货号s1419s；国产beaver公司的oligo dt磁珠，货号70430-1。这些磁珠均用来富集和纯化单链的富含poly a的mrna。


技术实现要素：

5.双链dna poly a，即poly a片段为dna，且该dna片段含有双链，其中一条链富含poly a，另外一条链为与poly a互补的poly t片段。本发明将oligo(dt)beads用于富集和纯化双链dna poly a，提供了一种oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法。
6.本发明的具体技术方案如下：
7.本发明提供的oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤s1，双链dna poly a的富集纯化：用与oligo(dt)beads配套的binding buffer清洗oligo(dt)beads，收集oligo(dt)beads，加入binding buffer，加入含有双链dna poly a的溶液混合均匀并反应一段时间，收集oligo(dt)beads；步骤s2，双链dna poly a的洗脱：向步骤s1最终收集到的oligo(dt)beads中加入洗脱液，洗脱一段时间后，收集上清液，该上清液即含有富集纯化到的双链dna poly a。
8.本发明提供的oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法，还具有这样的技术特征，其中，oligo(dt)beads为oligo(dt)偶联到琼脂糖beads表面或oligo(dt)偶联到磁珠表面。
9.本发明提供的oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法，
还具有这样的技术特征，其中，步骤s1中反应一段时间为5-30min。
10.本发明提供的oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法，还具有这样的技术特征，其中，步骤s2中洗脱液为与oligo(dt)beads配套的洗脱液、rna储存溶液或无菌无rna酶水，洗脱一段时间为2-5min。
11.发明的作用与效果
12.本发明采用oligo(dt)beads与双链dna poly a混合孵育，实现从复杂体系中富集和纯化双链dna poly a的目的。本发明提供的oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法，操作简便，富集纯化耗时短，便于通量操作。
附图说明
13.图1是本发明实施例1富集纯化得到的样品的总离子色谱图。
14.图2是本发明实施例1富集纯化得到的样品在10.04min的去卷积局部放大图(27000-29000da)。
15.图3是本发明实施例1富集纯化得到的样品在10.38min的去卷积局部放大图(26800-28500da)。
16.图4是本发明实施例2富集纯化得到的样品的总离子色谱图。
17.图5是本发明实施例2富集纯化得到的样品在10.03min的去卷积局部放大图(27000-29000da)。
18.图6是本发明实施例2富集纯化得到的样品在10.39min的去卷积局部放大图(26800-28500da)。
具体实施方式
19.在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
20.在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
21.下述实施例中所采用的试剂为普通商业途径购得，未注明的实验操作及实验条件参考本领域的常规操作及常规条件。
22.以下结合实施例和附图来说明本发明的具体实施方式。
23.《实施例1》
24.本实施例将thermo公司的dynabeads
tm mrna纯化试剂盒(货号61006)用于富集和纯化双链dna poly a，应用方法如下：
25.步骤s1，双链dna poly a的富集纯化：用与oligo(dt)beads配套的binding buffer清洗oligo(dt)beads，收集oligo(dt)beads，加入binding buffer，加入含有双链dna poly a的溶液混合均匀并反应一段时间，收集oligo(dt)beads，具体过程为：
26.取纯化试剂盒中oligo(dt)磁珠溶液200μl，置于磁力架上2min，移除上清液；加入纯化试剂盒内配套的binding buffer 180μl，用枪头混合均匀后，置于磁力架上2min，移除上清液；加入180μl纯化试剂盒内配套的binding buffer，再加入180μl含有双链dna poly a的溶液(如质粒酶切反应体系或任何含有poly a双链的dna片段混合液)，用枪头混合均匀，放置恒温混匀仪中反应30min(25℃，600rpm)；反应完成后，将上述反应液置于磁力架上
2min，移除上清液，收集oligo(dt)磁珠。
27.步骤s2，双链dna poly a的洗脱：向步骤s1最终收集到的oligo(dt)beads中加入洗脱液，洗脱一段时间后，收集上清液，该上清液即含有富集纯化到的双链dna poly a，具体过程为：
28.向步骤s1最终收集到的oligo(dt)磁珠中加入50μl洗脱液storage solution(rna储存溶液，thermo公司，货号：am7001)。放置恒温混匀仪中洗脱2min(25℃，600rpm)，置于磁力架上2min，收集上清液。
29.取20μl步骤s2收集的上清液转移到进样小瓶的内插管中作为样品，进行lc-ms分析。
30.图1是本发明实施例1富集纯化得到的样品的总离子色谱图。图2是本发明实施例1富集纯化得到的样品在10.04min的去卷积局部放大图(27000-29000da)。图3是本发明实施例1富集纯化得到的样品在10.38min的去卷积局部放大图(26800-28500da)。
31.由图1、2和3可知，本实施例富集纯化得到的样品中检测到双链dna poly a，且检测到双链dna poly a的两条单链，两条单链分别为富含poly a的单链与富含poly t的单链。表明采用本实施例的应用方法，实现了从复杂体系中富集和纯化双链dna poly a的目的。
32.《实施例2》
33.本实施例将neb公司的oligo d(t)25magnetic beads(货号s1419s)用于富集和纯化双链dna poly a，应用方法如下：
34.步骤s1，双链dna poly a的富集纯化：用与oligo(dt)beads配套的binding buffer清洗oligo(dt)beads，收集oligo(dt)beads，加入binding buffer，加入含有双链dna poly a的溶液混合均匀并反应一段时间，收集oligo(dt)beads，具体过程为：
35.取试剂盒中oligo d(t)25磁珠溶液200μl，置于磁力架上2min，移除上清液；加入试剂盒内配套的binding buffer 180μl，用枪头混合均匀后，置于磁力架上2min，移除上清液；加入180μl试剂盒内配套的binding buffer，再加入180μl含有双链dna poly a的溶液(该溶液为质粒酶切后混合液)，用枪头混合均匀，放置恒温混匀仪中反应30min(25℃，600rpm)；反应完成后，将上述反应液置于磁力架上2min，移除上清液，收集oligo d(t)25磁珠。
36.步骤s2，双链dna poly a的洗脱：向步骤s1最终收集到的oligo(dt)beads中加入洗脱液，洗脱一段时间后，收集上清液，该上清液即含有富集纯化到的双链dna poly a，具体过程为：
37.向步骤s1最终收集到的oligo d(t)25磁珠中加入50μl洗脱液storage solution(rna储存溶液，thermo公司，货号：am7001)。放置恒温混匀仪中洗脱2min(25℃，600rpm)，置于磁力架上2min，收集上清液。
38.取20μl步骤s2收集的上清液转移到进样小瓶的内插管中作为样品，进行lc-ms分析。
39.图4是本发明实施例2富集纯化得到的样品的总离子色谱图。图5是本发明实施例2富集纯化得到的样品在10.03min的去卷积局部放大图(27000-29000da)。图6是本发明实施例2富集纯化得到的样品在10.39min的去卷积局部放大图(26800-28500da)。
40.由图4、5和6可知，本实施例富集纯化得到的样品中检测到双链dna poly a，且检测到双链dna poly a的两条单链，两条单链分别为富含poly a的单链与富含poly t的单链。表明采用本实施例的应用方法，同样实现了从复杂体系中富集和纯化双链dna poly a的目的。
41.以上是对实施例的详细描述，方便本领域的技术人员能正确理解和使用本发明。凡本领域的技术人员依据本发明在现有技术基础上，不经过创新性的劳动，仅通过分析、类推或有限列举等方法得到的改进或修改技术方案，都应该在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤s1，双链dna poly a的富集纯化：用与oligo(dt)beads配套的binding buffer清洗oligo(dt)beads，收集oligo(dt)beads，加入所述binding buffer，加入含有双链dna poly a的溶液混合均匀并反应一段时间，收集oligo(dt)beads；步骤s2，双链dna poly a的洗脱：向步骤s1最终收集到的oligo(dt)beads中加入洗脱液，洗脱一段时间后，收集上清液，该上清液即含有富集纯化到的双链dna poly a。2.根据权利要求1所述的oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法，其特征在于，其中，所述oligo(dt)beads为oligo(dt)偶联到琼脂糖beads表面或oligo(dt)偶联到磁珠表面。3.根据权利要求1所述的oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法，其特征在于，其中，步骤s1中所述反应一段时间为5-30min。4.根据权利要求1所述的oligo(dt)beads试剂在富集和纯化双链dna poly a中的应用方法，其特征在于，其中，步骤s2中所述洗脱液为与oligo(dt)beads配套的洗脱液、rna储存溶液或无菌无rna酶水，所述洗脱一段时间为2-5min。

技术总结
本发明提供了一种Oligo(dT)beads试剂在富集和纯化双链DNAPoly A中的应用方法，该方法包括：步骤S1，双链DNA Poly A的富集纯化：用与Oligo(dT)beads配套的Binding Buffer清洗Oligo(dT)beads，收集Oligo(dT)beads，加入Binding Buffer，加入含有双链DNA Poly A的溶液混合均匀并反应一段时间，收集Oligo(dT)beads；步骤S2，双链DNA Poly A的洗脱：向步骤S1最终收集到的Oligo(dT)beads中加入洗脱液，洗脱一段时间后，收集上清液，该上清液即含有富集纯化到的双链DNA Poly A。其中，Oligo(dT)beads为Oligo(dT)偶联到琼脂糖beads表面或Oligo(dT)偶联到磁珠表面。本发明采用Oligo(dT)beads与双链DNA Poly A混合孵育，实现从复杂体系中富集和纯化双链DNA Poly A的目的。本发明提供的应用方法，操作简便，富集纯化耗时短，便于通量操作。便于通量操作。


技术研发人员：陈小梅 张伟 赵国凤 李娇
受保护的技术使用者：上海甲贝医药科技有限公司
技术研发日：2023.03.20
技术公布日：2023/8/14