检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变的引物和探针及方法与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于幽门螺杆菌克拉霉素耐药突变检测的方法，本发明还涉及到利用所述的引物探针相组合检测hp克拉霉素耐药的试剂盒。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)在全球感染率超过50％，我国平均感染率达到了59％。hp是胃部疾病的罪魁祸首，常引起慢性胃炎、胃溃疡等，甚至引起胃粘膜组织相关淋巴瘤(malt)甚至胃癌。2015年《幽门螺杆菌胃炎京都全球共识》指出hp是一种感染性疾病，应该积极的治疗。我国《第六次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》指出，hp感染者有意愿治疗者，应治尽治。目前，我国hp治疗方案推荐四联疗法，包括铋剂、质子泵抑制剂和两种抗生素。克拉霉素在我国hp根除治疗中有十分重要的作用，最早的《共识》中将包含克拉霉素的方案列为一线治疗方案。在目前治疗hp的方案中，克拉霉素常被作为经验性用药的首选。然而，由于耐药率的不断升高，我国hp初次根治成功率正在急速下降。我国《共识》指出，hp克拉霉素的耐药率达到了20％～50％，这正是导致根治成功率下降的主要原因。《共识》也明确指出，检测耐药具有十分重要的临床价值。检测hp克拉霉素耐药分为传统方法和分子检测方法。传统方法，由于hp分离培养困难，耗时长，成功率低，技术要求高，阻止了其在临床实际中的使用。
3.hp克拉霉素耐药，主要是由于其23s rdna耐药相关突变引起，主要有a2412g、a2142c、a2143g几种突变。目前，检测克拉霉素耐药突变的方法有taqman探针法、高分辨溶解曲线方法等，这些方法的单一使用，区分力比较低，在实际检测中效果不理想。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题为：提供一种用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23s rdna突变的引物和探针组合及检测方法。
5.本发明的技术方案为：用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23s rdna突变的引物和探针组合，包括：突变阻滞扩增引物组、分子信标引物和探针组合；所述突变阻滞扩增引物组由引物野生arms-f、引物a2142g-arms-f、引物a2142c-arms-f、引物a2143g-arms-f和引物arms-r组成，分子信标引物和探针组合由引物mbeacon-f、引物mbeacon-r和探针野生-mbeacon-p、探针a2142g-mbeacon-p、探针a2142c-mbeacon-p、探针a2143g-mbeacon-p组成；所述引物野生arms-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，引物a2142g-arms-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，引物a2142c-arms-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，引物a2143g-arms-f的核苷酸序列如seq id no.4所示，引物arms-r的核苷酸序列如seq id no.5所示，引物mbeacon-f的核苷酸序列如seq id no.6所示，引物mbeacon-r的核苷酸序列如seq id no.7所示，探针野生-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.8所示，探针a2142g-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.9所示，探针a2142c-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.10所示，探针a2143g-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.11所示；其中，探针野
生-mbeacon-p从5’端起第15个碱基a和第16个碱基a为锁核酸，探针a2142g-mbeacon-p从5’端起第15个碱基g为锁核酸，探针a2142c-mbeacon-p从5’端起第15个碱基c为锁核酸，探针a2143g-mbeacon-p从5’端起第16个碱基g为锁核酸。
6.进一步地，探针野生-mbeacon-p 5
′
端标记发光基团为fam，淬灭基团为bhq1，探针a2142g-mbeacon-p、探针a2142c-mbeacon-p、探针a2143g-mbeacon-p的5
′
端标记发光基团为hex，淬灭基团为bhq1。
7.一种试剂盒，含有上述所述的引物和探针组合。
8.进一步地，还含有荧光pcr反应液、阴性对照或阳性对照中的一种或多种，所述阴性对照为克拉霉素敏感hp菌株的dna，所述阳性对照为克拉霉素耐药hp菌株的dna。
9.检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23s rdna突变的方法，以样品总dna为模板，以上述所述的引物和探针组合进行实时荧光定量pcr，根据扩增曲线判定结果。
10.进一步地，实时荧光定量pcr反应体系为：
11.成分浓度加入量荧光pcr反应buffer2x10μl引物和探针组合混合液10μm4.6μldd水
‑‑‑
1.4μl模板
‑‑‑
4.0μl总体积
‑‑‑
20μl
12.进一步地，实时荧光定量pcr反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，65℃退火30s，10个循环；95℃15s，58℃退火30s，40个循环(采集荧光)。
13.进一步地，同时设立阳性对照和阴性对照，在对照扩增有效的情况下，样本的检测结果才可信；fam通道出现扩增信号为野生型，vic通道出现扩增信号为耐药型，fam/vic通道同时出现信号为野生/突变杂合型。
14.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
15.本发明采用“突变阻滞扩增(arms)、分子信标探针(molecular beacon)和锁核酸(lna)”联合使用检测hp克拉霉素耐药突变相关的技术，通过三种方法合理设计，进行梯度实时荧光pcr扩增，达到检测目的。该方法检测hp克拉霉素耐药突变敏感度高，特异性强，并且在实际样本检测中显示出了较好的检测效果。
附图说明
16.图1野生型探针对野生型、a2142g、a2142c、a2143g四种模板检测结果；
17.图2a2142g探针对野生型、a2142g、a2142c、a2143g四种模板检测结果；
18.图3a2142c探针对野生型、a2142g、a2142c、a2143g四种模板检测结果；
19.图4a2143g探针对野生型、a2142g、a2142c、a2143g四种模板检测结果；
20.图5对临床分离hp菌株检测结果图；
21.图6对胃粘膜标本检测结果图；
22.图7对粪便标本检测结果图。
具体实施方式
23.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
24.针对幽门螺杆菌克拉霉素耐药突变相关基因23s rdna野生型别及三种突变a2142g、a2142c、a2143g分别设计了arms引物、分子信标引物、分子信标探针，通过梯度实时荧光pcr达到检测目的。
25.针对四种基因类型分别设计一条arms上游引物，并且共用一条下游引物。arms引物长度为15bp～38bp，并且具有较高的退火温度，范围应为64℃～70℃，优选地，最佳退火温度应为65℃。
26.arms引物序列为：
27.野生arms-f：aggtgaaaattcctcctacccgcggcaagacggaa(seq id no.1)；
28.a2142g-arms-f：aggtgaaaattcctcctacccgcggcaagacggg(seq id no.2)；
29.a2142c-arms-f：aggtgaaaattcctcctacccgcggcaagacggc(seq id no.3)；
30.a2143g-arms-f：aggtgaaaattcctcctacccgcggcaagacggag(seq id no.4)；
31.arms-r：atggctccataagagccaaagcccttacttcaaagcct(seq id no.5)。
32.针对四种基因类型设计分子信标检测引物及探针，分子引物的退火温度范围应为54℃～60℃，优选地，最佳退火温度应为58℃～60℃。分子信标探针中添加锁核酸碱基，位于突变对应的位置。探针5
′
端发光基团可以为fam、hex、tamra、texasred、rox、cy3、cy5中的一种，3
′
端淬灭基团为bhq1或bhq2中的一种。
33.优选地本发明中野生型探针，5
′
端标记发光基团为fam，淬灭基团为bhq1；突变型探针5
′
端标记发光基团为hex，淬灭基团为bhq1。
34.分子信标引物和探针序列为：
35.mbeacon-f:aggtgaaaattcctcctacccg(seq id no.6)；
36.mbeacon-r:atggctccataagagccaaagc(seq id no.7)；
37.野生-mbeacon-p：cgaccgcaagacggaaagaccccgtggaccggtcg(seq id no.8)，锁核酸标记位置为5
′→3′
第15个碱基a和第16个碱基a；
38.a2142g-mbeacon-p：ccaggccaagacgggaagaccccgtgggcctgg(seq id no.9)，锁核酸标记位置为5
′→3′
第15个碱基g；
39.a2142c-mbeacon-p：cgaccgcaagacggcaagaccccgtggaccggtcg(seq id no.10),锁核酸标记位置为5
′→3′
第15个碱基c；；
40.a2143g-mbeacon-p：ccaggccaagacggagagaccccgtggacgcctgg(seq id no.11)，锁核酸标记位置为5
′→3′
第16个碱基g。
41.检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23s rdna突变的方法，以样品总dna为模板，以上述所述的引物和探针组合进行实时荧光定量pcr，根据扩增曲线判定结果。
42.反应体系为20μl，其优选配置为：
43.成分浓度加入量荧光pcr反应buffer2x10μl引物和探针组合混合液10μm4.6μldd水
‑‑‑
1.4μl
模板
‑‑‑
4.0μl总体积
‑‑‑
20μl
44.本发明的实时荧光定量pcr扩增程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，65℃退火30s，10个循环；95℃15s，58℃退火30s，40个循环(采集荧光)。
45.本发明需要同时设立阳性对照和ntc对照(所述阴性对照为克拉霉素敏感hp菌株的dna，所述阳性对照为克拉霉素耐药hp菌株的dna)，在对照扩增有效的情况下，样本的检测结果才可信。fam通道出现扩增信号为野生型，vic通道出现扩增信号为耐药型，fam/vic通道同时出现信号为野生/突变杂合型。
46.实施例1
47.采用本发明构建的引物、探针及检测体系，分别对幽门螺杆菌23s rdna基因克拉霉素耐药相关突变位点进行检测，验证其特异性。所使用的检测阳性对照为人工合成基因序列，保存于质粒载体上。结果显示，本发明所构建的野生型及突变型检测引物和探针，能很好的检测所对应的基因类型，并且对其他类型无非特异扩增。结果见图1-4。
48.实施例2
49.检测灵敏度验证。采用本发明构建的引物、探针及检测体系对各个基因类型的不同浓度的阳性模板进行检测，根据基因组大小换算其检测下限，验证其检测的灵敏度。结果显示所构建的检测体系，对野生型、a2142g、a2142c、a2143g模板检测灵敏度分别能达到20copy、10copy、10copy和5copy。结果见表1。
50.表1克拉霉素耐药检测灵敏度
[0051] 野生型a2142ga2142ca2143gct值37.637.437.738.0copy数2010105
[0052]
实施例3
[0053]
菌株检测验证
[0054]
采用本发明的幽门螺杆菌克拉霉素耐药检测体系，对临床分离到的hp菌株进行检测，判断其克拉霉素耐药情况，并与传统的药敏试验结果进行对比。结果显示，在60株hp菌株检测中，本发明所形成的检测方法与传统药敏试验方法，具有较高的一致性，kappa一致性检验结果达到0.81。结果见表2和图5。
[0055]
表2 hp菌株克拉霉素耐药检测结果
[0056][0057][0058]
实施例4
[0059]
胃粘膜标本检测验证
[0060]
采用本发明中的方法，对120份hp感染阳性者胃粘膜标本进行克拉霉素耐药检测，

技术特征：
1.检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23s rdna突变的引物和探针组合，其特征在于，包括：突变阻滞扩增引物组、分子信标引物和探针组合；所述突变阻滞扩增引物组由引物野生arms-f、引物a2142g-arms-f、引物a2142c-arms-f、引物a2143g-arms-f和引物arms-r组成，分子信标引物和探针组合由引物mbeacon-f、引物mbeacon-r和探针野生-mbeacon-p、探针a2142g-mbeacon-p、探针a2142c-mbeacon-p、探针a2143g-mbeacon-p组成；所述引物野生arms-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，引物a2142g-arms-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，引物a2142c-arms-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，引物a2143g-arms-f的核苷酸序列如seq id no.4所示，引物arms-r的核苷酸序列如seq id no.5所示，引物mbeacon-f的核苷酸序列如seq id no.6所示，引物mbeacon-r的核苷酸序列如seq id no.7所示，探针野生-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.8所示，探针a2142g-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.9所示，探针a2142c-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.10所示，探针a2143g-mbeacon-p的核苷酸序列如seq id no.11所示；其中，探针野生-mbeacon-p从5’端起第15个碱基a和第16个碱基a为锁核酸，探针a2142g-mbeacon-p从5’端起第15个碱基g为锁核酸，探针a2142c-mbeacon-p从5’端起第15个碱基c为锁核酸，探针a2143g-mbeacon-p从5’端起第16个碱基g为锁核酸。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，探针野生-mbeacon-p 5
′
端标记发光基团为fam，淬灭基团为bhq1，探针a2142g-mbeacon-p、探针a2142c-mbeacon-p、探针a2143g-mbeacon-p的5
′
端标记发光基团为hex，淬灭基团为bhq1。3.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还含有荧光pcr反应液、阴性对照或阳性对照中的一种或多种，所述阴性对照为克拉霉素敏感hp菌株的dna，所述阳性对照为克拉霉素耐药hp菌株的dna。5.检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因23s rdna突变的方法，其特征在于，以样品总dna为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行实时荧光定量pcr，根据扩增曲线判定结果。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量pcr反应体系为：6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量pcr反应体系为：。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量pcr反应程序为：37℃去污染2min，95℃预变性10min；95℃变性15s，65℃退火30s，10个循环；95℃15s，58℃退火30s(采集荧光)，40个循环。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，同时设立阳性对照和阴性对照，在对照扩增有效的情况下，样本的检测结果才可信；fam通道出现扩增信号为野生型，vic通道出现扩增信号为耐药型，fam/vic通道同时出现信号为野生/突变杂合型。

技术总结
本发明公开了检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因突变的引物和探针及方法，包括：突变阻滞扩增引物组、分子信标引物和探针组合；本发明采用“突变阻滞扩增(ARMS)、分子信标探针(Molecular Beacon)和锁核酸(LNA)”联合使用检测HP克拉霉素耐药突变相关的技术，通过三种方法合理设计，进行梯度实时荧光PCR扩增，达到检测目的。该方法检测HP克拉霉素耐药突变敏感度高，特异性强，并且在实际样本检测中显示出了较好的检测效果。了较好的检测效果。了较好的检测效果。


技术研发人员：刘国栋 王琦 王南苗
受保护的技术使用者：苏州长柏生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.17
技术公布日：2023/8/14