一种仿生脂质体杂合囊泡及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种仿生脂质体杂合囊泡及其制备方法与应用。


背景技术：

2.肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是我国的常见病和多发病，高居全球癌症相关死亡原因第三位。射频消融(rfa)具有微创、高效、疗效确切的优势，因而被多种指南推荐为治疗早期hcc的首选方案之一，然而射频消融术后肿瘤复发率高，且目前没有确切的有效治疗方案。
3.hcc具有高度分子异质性，对常规化疗和放疗治疗不敏感，多激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,tkis)是唯一被推荐作为hcc系统治疗的靶向药物。仑伐替尼(lenvatinib)是新一代的多激酶抑制剂，作用于血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,vegfr1-3)、成纤维细胞生长因子1-4(fibroblast growth factor 1-4,fgf1-4)、和血小板源生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,pdgfr)等靶点，因在临床试验中对晚期hcc疗效较索拉菲尼的非劣性预后，pdgfr被推荐为晚期hcc的一线药物。然而，hcc对lenvatinib的反应率仅有15-20％。
4.lenvatinib和抗pd-1抗体pembrolizumab对不可切除肝癌的临床试验初步结果令人鼓舞，其客观缓解率(orr)为46％，中位生存期22个月，中位无进展生存期9.5个月。因此，“靶免”治疗已被指南推荐为晚期hcc的系统治疗方案。rfa术后残余肿瘤vegf及pd-l1的表达均升高，因此，lenvatinib联合pd-1/pd-l1拮抗治疗是抑制rfa术后残余肿瘤进展的潜在方案。
5.尽管疗效可观，但是tkis的非靶向递送导致严重的药物毒副作用，包括肝功能受损、腹痛腹泻、高血压等。临床试验数据揭示tkis治疗的毒副作用使得患者不得不减量或中止用药，限制了hcc的有效治疗。一项研究表明，接受tki治疗后的hcc患者发生》＝3级别的毒副作用达45-75％。而在一项对比lenv atinib与sorafenib的有效性临床试验中，lenvatinib队列中由于毒副作用不得不减量药物或停药的病例分别占37％、40％。此外，游离pd-1/pd-l1药物的非靶向递送亦可带来严重的免疫相关毒副作用。目前尚未有可改善靶免治疗的非靶向递送毒副作用的药物体系。因此，亟需研发一种可提高靶免治疗药物肿瘤靶向的药物载体。
6.纳米囊泡已被证明可有效负载药物，减少游离药物外泄，提高药物的利用效率，但仍存在挑战。一方面，纳米囊泡作为外源物质，可被机体的单核巨噬系统识别并清除；另一方面，纳米药物依赖于异常血管的渗漏作用累积在肿瘤中，即实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，epr)，然而，在热消融后肿瘤微环境中血管结构被严重破坏，导致epr介导的纳米药物被动积累受限。不仅如此，肝脏中存在大量的库弗细胞(kuffer cel l)，可吞噬大部分流经肝脏血流的纳米药物。因此，热消融后联合靶免治疗需要一种可避免单核吞噬细胞的主动靶向给药策略。仿生技术利用天然细胞膜
来源的细胞囊泡包覆纳米药物。细胞膜保存了机体本身的完整的蛋白质脂质成份和表面蛋白，从而赋予纳米药物“隐身”功能，有助于减少被单核吞噬细胞识别和清除，可有效规避常规纳米药物的上述缺陷。
7.已有研究采用高表达pd-l1的her 293t细胞作为细胞膜来源，制备得到载亲水性雷帕霉素的仿生囊泡，以靶向t细胞递送雷帕霉素，从而抑制器官移植后的过度免疫排斥。但是，该技术存在如下缺陷：(1)该研究所用药物为亲水性药物，可溶解于pbs，因此通过物理载药方法可以获得较理想的载药量，但不适用于负载疏水性强的药物。这是因为，疏水性较强的小分子药物无法溶解于水系溶剂，仅可溶解于有机溶剂二甲基亚砜，而后者会对细胞膜造成破坏，这为载药囊泡的制备带来了挑战。目前尚未有报道可实现纯细胞膜成功载疏水药物的体系。申请人前期探究中发现，即便采用最低二甲基亚砜投量，纯细胞膜载lenvatnib效率仍过低，包封率仅为0.20
±
0.12％，而载药量仅为0.02
±
0.01％；(2)纯细胞囊泡稳定性差。提取细胞膜即获得细胞膜碎片，随后通过常规的挤压法等物理方法制备的囊泡存在完整性差且易发生互相融合、聚集的问题，因而不易储存，易泄露药物。申请人前期探究中通过电子透射电镜观察到纯细胞膜呈大小不一且存在较多细胞膜碎片的形貌(图2中的pm@len)，而动态光散射(dynamic light scattering,dls)法检测不同存放时间点的粒径变化时发现，纯细胞膜囊泡的粒径均一性显著差于脂质体(图3a-b)；(3)该类研究所用的细胞膜来源是人胚胎肾细胞her 293t，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，是常用的转染细胞模型，具有转染效率高，易于培养等优点。但是，该细胞无法直接由治疗对象收集获得，这存在机体免疫排斥的风险。
8.此外，经典的脂质体囊泡虽然具有载药量高、稳定性好的优点，但其药物输送依赖于epr效应，无肿瘤主动靶向功能。


技术实现要素：

9.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种仿生脂质体杂合囊泡及其制备方法与应用。
10.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种仿生脂质体杂合囊泡，具有巨噬细胞膜和磷脂脂质体，所述巨噬细胞膜表面表达pd-1和趋炎受体，所述磷脂脂质体负载疏水小分子药物。
11.作为优选方案，所述疏水小分子药物可以为仑伐替尼。
12.作为优选方案，所述巨噬细胞膜和所述磷脂脂质体的脂质质量比为1：10-25。
13.本发明还提供了上述仿生脂质体杂合囊泡的制备方法，包括如下步骤：
14.(1)构建稳定高表达pd-1的趋炎型巨噬细胞系
15.构建具有嘌呤霉素(puromycin)抗性及标记基因绿色荧光蛋白(green flu orescent protei,gfp)的pd-1基因过表达载体，进行病毒包装，将获得的重组载体病毒转染至巨噬细胞，采用puromycin筛选稳定表达pd-1及标记基因gfp的细胞，刺激细胞以进一步获得具有趋炎作用的巨噬细胞系；
16.(2)提取巨噬细胞膜
17.收集处于对数生长期的步骤(1)所述巨噬细胞系，提取巨噬细胞膜；
18.(3)制备载药的脂质体
19.将二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphocholine,dppc)、胆固醇(ch olesterol,cho)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(ethylene glycol),dspe-peg2000)共同溶解于有机溶剂，得到脂质溶液；将疏水小分子药物溶于二甲基亚砜中，加入所述脂质溶液中，充分混匀，去除有机试剂，铺成含有疏水小分子药物的脂质体薄膜，水化，超声促进水化后的脂质悬浮液形成脂质囊泡，即得载药的脂质体；
20.(4)制备仿生脂质体杂合囊泡
21.将步骤(2)所述巨噬细胞膜和步骤(3)所述载药的脂质体充分混合，滤膜挤推，除去游离的疏水小分子药物，即得仿生脂质体杂合囊泡。
22.作为优选方案，步骤(1)所述病毒包装采用293t细胞。
23.作为优选方案，步骤(1)所述巨噬细胞为小鼠巨噬细胞raw264.7。
24.作为优选方案，步骤(1)所述刺激细胞采用脂多糖(lipopolysaccharide,lps)。
25.步骤(2)所述提取巨噬细胞膜采用冻融法。
26.作为优选方案，步骤(3)所述有机溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合物；更优选地，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1。
27.作为优选方案，步骤(3)所述去除有机试剂采用于42℃，100rpm真空条件下进行旋蒸的方式。
28.作为优选方案，步骤(3)所述水化采用于超纯水中42℃下水化20min的方式。
29.作为优选方案，步骤(3)所述超声为依次采用水浴超声和探头超声。
30.作为优选方案，步骤(4)所述滤膜挤推为依次采用400nm的滤膜挤推，再采用200nm滤膜挤推。
31.作为优选方案，步骤(4)所述透析后得到的仿生脂质体杂合囊泡进行纯化，具体步骤可以为超速离心，超纯水重悬，4℃储存备用。
32.作为优选方案，所述超速离心为4℃真空条件下100000g超速离心15min。
33.本发明还提供了上述仿生脂质体杂合囊泡在制备抗肿瘤药物中的应用。
34.本发明还提供了上述仿生脂质体杂合囊泡在制备针对射频消融后残余肿瘤细胞药物中的应用。
35.作为优选方案，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。
36.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
37.(1)本发明针对射频消融后残余肿瘤细胞的特殊微环境，采用表达pd-1和趋炎受体的巨噬细胞作为细胞膜来源，与负载疏水小分子药物的磷脂制备的脂质体杂合，形成仿生脂质体杂合囊泡，融合了仿生体系和脂质体的优点。该囊泡双主动靶向肿瘤细胞：一方面，巨噬细胞膜表面的pd-1靶向表面表达pd-l1分子的肿瘤细胞，尤其是表面高表达pd-l1分子的rfa术后残余肿瘤细胞；另一方面，巨噬细胞膜表面具有多种趋炎受体，如趋化因子c-c基序受体家族，其靶向具有炎性分子的肿瘤细胞，尤其是富含炎性分子的残余肿瘤部位。囊泡双主动靶向的特点可增加疏水小分子药物在肿瘤局部的富集，减少药物的毒副作用。
38.(2)纯细胞膜脂质体载药量少且极不稳定，输送药物效率，而经典的脂质体囊泡具有载药量高、稳定性好的优点，但其药物输送依赖于epr效应，无肿瘤主动靶向功能。本发明
的仿生脂质体杂合囊泡采用磷脂制备脂质体，囊泡的对于疏水小分子药物载药效率高、稳定性好。
39.(3)巨噬细胞膜表面的pd-1可作为pd-l1治疗抗体，借助巨噬细胞良好的跨越生物屏障能力有效深入肿瘤组织，pd-1可阻断机体细胞毒性t细胞与肿瘤细胞的结合，从而解除pd-1/pd-l1的免疫衰竭作用，达到免疫治疗的目的。此外，巨噬细胞膜表面表达自身抗原，可减少机体的免疫清除，达到提高药物利用率，减少用药量的目的。
40.(4)与现有报道的载药仿生纳米体系相比，我们未采用细胞膜包裹固体内核的方式载药，而是通过杂合食品和药物管理局(food and drug administrati on,fda)批准的脂质成份的方式进行载药，这样的设计可以使成份不仅更加简单，利于载体在体内的代谢，生物相容性更好，具有临床转化前景。此外，巨噬细胞可来源于治疗对象，避免了机体免疫排斥的风险。
附图说明
41.图1是pd-1-gfp-raw264.7细胞系的稳定构建验证结果图；其中，(a)为流式细胞术分析raw264.7及pd-1-gfp-raw264.7的pd-1及gfp的表达，(b)为werstern blot分析raw264.7及pd-1-gfp-raw264.7的pd-1蛋白水平，(c)为激光共聚焦显微镜下观察raw264.7及pd-1-gfp-raw264.7的绿色荧光蛋白gfp(绿色)以及pd-1的表达(红色)(40
×
倍镜)。
42.图2是pm@len、l@len、pml@len的透射电镜图(标尺：200nm)。
43.图3是pm@len、l@len、pml@len的稳定性分析结果图；其中，(a)为粒径、(b)为多分散系数(polymer dispersity index,pdi)，(c)为zeta电位。
44.图4是sds-page后考马斯亮蓝染色检测蛋白分布结果图。
45.图5是不同药物在原位肝癌小鼠模型中的体内分布及瘤内富集检测结果图。
具体实施方式
46.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
47.实施例1稳定过表达pd-1的趋炎型巨噬细胞系的构建
48.1、构建具有puromycin抗性及标签基因gfp的pd-1过表达载体
49.以ncbi id 18566基因信息为参考，选择长度为867bp的基因(refseq:nm_008798.2,np_032824.1；uniprot id:q02242；具有puromycin抗性及标签基因gfp)，合成片段并克隆至plenticrisprv2(广州艾迪有限公司，edv5)载体上，获得过表达载体lenti-pdcd1-gfp-furin-puro。
50.2、摸索raw264.7细胞puromycin抗性敏感浓度
51.(1)常规培养raw264.7细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)，收集处于对数生长期的细胞，制备4
×
104cells/ml的细胞悬液，采用二倍稀释法铺于96孔板，96孔板每孔预先加入100μl完全培养基：在第一列加入100μl浓度4
×
104cells/ml的细胞悬液，用移液器混匀后取100μl加到第二列，后面每列重复这个过程。种板后培养24h，每孔加
入100μl含不同浓度puromycin的完全培养基，在37℃、5％co2培养箱中培养细胞，每48h更换一次含puromycin的培养基；每日观察并记录细胞在不同浓度下、不同密度下的变化；第7天，将培养基弃去，每孔加50μl 0.04％的台盼蓝，室温放置5min，统计细胞存活情况。
52.(2)结果显示，给药7天后raw264.7细胞在puromycin浓度为6μg/ml时全部死亡，确定了raw264.7细胞的puromycin筛选浓度为6μg/ml。
53.3、病毒包装
54.(1)无内毒素质粒提取
55.选用无内毒素质粒提取试剂盒(omega d6943-02)提取e.coli的质粒，具体操作严格按说明书进行，获得无内毒素质粒。
56.(2)病毒包装
57.1)培养293t细胞(procell，cl0005)，使其处于生长旺盛状态。
58.2)病毒包装前，弃去旧培养液，加入新鲜dmem培养基(含25μm ch loroquine diphosphate)，在培养箱中继续培养5h。
59.3)配制质粒混合液(质粒及转染混合试剂均购买于广州艾迪有限公司，edv12)。
60.表1
[0061][0062]
4)配制pei-opti-mem
[0063]
表2
[0064][0065]
5)将pei-opti-mem加入质粒混合液中，轻弹管壁混匀，室温静置孵育15min。
[0066]
6)将上一步孵育后的混合液滴加到opti-mem培养基中，轻轻晃动摇匀，在培养箱中继续培养。
[0067]
7)18h后吸去培养基，加入5ml新配制的完全培养基。
[0068]
8)48h后收集培养上清，离心，0.45μm滤膜过滤，液氮速冻，-80℃保存。
[0069]
4、细胞转染
[0070]
在六孔板中加入500μl的病毒液，随后立即加入处于对数生长期的raw267.4细胞(3.0
×
105cells/孔)，充分摇匀，随后细胞于培养箱中静置培养48h。
[0071]
5、阳性细胞多克隆筛选
[0072]
更换含有6μg/ml puromycin的完全培养基，每48h更换一次。筛选7d后，对照组细胞死亡，实验组存活的阳性细胞pd-1-raw267.4继续扩大培养。
[0073]
6、稳转株的验证
[0074]
(1)流式细胞术分析稳转株的pd-1及gfp表达
[0075]
常规培养raw267.4细胞及pd-1-raw267.4细胞，待处于对数生长期后以2.5
×
105cells/ml浓度铺于6孔板，培养基培养24h，用磷酸盐缓冲盐水1
×
pbs吹打收集细胞悬液，选用pe anti-mouse pd-1流式抗体(biolegend,135205)孵育20min，1
×
pbs洗涤后，重悬于100μl 1
×
pbs中，采用流式分析仪进行分析。
[0076]
(2)western blot分析稳转株的pd-1表达
[0077]
采用western blot分析raw267.4细胞及pd-1-raw267.4细胞的pd-1蛋白水平。细胞培养及铺板方法如步骤6(1)。每孔加入100μl蛋白裂解液(每1ml冷lysis buffer加入10μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂和5μl 100mm pmsf)，剧烈震荡30s、放置冰上5min，重复5次。12,000g、4℃离心5min，取上清，为全蛋白提取物。采用bca法测定蛋白浓度。加入混合蛋白液(全蛋白提取物和5
×
loading buffer按质量比4：1混合)，100℃水浴3min变性。sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶电泳条件为恒压80v、30min，分离胶为恒压120v、60min，随后选用0.45μm的pvdf膜常规转膜，转膜条件为恒流300ma。4％bsa室温封闭1h，加入anti-pd-1一抗(abcam，ab214421，稀释1000倍)4℃摇床中孵育过夜，1
×
tbst洗膜3次，加入hpr-山羊抗兔igg(abcam，ab205718，稀释1000倍)，常温摇床孵育1h，1
×
tbst洗膜3次，随后滴加化学发光液(millipore,wbkls0100)，采用化学发光仪(tanon 5200)进行曝光，保存图像。
[0078]
(3)免疫荧光分析稳转株的pd-1及gfp表达
[0079]
分别在共聚焦皿中接种raw267.4及pd-1-raw267.4细胞，细胞贴壁后弃培养基，pbs轻轻洗涤2次，4％多聚甲醛固定15min，1
×
pbs轻轻洗涤2次，3％bsa室温封闭1h，随后加入anti-pd-1一抗(ab214421，稀释100倍)，4℃孵育过夜，复温10min，1
×
pbs洗涤3次，加入alexa647-山羊抗兔igg(abcam，ab150079)，37℃避光孵育1h，1
×
pbs洗涤3次，dapi染色，1
×
pbs洗涤3次，共聚焦显微镜下成像。
[0080]
7、构建稳定高表达pd-1的趋炎型巨噬细胞系
[0081]
将上述验证确认的raw264.7 pd-1过表达稳转株铺于6孔板，待细胞融合达80％时，更换含有1μg/ml lps的dmem高糖完全培养基，刺激细胞12h，即可获得趋炎型巨噬细胞系。
[0082]
实施例2载lenvatinib的巨噬细胞膜-脂质体杂合囊泡的制备
[0083]
1、提取巨噬细胞膜
[0084]
上述细胞系稳定构建后进行巨噬细胞膜的提取，具体地，收集处于对数生长期的巨噬细胞，反复冻融-震荡5次以破坏细胞，4℃、1000g离心10min，随后3000g离心10min，取上清，即得到巨噬细胞膜。采用膜蛋白抽提试剂盒(碧云天，p0033)利用bca法测定巨噬细胞膜中蛋白量。巨噬细胞膜-80℃储存备用。
[0085]
2、制备载lenvatinib的脂质体
[0086]
采用薄膜-水化法制备载lenvatinib的脂质体。分别称取6mg dppc、2.5mg cho、1.5mg dspe-peg2000，共同溶解于5ml有机溶剂(二氯甲烷：甲醇＝1：1)中，得到脂质溶液，随后称取0.8mg lenvatinib溶于40ul二甲基亚砜中，将溶解完全的lenvatinib/二甲基亚砜溶液加入上述脂质溶液中，充分混匀，于42℃、100rpm真空条件下进行旋蒸，去除有机试剂，铺成含有lenvatinib的脂质体薄膜，随后加入5ml超纯水，于42℃下水化20min。随后，依
次水浴超声2min，探头超声1min(20％,3s on,3s off,1min)，即得到载lenvatinib的脂质体liposome@lenvatinib，缩写为l@len。
[0087]
3、制备载lenvatinib的巨噬细胞膜-脂质体杂合囊泡
[0088]
按质量比1：25(巨噬细胞膜的质量：脂质体的脂质质量)混合巨噬细胞膜及脂质体囊泡，水浴超声30s以充分混合，随后通过400nm滤膜挤推20次，通过200nm滤膜挤推20次，透析除去游离的lenvatinib药物，随后，4℃真空条件下100,000g超速离心15min，用超纯水重悬后，即得到载lenvatinib的仿生脂质体杂合囊泡pml@len，4℃储存备用。
[0089]
实施例3仿生脂质体杂合囊泡的基本表征
[0090]
1、透射电镜
[0091]
分别将载药脂质体l@len、杂合囊泡pml@len以及过表达pd-1的巨噬细胞膜挤推形成的囊泡pm@len各取10μl，滴加于铜网上，待样品吸附后，0.5％醋酸双氧铀染色30s，超纯水洗涤，透射电子显微镜下观察。
[0092]
2、粒径电位及稳定性分析
[0093]
将载药脂质体l@len、过表达pd-1的巨噬细胞膜挤推形成的囊泡pm@len以及杂合囊泡pml@len分别在制备后0、24、48、72、96、120、144h采用动态光散射(dynamic light scattering,dls)法测定粒径及电位。
[0094]
3、载药量分析
[0095]
分别将载药脂质体l@len、过表达pd-1的巨噬细胞膜挤推形成的囊泡pm@len以及杂合囊泡pml@len冻干后称重，随后用二甲基亚砜溶解，水浴超声20min充分破坏囊泡，采用高效液相色谱法测定囊泡中的lenvatinib浓度，计算包封率以及载药量。
[0096]
4、蛋白稳定性分析
[0097]
按实施例2的方法制备过表达pd-1的巨噬细胞膜(pd-1-mm)，将pd-1-mm、l@len、pm@len、pml@len加入loading buffer，100℃变性，sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，所得胶成像，观察蛋白分布与细胞膜的差异性，考察囊泡制备过程是否破坏膜蛋白。
[0098]
实施例4杂合囊泡的体内分布及肿瘤内富集分析
[0099]
为分析药物在体内的分布情况，建立小鼠原位肝癌模型。选择5-8周龄，体重16-25g的雌性c57bl/6小鼠(购买于广东省医学实验动物中心)，经检查无明显异常，进行适应性饲养7天后建立肝原位肿瘤，具体如下：小鼠麻醉后备皮，依次采用碘伏和酒精消毒手术部位，取剑突下腹正中切口，长约1cm，暴露肝叶，注射2.0
×
106cell/50μl的hepa1-6细胞(购买于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)悬浮液，轻轻回纳肝叶，采用可吸收手术缝线缝合切口，用碘伏和酒精再次切口，并观察小鼠苏醒状态，待小鼠正常活动后可放回鼠笼继续饲养。
[0100]
成瘤后，选用疏水小分子荧光染料dir替代lenvatinib，按实施例2的方法制备载药脂质体liposome@dir(药脂比为1.25％)以及杂合囊泡pml@dir。小鼠随机分为三组：游离dir(free dir)组、liposome@dir组、pml@dir，每只小鼠按分组注射100μl含有18μg dir药物的生理盐水。分别于注射后12、24、48h麻醉下处死小鼠，解剖心脏、肝脏、脾、肺、肾、肿瘤，采用小动物活体荧光成像系统进行成像，分析荧光强度，比较不同药物的体内生物分布及肿瘤内富集情况。
[0101]
检测结果
[0102]
1、稳转株的验证
[0103]
流式细胞术分析结果表明(图1a)，pd-1-raw264.7细胞的标记基因gfp以及pd-1通道的荧光强度均显著高于raw264.7细胞；western blot分析结果(图1b)表明，pd-1-raw264.7细胞的pd-1蛋白水平显著高于raw264.7细胞；免疫荧光实验中，激光共聚焦成像可直观地观察到pd-1-raw264.7细胞质中的绿色荧光蛋白以及细胞膜上的pe-pd-1荧光强度均显著高于raw264.7细胞(图1c)。以上结果从不同角度证明，pd-1-raw264.7细胞稳定过表达标记基因gfp以及pd-1。
[0104]
2、纳米囊泡的基本表征
[0105]
透射电镜观察下，pm@len形态不规整、均一性较差，而l@len和pml@len均一、球形(图2)。
[0106]
高效液相色谱法测得pm@len、l@len以及pml@len的包封率分别为0.20
±
0.12％、73.48
±
0.07％、64.14
±
0.14％，载药量分别为0.02
±
0.01％、9.22
±
0.01％、8.05
±
0.02％，说明脂质的掺入显著提高了细胞膜对lenvatinib的载药效能。
[0107]
动态光散射(dynamic light scattering,dls)法测得不同纳米囊泡在不同时间点的粒径、电位，结果见图3，l@len和pml@len的粒径大小变化以及多分散系数显著低于pm@len，这说明脂质的掺入可显著提高细胞膜纳米体系的稳定性。
[0108]
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝显示(图4)，杂合囊泡的蛋白分布与纯膜的蛋白分布无显著差别，说明杂合过程中未造成明显的膜蛋白破坏和损失。
[0109]
3、纳米囊泡的体内分布及瘤内富集
[0110]
原位肝癌小鼠注射药物后，在不同时间点药物的生物分布如图5。结果表明，liposome@dir组肿瘤荧光药物富集显著高于游离药物组(free dir)，这可能是因为liposome@dir减少游离药物的外泄，延长药物的外循环时间，而pml@dir组肿瘤荧光药物富集显著高于liposome@dir组，这可能是因为杂合囊泡表明过表达pd-1及表达趋炎受体的巨噬细胞膜具有双靶向作用所致。
[0111]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种仿生脂质体杂合囊泡，其特征在于，具有巨噬细胞膜和磷脂脂质体，所述巨噬细胞膜表面表达pd-1和趋炎受体，所述磷脂脂质体负载疏水小分子药物。2.根据权利要求1所述仿生脂质体杂合囊泡，其特征在于，所述疏水小分子药物为仑伐替尼。3.根据权利要求1所述仿生脂质体杂合囊泡，其特征在于，所述巨噬细胞膜和所述磷脂脂质体的脂质质量比为1：10-25。4.权利要求1-3任一项所述仿生脂质体杂合囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建稳定高表达pd-1的趋炎型巨噬细胞系构建具有puromycin抗性及标记基因gfp的pd-1基因过表达载体，进行病毒包装，将获得的重组载体病毒转染至巨噬细胞，采用puromycin筛选稳定表达pd-1及标记基因gfp的细胞，刺激细胞以进一步获得具有趋炎作用的巨噬细胞系；(2)提取巨噬细胞膜收集处于对数生长期的步骤(1)所述巨噬细胞系提取巨噬细胞膜；(3)制备载药的脂质体将二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)共同溶解于有机溶剂，得到脂质溶液；将疏水小分子药物溶于二甲基亚砜中，加入所述脂质溶液中，充分混匀，去除有机试剂，铺成含有疏水小分子药物的脂质体薄膜，水化，超声促进水化后的脂质悬浮液形成脂质囊泡，即得载药的脂质体；(4)制备仿生脂质体杂合囊泡将步骤(2)所述巨噬细胞膜和步骤(3)所述载药的脂质体充分混合，滤膜挤推，除去游离的疏水小分子药物，即得仿生脂质体杂合囊泡。5.根据权利要求4所述仿生脂质体杂合囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下各项中至少一项：步骤(1)所述病毒包装采用293t细胞；步骤(1)所述巨噬细胞为小鼠巨噬细胞raw264.7；步骤(1)所述刺激细胞采用脂多糖。6.根据权利要求4所述仿生脂质体杂合囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述有机溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合物。7.根据权利要求4所述仿生脂质体杂合囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下各项中至少一项：步骤(2)所述提取巨噬细胞膜采用冻融法；步骤(3)所述去除有机试剂采用于42℃，100rpm真空条件下进行旋蒸的方式；步骤(3)所述水化采用于超纯水中42℃下水化20min的方式；步骤(3)所述超声为依次采用水浴超声和探头超声；步骤(4)所述滤膜挤推为依次采用400nm的滤膜挤推，再采用200nm滤膜挤推。8.权利要求1-3任一项所述仿生脂质体杂合囊泡在制备抗肿瘤药物中的应用。9.权利要求1-3任一项所述仿生脂质体杂合囊泡在制备针对射频消融后残余肿瘤细胞药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。

技术总结
本发明公开了一种仿生脂质体杂合囊泡及其制备方法与应用。本发明的囊泡具有巨噬细胞膜和磷脂脂质体，所述巨噬细胞膜表面表达PD-1和趋炎受体，所述磷脂脂质体负载疏水小分子药物。本发明的囊泡融合了仿生体系和脂质体的优点，首先，双主动靶向肿瘤细胞，增加疏水小分子药物在肿瘤局部的富集，减少药物的毒副作用；其次，囊泡的对于疏水小分子药物载药效率高、稳定性好；再者，囊泡的巨噬细胞膜表面表达自身抗原，可减少机体的免疫清除，可提高药物利用率，减少用药量；最后，囊泡成份简单，利于载体在体内的代谢，生物相容性更好，可避免机体免疫排斥的风险，具有临床转化前景。具有临床转化前景。具有临床转化前景。


技术研发人员：郭焕玲 张春阳 龙海怡 谢晓华 徐明 谢晓燕 陈雨
受保护的技术使用者：中山大学附属第一医院
技术研发日：2023.03.02
技术公布日：2023/8/14