羟基酪醇苷在制备抗衰老制剂中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种羟基酪醇苷在制备抗衰老制剂中的应用。


背景技术：

2.衰老是组织和器官的功能随着时间的推移而逐渐丧失的过程，是一种复杂而缓慢并且不可避免的生理现象。它包括线粒体功能的变化，自噬，氧化应激，能量代谢改变，蛋白质稳态变化等。糖尿病，癌症，骨质疏松，神经退行性疾病和心血管疾病以及一些免疫疾病均与衰老相关。了解衰老和限制寿命的过程一直是生物学家所面临的挑战。
3.羟基酪醇苷(又称3、4-二羟基苯乙醇苷，htg)，是中药大血藤中的一种成分，具有抗氧化和抗炎作用。大血藤根及茎均可供药用，有通经活络、清热解毒、散瘀痛、理气行血等功效，用于肠痈腹痛，热毒疮疡，经闭，跌扑肿痛，风湿痹痛等。研究表明大血藤所含化学成分主要为木质素类、酚酸类、鞣质类、黄酮类等，羟基酪醇苷即为其中的酚酸类成分。苯乙醇苷类化合物具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等生物学活性，应用前景十分广阔。已有报道羟基酪醇苷的苷元羟基酪醇具有显著的抗衰老作用，但羟基酪醇苷的抗衰老生物学活性尚未有相关研究。


技术实现要素：

4.本发明提出羟基酪醇苷在制备抗衰老制剂中的应用，构建d-半乳糖(d-gal)诱导细胞衰老模型，明确羟基酪醇苷对d-gal诱导细胞衰老模型的保护作用。
5.本发明提出羟基酪醇苷在制备抗衰老制剂中的应用。
6.进一步地，所述抗衰老为d-半乳糖诱导的细胞衰老。
7.进一步地，羟基酪醇苷降低d-半乳糖诱导的细胞β-半乳糖苷(sa-β-gal)活性。
8.进一步地，羟基酪醇苷减少d-半乳糖诱导的细胞氧化应激。
9.进一步地，羟基酪醇苷增加d-半乳糖诱导的细胞中还原型谷胱甘肽(gsh)和超氧化物歧化酶(sod)含量。
10.进一步地，羟基酪醇苷增加d-半乳糖诱导的细胞三磷酸腺苷(atp)水平。
11.进一步地，羟基酪醇苷抑制d-半乳糖诱导的相关衰老相关分泌表型因子(sasp)的表达。
12.进一步地，羟基酪醇苷激活ampk和nrf2信号通路，提高相关蛋白的表达水平。
13.进一步地，羟基酪醇苷的浓度为1μm～300μm；
14.优选的，羟基酪醇苷的浓度为1μm～150μm。
15.进一步地，所述制剂还包括药学上可接受的辅料。
16.进一步地，所述制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、注射制剂。
17.本发明具有以下优势：
18.本发明提出的羟基酪醇苷在抗d-半乳糖诱导细胞衰老中的应用，通过实验发现，
羟基酪醇苷可延缓d-半乳糖诱导的细胞衰老，主要表现为降低β-半乳糖苷酶活性，降低细胞氧化应激，增加细胞atp水平，抑制相关sasp因子分泌，其机制与激活ampk和nrf2信号通路相关。
附图说明
19.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
20.图1为羟基酪醇苷提高hff细胞活力；
21.图2为羟基酪醇苷降低hff细胞中sa-β-gal活性；
22.图3为羟基酪醇苷降低hff细胞中ros水平；
23.图4为羟基酪醇苷增加hff细胞中gsh和sod含量；
24.图5为羟基酪醇苷增加hff细胞中的atp水平；
25.图6为羟基酪醇苷下调细胞相关sasp因子mrna表达水平；
26.图7为羟基酪醇苷激活ampk-sirt1信号通路；
27.图8为羟基酪醇苷激活nrf2-ho-1信号通路。
具体实施方式
28.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
29.现有技术中，研究人员对于羟基酪醇苷的具体用途研究较少，且主要研究方向为抗炎。本发明通过实验发现，羟基酪醇苷对d-半乳糖(d-galactose，d-gal)诱导引起的人包皮成纤维(human foreskin fibroblast，hff)细胞损伤具有一定的保护作用。
30.本发明一实施例提出羟基酪醇苷在制备抗衰老制剂中的应用。
31.具体而言，所述抗衰老为d-半乳糖(d-gal)诱导的细胞衰老。
32.本发明一实施例中，羟基酪醇苷降低d-gal诱导的细胞β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，sa-β-gal)活性。具体而言，本发明实施例中测定细胞内β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)活性，d-gal刺激hff细胞24h，细胞衰老标志物sa-β-gal活性升高，表现为蓝染，用不同浓度羟基酪醇苷预处理后，蓝染的细胞数目下降，衰老细胞数目减少，表明羟基酪醇苷可以延缓d-gal诱导的hff细胞衰老。
33.本发明一实施例中，羟基酪醇苷减少d-gal诱导的细胞氧化应激。本发明实施例测定细胞内活性氧(ros)的水平，d-gal刺激hff细胞24h，活性氧水平显著提高，药物处理后显著降低了ros的水平，降低细胞氧化应激。
34.本发明一实施例中，羟基酪醇苷增加hff细胞中还原型谷胱甘肽(gsh)和超氧化物歧化酶(sod)含量。本发明实施例测定细胞内还原型谷胱甘肽(gsh)和超氧化物歧化酶(sod)的含量，d-gal刺激hff细胞24h，gsh和sod含量显著降低，羟基酪醇苷预处理提高了hff细胞内的gsh和sod含量，减少细胞氧化应激。
35.本发明一实施例中，羟基酪醇苷增加d-gal诱导的细胞三磷酸腺苷(atp)水平。本发明实施例测定细胞内atp含量，d-gal刺激hff细胞24h，细胞atp水平下降，羟基酪醇苷预处理增加了atp水平。
36.本发明一实施例中，羟基酪醇苷抑制d-gal诱导的相关衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，sasp)因子的表达。本发明实施例测定细胞内相关衰老相关分泌表型(sasp)因子的mrna表达，d-gal刺激hff细胞24h，细胞sasp因子表达增加，羟基酪醇苷预处理抑制相关sasp因子表达。
37.本发明一实施例中，羟基酪醇苷激活ampk和nrf2信号通路，增加相关蛋白的表达水平。本发明实施例测定细胞内相关蛋白表达，羟基酪醇苷激活ampk和nrf2信号通路。
38.本发明一实施例中，羟基酪醇苷的浓度为1μm～300μm。优选的，羟基酪醇苷的浓度为1μm～150μm。
39.本发明一实施例中，所述制剂还包括药学上可接受的辅料。所述辅料可从常用的相应辅料中进行选择，而且可以根据制剂的具体剂型进行选择。所述辅料包括常用的甘露糖醇、纤维素、环糊精、淀粉、维生素e、聚乙二醇、滑石粉、肠溶包衣粉等。
40.本发明一实施例中，所述制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、散剂、丸剂、注射制剂。
41.下面将参考附图来详细说明本发明。
42.一、材料及实验方法
43.1.细胞培养及传代
44.取人包皮成纤维细胞(hff)解冻复苏后，无菌条件下移入细胞培养皿中，加入含10％牛血清的dmem培养基，于37℃、5％co2培养箱中培养。每隔2天换培养液，待细胞生长至80％-90％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化后1：2传代。
45.2.分组方法与实验设计
46.本实验以二甲双胍(met)为阳性药。实验分组：正常组、d-gal组、d-gal+htg组(50，100，150μm)组和d-gal+met(2mm)组。各药物处理组预先使用药物处理hff细胞24h后，再用d-gal(60g/l)处理24h。
47.3.细胞活性的测定
48.将制备得到的羟基酪醇苷用pbs溶解后，过0.22微米滤膜除菌，利用含有血清的dmem培养基进行稀释，使羟基酪醇苷终浓度为50μm、100μm、150μm。将细胞按照104个/孔接种到96孔板中培养24h，随后换成不同浓度羟基酪醇苷的培养基继续培养24h，再用d-gal(60g/l)处理24h。用cck-8法检测羟基酪醇苷对hff细胞活性的影响。每组设至少3个复孔。
49.4.衰老相关β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色
50.按照细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明操作，6孔板内各组细胞加入含羟基酪醇苷的培养基培养24h，再用d-gal(60g/l)处理24h。弃上清，用pbs洗涤1次，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液固定15min。吸除细胞固定液，用pbs洗涤细胞3次，每次3min。吸除pbs，每孔加入1ml染色工作液，37℃孵育过夜。普通光学显微镜下观察，蓝色为β-半乳糖苷酶染色阳性，随机挑选3个视野拍照。
51.5.细胞ros染色
52.6孔板内各组细胞按上述方法培养后，弃上清，用pbs洗涤1次，按照1:1000用无血清培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10μm。去除细胞培养液，加入1ml dcfh-da。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次。荧光显微镜下观察，随机挑选3个视野拍照。
53.6.细胞gsh测定
54.按照细胞gsh检测试剂盒说明操作，6孔板内各组细胞按上述方法培养后，弃上清，用pbs洗涤1次，离心收集细胞，再加入0.5ml裂解液破碎细胞。取破碎后的细胞悬液0.1ml，加0.1ml试剂一混匀，3500r/min，离心10分钟，取上清液，随后按表1进行操作。
55.表1
56.空白孔标准孔测定孔试剂一(μl)10020μmol/lgsh标准品(μl)100上清液(μl)100试剂二(μl)100100100试剂三(μl)252525
57.混匀，静置5分钟，405nm处，酶标仪测定各孔吸光度值，根据公式计算gsh含量。
58.7.细胞sod测定
59.按照细胞gsh检测试剂盒说明操作，6孔板内各组细胞按上述方法培养后，弃上清，用pbs洗涤1次，离心收集细胞，再加入0.5ml裂解液破碎细胞。按底物贮备液∶缓冲液按1∶200的比例混匀配成底物应用液，现用现配，按酶贮备液∶酶稀释液按1∶10的比例混匀配制成酶工作液，现用现配，随后按表2进行操作。
60.表2
61.对照孔对照空白孔测定孔测定空白孔待测样本(μl)20200蒸馏水(μl)2020酶工作液(μl)2020酶稀释液(μl)2020底物应用液(μl)200200200200
62.混匀，37℃孵育20分钟，450nm酶标仪读数，根据公式计算sod含量。
63.8.细胞atp含量测定
64.按照细胞atp检测试剂盒说明操作，6孔板内各组细胞按上述方法培养后，吸除培养液，每孔加入200μl裂解液，裂解细胞。裂解后4℃、12000g离心5分钟，取上清。配置atp标准曲线和检测工作液。加100μlatp检测工作液到检测孔或检测管内，室温放置3-5分钟，以使本底性的atp全部被消耗掉，从而降低本底。在检测孔或检测管内加上20μl样品或标准品，混匀，用化学发光仪测定，根据公式计算atp含量。
65.9.qrt-pcr检测
66.(1)总rna提取
67.l)细胞接种于6cm2培养皿中，各组细胞按上述方法培养后，弃上清，用pbs洗涤1次，直接加入1ml trizol，室温轻轻摇晃5min，随后将裂解液转移至1.5mlep管中。
68.2)加入0.2ml氯仿，剧烈震荡，静置5min，4℃412000rpm离心15min，收集上层有rna的水相。
69.3)将上清液移至1.5ml ep管中，加入等体积的异丙醇混匀，静置10min，4℃，12000rpm离心10min，rna沉淀沉与管侧或管底。
70.4)弃去上清液，再加1ml75％乙醇进行洗涤(depc水稀释)，涡旋混合后4℃，
12000rpm离心5min，留管内沉淀。
71.5)将获得的沉淀在超净台中自然干燥，然后加入适量的depc水将沉淀溶解，即可得到rna溶液。取1ul测rna浓度，其余在-80℃保存。
72.(2)去除基因组dna反应
73.按照表3于冰上配制反应混合液，42℃孵育2min，去除基因组dna。
74.表3
75.试剂使用量5
×
gdnaeraserbuffer2ulgdnaeraser1ultotalrna据rna实际浓度而定rnasefreedh2o定容至10μl
76.(3)rna反转录为cdna
77.按照表4配制反转录体系，37℃孵育15min使rna反转录为cdna，85℃孵育5sec使反转录酶失活，并取出置于冰上。
78.表4
79.试剂使用量上述反应液10ulprimescriptrtenzymemix1ulrtprimermix1ul5
×
primescriptbuffer2(forrealtime)4ulrnasefreedh2o4ultotal20ul
80.(4)实时荧光定量pcr
81.内参基因为β-actin，采用qrt-pcr技术检测sasp(il-6、il-8、il-1α、il-1β、cxcl1、cxcl2)因子的mrna表达水平，引物序列见表5。
82.表5
83.[0084][0085]
按照表6配置pcr反应体系，反应条件是95℃，30s；变性，95℃，5s；退火，55℃，30s；延伸，72℃，30s(40个循环)。
[0086]
表6
[0087]
试剂使用量2xtagpcrmastermix10μlcdna5μlforwardandreverseprimers0.5μlrnase-freewater4μl
[0088]
10.western blot实验
[0089]
(1)细胞蛋白提取
[0090]
将对数生长期的细胞接种在10cm2培养皿中，各组细胞按上述方法培养后，弃上清，用pbs洗涤1次，消化离心收集细胞。每个样品中加入500μl ripa裂解液，轻轻吹打，使其充分裂解，4℃，12000g离心10min，取上清，测定蛋白质浓度。将蛋白样品和5
×
上样缓冲液混合后，金属浴100℃加热5-10min使蛋白变性，存放于-80℃备用。
[0091]
(2)sds-page电泳
[0092]
安装垂直板电泳装置，配制sds聚丙烯酰胺凝胶(分离胶及浓缩胶)，如表7。
[0093]
表7
[0094]
12％分离胶(10ml)10％分离胶(10ml)5％浓缩胶(4ml)30％acr:bis4ml3.3ml0.67ml1.5mtris.cl(ph8.8)2.5ml2.5ml1mtris.cl(ph6.8)0.5mlddh203.2ml3.9ml2.69ml10％ap0.2ml0.2ml0.1ml10％sds0.1ml0.1ml40μltemed10μl10μl4μl
[0095]
凝胶浓度和蛋白分离范围，如表8：
[0096]
表8
[0097]
蛋白分子量(kda)凝胶浓度(％)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008
[0098]
向30.3tris-base，188g甘氨酸，10g sds干粉混合物中加入800ml超纯水，随后定容至1l，即为电泳缓冲液。上样蛋白量为20-30ug，并加入蛋白marker，浓缩胶80v，分离胶120v进行电泳，运行时间为1-2小时。
[0099]
(3)转膜
[0100]
将3.03tris-base，14.4g甘氨酸加超纯水定容至800ml，随后加入200ml甲醇，即为转膜缓冲液。将pvdf膜在甲醇中浸泡2分钟醒膜。按照纤维网、滤纸、pvdf膜、胶和滤纸、纤维网的顺序装好，夹紧电转夹。电转槽中加入约1l电转液，将电转夹放入电转仪中低温转膜，约1.5-2h，可根据自己的经验调整电流大小和转膜时间。
[0101]
(4)封闭及杂交
[0102]
将膜从电转槽中取出，利用tbst漂洗几次，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。将封闭好的膜用tbst清洗三次，放入稀释好的一抗中4℃孵育过夜。取出滤膜，用tbst洗膜三次，根据一抗来源选择合适的二抗，按相应比例稀释二抗，室温轻摇一小时。取出，用tbst洗膜三次，使用辣根过氧化物酶hrp-ecl发光法，将a、b发光液按1:1比例混合，将膜置于发光液中约1分钟，置于保鲜膜内固定于片盒中，关闭胶盒，曝光成片。
[0103]
实施例1细胞活性测定
[0104]
本次实验采用人包皮成纤维细胞(hff)进行实验，以二甲双胍作为阳性对照。为了测定药物作用于细胞的最佳浓度，采用cck8法检测细胞活性。利用不同浓度羟基酪醇苷(50，100，150μm)预处理24h，随后加入60g/l的d-gal处理24h，以二甲双胍(2mm)作为阳性对照，观测其对d-gal诱导衰老细胞的作用，采用cck-8法检测细胞活力，结果显示，d-gal模型组的细胞活力与正常对照组相比明显下降，50um、100um和150um的羟基酪醇苷预处理后的细胞活力显著增加，并呈现浓度依赖性(图1)。表明羟基酪醇苷和二甲双胍对d-gal引起的细胞损伤具有一定的保护作用。
[0105]
实施例2细胞sa-β-gal染色
[0106]
在衰老细胞中，衰老标志物β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)活性升高，表现为蓝染。将细胞按照106个/孔接种到6孔板中培养24h，随后换成不同浓度羟基酪醇苷的培养基继续培养24h，之后进行染色。sa-β-gal染色结果显示，与对照组相比，模型组中蓝染的细胞数显著增加，表明衰老细胞数明显增多，而用不同浓度羟基酪醇苷预处理后，蓝染的细胞数目下降，衰老细胞数目减少(图2)，表明羟基酪醇苷可以延缓d-gal诱导的hff细胞衰老。
[0107]
实施例3细胞ros染色
[0108]
在生物学背景下，活性氧(ros)是氧的正常代谢的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用。若受到刺激，ros水平会急剧增加，细胞内的活性氧(ros)水平的高低反映了细胞氧化应激的高低。与对照组相比，模型组的ros荧光强度显著上升，表
明细胞出现氧化应激。与模型组相比，用不同剂量羟基酪醇苷预处理后，ros荧光强度逐渐下降(图3)，表明羟基酪醇苷可以减少d-半乳糖诱导的hff细胞ros水平，减少氧化应激。
[0109]
实施例4细胞gsh和sod测定
[0110]
还原型谷胱甘肽(gsh)是绝大多数活细胞中巯基的主要来源，对于维持蛋白质中巯基适当的氧化还原状态有重要作用，并且是动物细胞中关键的抗氧化剂。超氧化物歧化酶(sod)能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，是一种重要的抗氧化酶。羟基酪醇苷以浓度依赖的方式提高了hff细胞内的gsh和sod含量(图4)，羟基酪醇苷可缓解d-gal诱导的细胞氧化应激，提升细胞抗氧化能力。
[0111]
实施例5细胞atp含量测定
[0112]
atp作为最重要的能量分子，在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用。atp水平的改变，会影响细胞的功能。d-gal刺激hff细胞衰老后，细胞atp水平下降，羟基酪醇苷预处理以剂量依赖的方式增加了atp水平(图5)。
[0113]
实施例6细胞sasp因子检测
[0114]
细胞衰老的同时常伴随着衰老相关分泌表型(sasp)的产生。sasp由促炎细胞因子、生长因子、趋化因子等一系列细胞因子组成，会导致机体慢性低度炎症和一系列疾病的发生，并可反作用于衰老细胞及其邻近细胞加速它们的衰老进程。羟基酪醇苷可降低sasp因子的mrna表达水平(图6)。
[0115]
实施例7细胞ampk和nrf2信号通路蛋白表达
[0116]
蛋白质印迹法测定羟基酪醇苷预处理对hff细胞ampk-sirt1信号通路蛋白表达情况，与d-gal模型组相比，羟基酪醇苷处理组ampk-sirt1蛋白表达增加，羟基酪醇苷可通过激活ampk-sirt1信号通路，减轻d-gal诱导的细胞衰老损伤(图7)。
[0117]
蛋白质印迹法测定羟基酪醇苷预处理对hff细胞nrf2-ho-1信号通路蛋白表达情况，与d-gal模型组相比，羟基酪醇苷处理组nrf2-ho-1蛋白表达增加，羟基酪醇苷可通过激活nrf2-ho-1信号通路，减轻d-gal诱导的细胞衰老损伤(图8)。
[0118]
二、制备方法
[0119]
制备例1含有羟基酪醇苷颗粒剂的制备方法
[0120]
取1重量份羟基酪醇苷作为原料药，加入9重量份淀粉，混合制粒，得颗粒剂。
[0121]
制备例2含有羟基酪醇苷胶囊剂的制备方法
[0122]
取1重量份羟基酪醇苷作为原料药，加入9重量份淀粉，混匀，装入胶囊，得胶囊剂。
[0123]
制备例3含有羟基酪醇苷片剂的制备方法
[0124]
取1重量份羟基酪醇苷作为原料药，加入7重量份淀粉，制粒，压片，制成片剂。
[0125]
制备例4含有羟基酪醇苷丸剂的制备方法
[0126]
取1重量份羟基酪醇苷作为原料药，加入9重量份糊精混合均匀，干燥，制成丸剂。
[0127]
制备例5含有羟基酪醇苷注射剂的制备方法
[0128]
取1重量羟基酪醇苷作为原料药，加入9重量份注射用水，过滤，灭菌，得注射剂。
[0129]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.羟基酪醇苷在制备抗衰老制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为d-半乳糖诱导的细胞衰老。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，羟基酪醇苷降低d-半乳糖诱导的细胞β-半乳糖苷酶活性。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，羟基酪醇苷减少d-半乳糖诱导的细胞氧化应激。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，羟基酪醇苷增加d-半乳糖诱导的细胞中还原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶含量。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，羟基酪醇苷增加d-半乳糖诱导的细胞三磷酸腺苷水平。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，羟基酪醇苷抑制d-半乳糖诱导的相关衰老相关分泌表型因子的表达。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，羟基酪醇苷激活ampk和nrf2信号通路，提高相关蛋白的表达水平。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，羟基酪醇苷的浓度为1μm～300μm；优选的，羟基酪醇苷的浓度为1μm～150μm。10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、注射制剂。

技术总结
本发明提出一种羟基酪醇苷在制备抗衰老制剂中的应用，属于生物医药技术领域。本发明提出的羟基酪醇苷在抗D-半乳糖诱导细胞衰老中的应用，通过实验发现，羟基酪醇苷可延缓D-半乳糖诱导的细胞衰老，表现为降低β-半乳糖苷酶活性，降低细胞氧化应激，增加细胞ATP水平，抑制相关SASP因子分泌，其机制与激活AMPK和Nrf2信号通路相关。和Nrf2信号通路相关。和Nrf2信号通路相关。


技术研发人员：袁其朋 孙新晓 郭扬 张博 韩永志 申晓林 王佳
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：2023.01.19
技术公布日：2023/8/14