北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用

北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测试剂盒，还涉及该试剂盒在检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用，本发明属于生物技术领域。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，prrsv)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸道疾病为主要特征的高度接触性传染疾病。起初prrsv归类于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，依据基因组的同源性及血清学差别可将prrsv分为2种基因型，即欧洲型(prrsv-1)和北美型(prrsv-2)，但随着研究的深入，发现这两种基因型毒株感染所致疫病的临床特征基本一致，但在基因组同源性、抗原性、毒力等方面存在明显的不同，核苷酸水平上的同源性差异最高达60.0％左右[nelson e a,christopher-hennings j,drew t,et al.differentiation of u.s.and european isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies[j].j clin microbiol,1993,31(12):3184-3189.]，随着近年来动脉炎病毒科中新的未被定义分类的病毒出现，国际病毒分类委员会(ictv)最新分类报告中已将prrsv-1和prrsv-2划分到β动脉炎病毒属(betaarterivirus)的两个不同亚属之中，并将种级名称分别命名betaarterivirus suid 1(prrsv-1)和betaarterivirus suid 2(prrsv-2)[ictv,expansion ofthe rank structure ofthe family arteriviridae and renaming its taxa[eb/ol].https://talk.ictvonline.org/taxonomy/p/taxonomy-history？taxnode_id＝202001833,2018.]，这意味着prrsv-1和prrsv-2正式被定义为两种不同的病原。因此对这两类不同病原的诊断、监测和防控要区分开来。
[0003]
在众多prrsv的抗体诊断方法中，酶联免疫吸附试验(elisa)操作简便快速，易于标准化和商品化，非常适合于大规模流行病学调查和监测，目前idexx或金诺研发的针对prrsv核衣壳蛋白(n蛋白)抗体的elisa检测方法在血清学诊断中应用最广，因为n蛋白属于高度保守的结构蛋白，具有良好的抗原性和免疫原性，在感染后最早7d可检到，且n蛋白抗体持续时间长，是诊断试剂研究的理想候选抗原。但这两种进口elisa试剂盒均以重组prrsv-1和prrsv-2的n蛋白为包被抗原，该类方法并不能区分prrsv-1或prrsv-2的n蛋白抗体，随着prrsv-1在我国的报道越来越多，prrsv-1与prrsv-2混合感染也时有发生，prrsv-1与prrsv-2流行的动态关系仍不是很清晰，为了真实评价我国猪群中prrsv-2的流行现状，亟需提出一种可特异性检测prrsv-2抗体的elisa方法。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种特异性针对prrsv-2n蛋白的单克隆抗体，并且提供一
种以该单克隆抗体为阻断抗体建立的一种特异性检测prrsv-2n蛋白抗体水平的阻断elisa(blocking-elisa，b-elisa)试剂盒，为我国prrsv-2的流行病学调查及抗体水平监测提供新的技术支持。
[0005]
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0006]
为了建立特异性检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv-2)n蛋白抗体的elisa方法，本发明以纯化的prrsv-2全病毒为包被抗原，筛选得到一株能够作为阻断抗体的抗prrsv-2毒株n蛋白单克隆抗体，经棋盘滴定法条件优化，建立了特异性检测prrsv-2毒株抗体的阻断elisa(b-elisa)方法。结果显示，b-elisa方法的最佳抗原包浓度为1200ng/孔，血清样本稀释度为1:2，酶标抗体最佳稀释度为1:6000。elisa结果判定标准：血清样本抑制率pi≥40％时判定为阳性，pi《40％判定为阴性。特异性试验显示，该方法仅能检测prrsv-2毒株，且与prv、pcv2、csfv、ppv、pedv、tgev、prrsv-1等猪病毒阳性血清无交叉反应；敏感性试验显示，该方法分别能检测出32倍稀释的14#阳性血清和256倍稀释的71#阳性血清，比idexx prrsv试剂盒具有相对高的敏感性；批内和批间重复性试验的变异系数均小于10％。对黑龙江地区收集的215份临床血清样品进行检测，并与商品化idexx prrsv试剂盒检测结果进行比较，两者的符合率为99.06％，kappa值为0.989，为高度符合。
[0007]
在本发明中，经过筛选获得了一株分泌北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2，prrsv-2)n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为1g5，分类命名为杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.45172，保藏日期为2022年8月10日。
[0008]
由所述的杂交瘤细胞株分泌北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒n蛋白的单克隆抗体也在本发明的保护范围之内。
[0009]
进一步的，本发明还提出了所述的单克隆抗体在制备检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体的试剂中的应用。
[0010]
其中，优选的，所述的检测试剂为阻断elisa抗体检测试剂。
[0011]
更进一步的，本发明还提出了一种北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测试剂盒，所述的试剂盒含有所述的单克隆抗体。
[0012]
其中，优选的，所述的单克隆抗体使用辣根过氧化物酶(hrp)进行标记。
[0013]
其中，优选的，所述的试剂盒中还包含北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒包被的酶标板。
[0014]
其中，优选的，所述的北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒包被浓度为1200ng/孔。
[0015]
其中，优选的，当血清样品的pi≥40％时，判定结果为阳性，当血清样品的pi＜40％时，判定为阴性，pi＝(1-od450nm被检血清/od450nm阴性血清)
×
100％。
[0016]
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
[0017]
1、本发明首先筛选得到了一株能够作为阻断抗体的单克隆抗体，实验中本发明发明人共筛选到七株针对n蛋白的单克隆抗体，利用间接elisa方法(包被prrsv全病毒)检测各株单抗的效价，结果显示，单抗1g5、3g8和4e3的标记效果较好，2e9其次，3g2、1d9和1g11最差(见表2和图2)，我们选择单抗1g5、3g8和4e3进行后续研究。我们选择od450nm在2.0附
近的各个单抗标记物对应的稀释倍数：1g5-hrp(6400
×
)、4e3-hrp(1600
×
)和3g8-hrp(12800
×
)；使用阻断elisa方法分别检测相同的阴阳性血清，比较不同n单抗之间检测血清的差异，结果显示，阳性血清(14#)对单抗1g5的抑制率最高，可达80％的抑制率。综合来看，单抗1g5效价最高，标记效果最好，稀释倍数最高，在成本上更低，且检测阴阳性血清的效果最好，具有独特性，表明并非任意n蛋白单克隆抗体都能够作为阻断抗体使用。
[0018]
2、本发明通过对反应条件进行优化，建立了一种北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测方法及其试剂盒。特异性试验显示，该方法仅能检测prrsv-2毒株，且与prv、pcv2、csfv、ppv、pedv、tgev、prrsv-1等猪病毒阳性血清无交叉反应；敏感性试验显示，该方法分别能检测出32倍稀释的14#阳性血清和256倍稀释的71#阳性血清，比idexx prrsv试剂盒具有相对高的敏感性；批内和批间重复性试验的变异系数均小于10％。与商品化idexx prrsv试剂盒检测结果进行比较，两者的符合率为99.06％，kappa值为0.989，为高度符合。
[0019]
3、本发明建立的b-elisa方法为prrsv-2的流行病学调查及抗体水平监测提供了新的技术手段。
附图说明
[0020]
图1为重组gst-sdhs53-n蛋白和抗prrsvn蛋白mab制备及鉴定结果；
[0021]
其中，a：重组gst-sdhs53-n蛋白的sds-page鉴定；
[0022]
b：重组gst-sdhs53-n蛋白和prrsvn蛋白mab的蛋白质印迹鉴定；
[0023]
a-1\b-1：含有由iptg诱导的pcold载体的bl21(de3)；a-2\b-2：在iptg诱导前含有pcold-sdhs53-n的bl21(de3)；a-3\b-3：iptg诱导后含有pcold-sdhs53-n的bl21(de3)；a-4\b-4：超声处理后含有pcold-sdhs53-n的bl21(de3)；a-5\b-5：bl21(de3)含有pcold-sdhs53-n超声后诱导沉淀；a6\b6：纯化的重组gst-sdhs53-n蛋白；
[0024]
c：纯化prrsvn蛋白mab的sds-page；1-2：纯化的prrsvn蛋白mab；m：蛋白marker；
[0025]
d：纯化prrsvn蛋白mab的western印迹鉴定结果；
[0026]
图2为7株n蛋白单抗hrp标记后elisa效价的测定结果；
[0027]
图3为3株n蛋白单抗阻断elisa效果；
[0028]
图4为roc曲线分析结果；
[0029]
其中，a：roc曲线分析结果；b：交互式点图分析结果；
[0030]
图5为b-elisa特异性试验结果；
[0031]
图6为b-elisa敏感性试验结果；
[0032]
其中，a:b-elisa；b:idexx elisa。
具体实施方式
[0033]
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明。
[0034]
实施例1特异性针对prrsv-2n蛋白的单克隆抗体的制备及北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测方法的建立
[0035]
1材料与方法
[0036]
1.1病毒和血清hun4-f112株由本实验室分离的hun4强毒在marc-145细胞连续传
代112次获得[tian zhi-jun,an tong-qing,zhou yan-jun,et al.an attenuated live vaccine based on highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus(hp-prrsv)protects piglets against hp-prrs[j].vet microbiol,2009,138(1-2):34-40.]。hun4-f112株的高免血清71#和14#(prrsv-2标准阳性血清)，spf猪血清(标准阴性血清)，174份idexx检测阴性和451份idexx检测阳性的临床血清、prrsv-1(dv株)阳性血清、猪瘟病毒(csfv)、猪细小病毒(ppv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)等猪常见病毒阳性血清以及prrsv-2nadc30-like株sdsh53、nadc34-like株dzd32猪阳性血清均由本实验室制备并保存；215份临床血清样品收集于自黑龙江省部分猪场；已纯化的prrsv-2全病毒抗原由本实验室制备和保存[李宛生.北美型prrsv竞争elisa抗体检测方法的建立及m蛋白表位缺失株构建[d].南阳师范学院,2019.]。
[0037]
1.2主要试剂辣根过氧化物酶(hrp，p6782)购自sigma公司；naio4和nabh4购自国药集团；酶标板稳定剂、样品稀释液购自湖州英创生物科技有限公司；二抗稀释液sz02购自surmodics公司；tmb显色液购自abm公司；elisa包被板购自costar公司；prrsvn蛋白抗体检测试剂盒购自北京爱德士(idexx)元亨生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
[0038]
1.3prrsv-2重组n蛋白的制备参考genbank中的prrsv-2sdhs53株(mh651744.1)，使用oligo 6.0分别设计引物(5
’→3’
)：
[0039]
sdhs53-f：catatggagctcggtaccctcgagatgccaaataacaacggcagacagc(seq id no.1)
[0040]
sdhs53-r：gagattacctatctagactgcaggtcgactcatgctgagggtgacgctgtg(seq id no.2)
[0041]
使用tianamp virus rnakit提取的sdhs53细胞毒基因组的反转录产物为模板，使用fastpfu fly dnapolymerase扩增n蛋白片段，使用lighting cloning kit利用同源重组法构建重组质粒pcold-gst-sdhs53-n，转化e.coli bl21(de3)感受态细胞，16℃低温诱导表达，富集菌液超声处理，sds-page检测上清表达后使用gst foocurose 4ff纯化重组蛋白，蛋白定量后并用sds-page检验蛋白表达及纯化效果，将纯化后的重组蛋白进行westernblot鉴定。
[0042]
1.4单克隆抗体(mab)的制备取重组prrsv-2n蛋白(100μg)与等体积弗氏完全佐剂乳化处理，对6周龄的雌性balb/c小鼠进行腹腔内免疫，间隔2周后，使用弗式不完全佐剂再免疫相同剂量的重组蛋白，免疫两次，第三次免疫后两周采血，对抗体效价最高的小鼠进行加强免疫。在加强免疫后三天，通过二氧化碳窒息对小鼠实施安乐死，然后使用50％聚乙二醇将小鼠脾细胞与sp2/0细胞融合，将融合细胞依次在含有hat和ht的选择性培养基中进行培养，使用间接免疫荧光测定法筛选杂交瘤细胞培养上清液中的抗体，筛选到分泌抗prrsv抗体的杂交瘤细胞系，通过有限稀释将其亚克隆至少3次。将筛选到的稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到已经用弗氏不完全佐剂预处理的balb/c小鼠的腹腔中。大约1周后，收集腹水，并使用金斯瑞protein g抗体纯化试剂盒从腹水中纯化单克隆抗体，sds-page检测纯化效果使用pierce rapid elisa mouse mab isotyping kit确定单克隆抗体的亚型；以sdhs53接种marc-145细胞，80％病变后收获细胞裂解上清，以未接毒细胞裂解上清作为空白对照(mock)，以纯化的mab(1:1000)为一抗，以dylighttm 800羊抗鼠igg(1:10000)为二
抗，经westernblot检测纯化的mab。
[0043]
1.5单克隆抗体的标记取5mg辣根过氧化物酶溶于5ml超纯水中，加入0.5ml 0.06m新配的naio44℃静置作用30min，加入0.5ml 0.16m的乙二醇室温避光作用30min；加入5ml纯化的mab混匀放于透析袋中，置于碳酸盐缓冲液中过夜4℃偷透析处理；次日，取出透析袋中样品，加入0.2ml 5mg/ml新配的nabh44℃静置作用2h；加入等体积的饱和硫酸铵(ph 7.2)4℃静置作用30min，10000rpm离心10min后弃上清，沉淀用适量0.02m磷酸盐缓冲液重悬，在磷酸盐缓冲液中过夜透析处理；次日，10000rpm离心5min后取上清定容到5ml，加入等体积的甘油混匀，分装保存于-80℃超低温冰箱。
[0044]
1.6阻断elisa(b-elisa)方法的建立及反应条件的优化纯化的灭活全病毒用碳酸盐包被液(ph 9.6)依次做连续稀释，以100μl孔的量加到elisa包被板上，每个稀释度至少两列，置于4℃过夜包被16h后弃去包被液，用pbst洗涤3次，加入300μl的酶标板稳定剂，37℃封闭1.5h，同样洗涤处理，以棋盘法先确定最佳抗原包被浓度及单克隆抗体标记物稀释浓度：使用样品稀释液将标准阴阳性血清二倍稀释，取100μl加到包被好的不同抗原稀释度的孔中，置于37℃温箱孵育30min，弃上清洗涤三次；用酶标二抗稀释液sz02将酶标单克隆抗体mab-hrp做连续稀释，每个稀释度取100μl加到包被不同抗原稀释度的孔中，37℃孵育30min，洗涤三次；每孔加入100μl的tmb底物显色液，37℃孵育15min，每孔加入50μl的2m h2so4终止液终止反应，酶标仪测定od450nm的读取结果，使用excel 2017软件统计分析，计算n/p值(n/p值＝阴性血清样品od
450nm
均值/阳性血清样品od
450nm
均值)，取n/p最大值所对应条件作为最佳抗原包被浓度和单克隆抗体标记物稀释度。按照上述确定条件，对最佳被检血清作用时间(30min、45min、60min)、酶标二抗作用时间(30min、45min、60min)、底物显色时间(5min、10min、15min)等条件进行优化。
[0045]
1.7阴阳临界值的确定174份idexx检测阴性血清和451份idexx检测阳性血清，按照优化后的b-elisa方法检测，测定od
450nm
后值按如下公式转换为pi，pi＝(1-od
450nm
被检血清/od
450nm
阴性血清)
×
100％，用medcalc v15.8软件进行roc曲线和交互式点图分析，确定临界值判定标准。
[0046]
1.8特异性试验按照优化的b-elisa条件检测prv、pcv2、csfv、ppv、pedv、tgev、prrsv-1(dv株)、prrsv-2代表株sdhs53株、dzd32株猪阳性血清，设立标准的prrsv-2阳性血清(hun4-f112株)和spf阴性血清作为阴阳性对照，根据临界值判定标准，计算上述血清样本检测结果的阴阳性，评估本方法的特异性。
[0047]
1.9敏感性试验使用样品稀释液将prrsv-2标准阳性血清(71#和14#)2倍倍比(1:2～1:2048)稀释，按优化的b-elisa条件进行检测，同时使用idexx prrsv试剂盒进行检测，比较二者的敏感性差异以评估本方法检测的敏感性。
[0048]
1.10重复性试验按照优化的b-elisa方法，从同一批次和不同批次包被的elisa板中各挑取3块，分别检测5份血清样本，每份样品各重复3次，进行批内及批间重复性试验，对结果进行统计学分析，评估本方法的重复性。
[0049]
1.11临床样品的检测用本发明建立的b-elisa检测方法和idexx间接elisa抗体检测试剂盒共同检测从黑龙江地区收集215份田间猪血清样品，对比分析二者的总体符合率，并计算kappa值，当0＜kappa＜0.41时，说明两种方法的一致性较差；当0.41＜kappa＜0.6，则说明两种方法具有中度一致性；若0.61＜kappa＜0.8说明两种方法具有高度一致性；若
0.81＜kappa＜1说明两种方法高度符合。
[0050]
2结果
[0051]
2.1重组prrsv n蛋白及抗prrsv n蛋白mab的制备及验证经低温诱导表达，sds-page结果显示，重组gst-sdhs53-n蛋白在超声处理后的菌液上清中可溶性表达，40ku左右有预期大小一致条带，gst foocurose 4ff亲和层析纯化后，有些许杂蛋白存在，纯化效果较好(图1a)，并且与纯化的mab有良好的反应性(图1b)；纯化后mab sds-page结果显示在25ku和55ku分别为抗体的轻链和重链，无杂带，纯化效果较好(图1c)，westernblot结果显示，在15ku左右有条带，与n蛋白预期大小一致(图1d)。
[0052]
2.2单克隆抗体的筛选我们共筛选到七株针对n蛋白的单克隆抗体，为了比较7株单抗的效价，我们将腹水用饱和硫酸铵纯化，最后用tris缓冲液透析，并调成统一浓度1mg/ml，利用间接elisa方法(包被prrsv全病毒)检测各株单抗的效价，结果显示，按照od450为1标准，各个单抗的效价高低依次为1g5和3g8》2e9和1d9》3g2》4e3》1g11(见表1)。使用过氧化物酶(hrp)标记，利用间接elisa方法(包被prrsv全病毒)检测标记效果，我们认为od450nm在2.0左右对应的标记物稀释倍数大于1:1000为标记效果较好，结果显示，单抗1g5、3g8和4e3的标记效果较好，2e9其次，3g2、1d9和1g11最差(见表2和图2)，我们选择单抗1g5、3g8和4e3进行后续研究。
[0053]
表1 7株n蛋白单抗elisa效价的测定
[0054][0055][0056]
表2 7株n蛋白单抗hrp标记后elisa效价的测定
[0057]
稀释倍数1g5-hrp2e9-hrp3g2-hrp4e3-hrp1d9-hrp3g8-hrp1g11-hrp1:1003.3042.9022.1203.0680.2153.1650.7311:2003.3092.7391.2893.0730.1163.1900.4101:4003.2462.1310.7112.9800.0823.1480.2351:8003.2331.3480.3802.6960.0663.1140.1441:16003.1080.7520.2132.0250.0563.1180.0961:32002.7890.4390.1351.1650.0543.0210.0761:64002.1500.2490.0960.6620.0522.8330.0641:128001.3280.1620.0820.3310.0532.3360.061
[0058]
我们选择od450nm在2.0附近的各个单抗标记物对应的稀释倍数：1g5-hrp(6400
×
)、4e3-hrp(1600
×
)和3g8-hrp(12800
×
)；使用阻断elisa方法分别检测相同的阴阳性血清，比较不同n单抗之间检测血清的差异，结果显示，阳性血清(14#)对单抗1g5的抑制率最高，可达80％的抑制率，而4e3的抑制率很低(40％)，3g8无抑制作用，说明单抗1g5与血清的阻断效果最好，更适用于阻断elisa方法的建立；而阴性血清(阴1、阴2、阴3)结果显示，单抗1g5的抑制率较低(10％以下)，而4e3单抗的抑制率稍高(图3)。
[0059]
综合来看，单抗1g5效价最高，标记效果最好，稀释倍数最高，在成本上更低，且检测阴阳性血清的效果最好，具有独特性，表明并非任意n蛋白单克隆抗体都能够作为阻断抗体使用。
[0060]
将分泌单抗1g5的杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.45172，保藏日期为2022年8月10日。
[0061]
2.3阻断elisa方法的建立及反应条件的确定经方阵滴定法优化b-elisa方法的最佳反应条件见表3。
[0062]
表3b-elisa检测方法反应条件优化
[0063][0064]
2.4阻断elisa临界值的确定按最终优化条件的b-elisa方法，检测174份idexx检测阴性血清和451份idexx检测阳性血清，medcalc v15.8软件分析结果显示，当敏感性为99.8％，特异性为96.0％时，其最优的cut-off值为40％(图4)。因此，当血清样品的pi≥40％时，判定结果为阳性，当血清样品的pi＜40％时，判定为阴性。
[0065]
2.5特异性试验结果利用该b-elisa方法检测prv、pcv2、pedv、ppv、csfv、tgev及prrsv-1(dv株)、高致病性株hun4-f112、nadc30-like株sdhs53、nadc34-like株dzd32猪阳性血清，结果显示，所有prrsv-2阳性血清抗体的pi值均高于临界值40％，检测结果为阳性，其它猪病毒阳性血清pi值均低于临界值(图5)，表明本研究建立的b-elisa方法具有较强的特异性。
[0066]
2.6敏感性试验结果利用该b-elisa方法检测2倍倍比稀释的prrsv-2标准阳性血清(71#和14#)，结果显示，b-elisa最高能检出32倍稀释的14#prrsv-2标准阳性血清和256倍稀释的71#prrsv-2标准阳性血清(图6a)，idexx试剂盒检测结果显示，最高能检出16倍稀释的14#prrsv-2标准阳性血清以及128倍稀释的71#prrsv-2标准阳性血清(图6b)。表明本研究建立的b-elisa方法比idexx prrsv试剂盒具有相对较高的敏感性。
[0067]
2.7重复性试验结果利用建立的b-elisa方法，进行批内和批间重复性试验，结果显示，批内和批间重复试验变异系数均小于10％(表4)，表明本方法具有较好的重复性。
[0068]
表4b-elisa方法批内和批间重复性实验(n＝5)
[0069][0070][0071]
2.8临床样品的检测对从黑龙江地区部分猪场采集的215份临床血清样本采用本b-elisa方法和商品化idexx prrsv抗体检测试剂盒同时检测，结果显示，b-elisa和idexx同时检出阳性196份，同时检出阴性17份，两者总体符合率为99.06％，kappa值为0.989(》0.81)，说明两种检测方法针对prrsv-2 n蛋白抗体的检测几乎完全一致(表5)。
[0072]
表5b-elisa与idexx商品化试剂盒检测结果的比较
[0073]

技术特征：
1.一株分泌北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2，prrsv-2)n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.45172，保藏日期为2022年8月10日。2.北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒n蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌。3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体的试剂中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂为阻断elisa抗体检测试剂。5.一种北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。6.如权利要求5所述的北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的单克隆抗体使用辣根过氧化物酶(hrp)进行标记。7.如权利要求6所述的北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒包被的酶标板。8.如权利要求7所述的北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒包被浓度为1200ng/孔。9.如权利要求5-8任一项所述的北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，当血清样品的pi≥40％时，判定结果为阳性，当血清样品的pi＜40％时，判定为阴性，pi＝(1-od450nm被检血清/od450nm阴性血清)
×
100％。

技术总结
本发明公开了一种北美型猪繁殖与呼吸综合征阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用。所述的试剂盒中含有特异性抗北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.45172的杂交瘤细胞株分泌产生。特异性试验显示，该试剂盒仅能检测PRRSV-2毒株，且与PRV、PCV2、CSFV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV-1等猪病毒阳性血清无交叉反应；敏感性试验显示，该试剂盒比IDEXX PRRSV试剂盒具有更高的敏感性。并且批内和批间重复性试验的变异系数均小于10％，与商品化IDEXX PRRSV试剂盒的检测结果高度符合。本发明建立的阻断ELISA抗体检测试剂盒及其方法为PRRSV-2的流行病学调查及抗体水平监测提供了新的技术手段。段。


技术研发人员：田志军 王倩
受保护的技术使用者：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
技术研发日：2022.09.16
技术公布日：2023/8/14