烟草植物及烟草制品的制作方法

1.本发明涉及烟草植物及其制备方法、以及烟草制品等。


背景技术：

2.烟草特有亚硝胺(tsna)主要是烟叶在干燥时生成的烟草生物碱的亚硝基化产物。烟草植物在叶中蓄积高水平的游离硝酸盐，其与tsna的生成相关。可以认为，与烟叶在干燥时的tsna生成直接相关的物质是亚硝酸盐。烟草植物的叶中蓄积的游离硝酸盐通过烟草所具有的硝酸还原酶(nr)而被转变为亚硝酸盐，但由于亚硝酸盐具有细胞毒性而会被快速代谢，因此通常植物组织中包含的内源性的亚硝酸盐的量非常少。与烟叶在干燥时的tsna生成相关的亚硝酸盐的大部分可以认为是通过生存在叶面的微生物由硝酸盐产生的。即，在烟叶的干燥工序中，随着叶的组织被分解，叶中蓄积的硝酸盐溶出，通过生存在叶面的微生物所具有的硝酸还原酶(nr)而被转变为亚硝酸盐。
3.硝酸还原酶是催化将植物内的硝态氮还原成有机形态的最初步骤的酶，通过转录、翻译、翻译后的水平进行调节。暗处环境通过磷酸化和随后的14-3-3蛋白质的结合而将硝酸还原酶失活(lillo et al.2004)。
4.the plant cell,8(1996),505-517(非专利文献1)使用合成肽，公开了菠菜的硝酸还原酶的ser543为翻译后调节相关联的磷酸化部位，调查了其周边的氨基酸残基的置换对与nr激酶的亲和性造成的影响。其中，表明从ser543起负3位的精氨酸残基(r540)或负5位的亮氨酸(l538)向丙氨酸的变更会显著损害与nr激酶的亲和性。另一方面，表明负4位的赖氨酸(k539)、正2位的脯氨酸(p545)及正4位的甲硫氨酸(m547)向丙氨酸的变更不会对与nr激酶的亲和性造成很大的影响。另外，非专利文献1的图8示出了在硝酸还原酶中与植物种类无关而高度保守的控制性磷酸化部位，在烟草nia2中523位的丝氨酸与其相当。
5.plant physiology.,140(2006),1085-1094(非专利文献2)记载了在烟草植物nicotiana plumbaginifolia e23突变体中导入将nia2的521位的丝氨酸转变为天冬氨酸的硝酸还原酶(s521d-nr)基因，并在camv 35s启动子下使其过度表达，其结果是，导入了s521d-nr基因的植物(s521d品系)不论昼夜而稳定地保持高的硝酸还原酶活性，个体的硝酸含量不论昼夜而基本恒定且以低的水平推移。plant j.,35(2003),566-573(非专利文献3)与非专利文献2有一部分共同的作者，记载了烟草的s521d-nr构建物的制备和s521d-nr导入烟草。
6.需要说明的是，如果仔细考虑非专利文献1的记载，则可知非专利文献2及3的“s521d”为“s523d”的误记。
7.wo2016/046288(专利文献1)(相当于日本特表2017-529850)记载了具有由烟草植物生成的烟草特有亚硝胺(tsna)减少了的烟草制品。上述烟草植物包含：
8.(i)包含编码去调节的硝酸还原酶的序列、由编码去调节的硝酸还原酶的序列构成、或实质上由编码去调节的硝酸还原酶的序列构成的多核苷酸；
9.(ii)由(i)中记载的上述多核苷酸编码的多肽；
10.(iii)包含去调节的硝酸还原酶、由去调节的硝酸还原酶构成、或实质上由去调节的硝酸还原酶构成的多肽；或者
11.(iv)包含(i)中记载的上述多核苷酸的构筑体、载体或表达载体，
12.上述硝酸还原酶的表达或活性与对照未经修饰烟草植物相比去调节，且去调节的硝酸还原酶被修饰成：
13.(a)在与序列号4的位置523相应的位置包含氨基酸取代的硝酸还原酶多肽；或者
14.(b)在与序列号4的位置523相应的位置包含氨基酸取代的硝酸还原酶多肽，其中序列号4的位置523的氨基酸取代成天冬氨酸。
15.在专利文献1的实施例中，对于烟草的硝酸还原酶基因(nia2)的s523d突变体，公开了s523d突变体的叶中硝酸量降低的数据及干叶及烟中的tsna降低的数据。该文献的实施例的s523d突变体通过35s启动子而使s523d突变型nia2组成型表达。
16.wo2020/141062(专利文献2)没有记载烟草的硝酸还原酶蛋白的527位的甲硫氨酸残基被置换为其它氨基酸残基的突变体。在专利文献2的实施例中，对于烟草的硝酸还原酶基因(nia2)的m527i突变体(仅纯合型)，记载了叶中硝酸量降低。
17.现有技术文献
18.专利文献
19.专利文献1：wo2016/046288
20.专利文献2：wo2020/141062
21.非专利文献
22.非专利文献1：the plant cell,8(1996),505-517
23.非专利文献2：plant physiology.,140(2006),1085-1094
24.非专利文献3：plant j.,35(2003),566-573
25.非专利文献4：planta 219(2004),59-65
26.非专利文献5：平成23年日本植物病理学会大会p258、(226)烟草突变体基因组合(panel)的制备


技术实现要素：

27.发明要解决的课题
28.非专利文献2、3及专利文献1的s523d重组体通过35s启动子而使具有氨基酸置换突变的nia2基因组成型表达。本技术人进行了确认，结果是明确了该基因重组体伴随严重的生长发育不良。另外，在专利文献2中记载了可以认为由于通过将m527突变为i而易于磷酸化，因此nr活性降低。需要说明的是，尽管如此，也没有说明含有硝酸量降低的原因。另外，没有公开杂合具有突变的杂合体。而且，关于nia1基因，在任意的现有技术文献中均未得到突变体(mutant)、基因修饰体(gene-modified variant)、基因重组体(gene recombinant)。
29.烟草植物的硝酸还原酶蛋白的脯氨酸525(p525)位于从磷酸化部位的丝氨酸523(s523)起正2位。已知该脯氨酸在植物中广泛保守(非专利文献1的图8)，但表明该脯氨酸向丙氨酸的变更对基于nr激酶的识别没有很大影响(非专利文献1的表3)。
30.然而，本发明人等在烟草植物中大量制备了2种硝酸还原酶nia1、nia2发生了突变
的突变体，其中发现，包含与该硝酸还原酶蛋白的氨基酸序列的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶的烟草植物具有如下优异的性质：(a)即使在黑暗条件下硝酸还原酶的活性也不易降低、(b)对照与个体的生长实质上等同、以及(c)硝酸比对照有所降低，从而想到了本发明。
31.解决课题的方法
32.本发明包含以下的方式，但并没有限定。
33.[方式1]
[0034]
一种烟草植物，其包含硝酸还原酶，该硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基。
[0035]
[方式2]
[0036]
根据方式1所述的烟草植物，其具有以下的(a)-(c)中1种以上的性质：
[0037]
(a)黑暗条件下的硝酸还原酶的活性为明亮条件下的硝酸还原酶的活性的80％以上、
[0038]
(b)对照与个体的生长实质上等同、和/或
[0039]
(c)硝酸比对照有所降低，
[0040]
其中，对照包含含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶。
[0041]
[方式3]
[0042]
根据方式1或2所述的烟草植物，其包含硝酸还原酶，该硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为亮氨酸或丝氨酸。
[0043]
[方式4]
[0044]
根据方式1～3中任一项所述的烟草植物，其中，在上述发生了突变的硝酸还原酶的氨基酸序列中，与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的523位相应的氨基酸残基为丝氨酸。
[0045]
[方式5]
[0046]
根据方式1～4中任一项所述的烟草植物，其中，上述发生了突变的硝酸还原酶具有与序列号2或4的氨基酸序列80％以上同一的氨基酸序列。
[0047]
[方式6]
[0048]
根据方式1～5中任一项所述的烟草植物，其中，上述发生了突变的硝酸还原酶具有相当于序列号5～8中任一者的氨基酸序列。
[0049]
[方式7]
[0050]
根据方式2～6中任一项所述的烟草植物，其中，与对照相比，硝酸至少减少了10％。
[0051]
[方式8]
[0052]
根据方式1～7中任一项所述的烟草植物，其为突变体或基因修饰体。
[0053]
[方式9]
[0054]
根据方式1～8中任一项所述的烟草植物，其中，上述烟草植物为红花烟草(nicotiana tabacum)。
[0055]
[方式10]
[0056]
方式1～9中任一项所述的烟草植物的制备方法，该方法包括：
[0057]
(i)将烟草植物的硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸改变为脯氨酸以外的氨基酸残基；或者
[0058]
(ii)选择通过突变硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的烟草植物。
[0059]
[方式11]
[0060]
一种烟叶，其是由方式1～9中任一项所述的烟草植物收获而得到的。
[0061]
[方式12]
[0062]
一种干燥叶，其是由方式11所述的烟叶制成的。
[0063]
[方式13]
[0064]
去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒、或提取物，其是由方式12所述的干燥叶制造的。
[0065]
[方式14]
[0066]
一种烟草制品，其包含方式12所述的干燥叶、和/或方式13所述的去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒或提取物。
[0067]
发明的效果
[0068]
本发明的修饰烟草植物降低了叶中的硝酸盐蓄积量。通过利用本发明的修饰烟草植物，能够减少烟草原料、烟草制品的tsna。本发明的修饰烟草植物不仅叶中硝酸量降低，而且优选植物体的生长也良好。这对于作为用于制造烟草制品的烟叶的材料而利用也是显著优异的效果。
附图说明
[0069]
[图1]图1是示出了使具有s523d突变的nia2(nia2_s523d)、野生型的nia2(nia2_wt)组成型表达的叶(叶片)中的硝酸量的图。s523d-16和s523-20是来自不同的t0个体的t1代的2个品系。wt-4、wt-13、wt-22是来自不同的t0个体的t1代的3个品系。s523d-null、wt-null分别为转化了nia2_s523d、nia2_wt的重组体，是不表达nia2_s523d、nia2_wt的t1代的品系的叶的结果。重复数为3，误差条为标准偏差。
[0070]
[图2]图2是从移植起约3周后的植物体的照片。s523d-16：使具有s523d突变的nia2(nia2_s523d)组成型表达的植物体，t1代；s523d-20：使具有s523d突变的nia2(nia2_s523d)组成型表达的植物体，t1代；wt-13：进行野生型的nia2(nia2_wt)的组成型表达的植物体，t1代；wt-22：进行野生型的nia2(nia2_wt)的组成型表达的植物体，t1代；s523d-null、wt-null：nia2_s523d、nia2_wt均不表达的植物体、t1代
[0071]
[图3]图3是s523d-16重组体(使具有s523d突变的nia2(nia2_s523d)组成型表达的植物体)、以及null(不表达nia2_s523d的分离品系、t2代)的初期生长(假植第11天)的照片图。
[0072]
[图4]图4是nia2_s523d组成型表达重组体、野生型的sr-1、以及nia2_wt组成型表达重组体(wt-13)的暗处亚硝酸溶出试验的结果。s523d-16和s523d-20是来自不同的t0个体的t1代的不同的2个品系。重复数为4，误差条为标准偏差。
[0073]
[图5]图5是对nia2_s523d组成型表达重组体、野生型的sr-1、wt-13及nia2_wt组成型表达重组体(wt-13)在明亮条件(l)(左)、黑暗条件(d)(右)下的硝酸还原酶的活性(nr活性)试验的活性化率进行分析而得到的结果。s523d-16和s523d-20是来自不同的t0个体
的t1代的不同的2个品系。重复数为4，误差条为标准偏差。
[0074]
[图6]图6是对于实施例1中制备的在nia1或nia2的铰链1区域具有错义置换突变的ems突变体，将m2或m3代的各品系进行液肥栽培，对烟叶(叶片)中的硝酸量进行调查而得到的结果。在各代中以野生型烟草的tsukuba 1号作为对照，分析了突变为纯合型的个体。重复数为3或4，误差条为标准偏差。
[0075]
[图7a]图7是对于实施例1中制备的在nia1或nia2的铰链1区域具有错义置换突变的ems突变体，将m2或m3代的各品系进行液肥栽培，对烟叶(叶片)中的硝酸量进行调查而得到的结果。在各代中以不具有突变分离的突变的wt个体作为对照，分析了突变为纯合型或杂合型的个体。重复数为3或4，误差条为标准偏差，＊表示相对于对照具有显著差异。
[0076]
[图7b]图7是对于实施例1中制备的在nia1或nia2的铰链1区域具有错义置换突变的ems突变体，将m2或m3代的各品系进行液肥栽培，对烟叶(叶片)中的硝酸量进行调查而得到的结果。在各代中以不具有突变分离的突变的wt个体作为对照，分析了突变为纯合型或杂合型的个体。重复数为3或4，误差条为标准偏差，＊表示相对于对照具有显著差异。
[0077]
[图8]图8是对于实施例1中制备的在nia2的铰链1区域具有错义置换突变的ems突变体，将m3代的各品系进行液肥栽培，对烟叶(叶片)中的硝酸量进行调查而得到的结果。在m3代中以野生型烟草的tsukuba 1号作为对照，分析了突变为纯合型的个体。重复数为4，误差条为标准偏差。
[0078]
[图9]图9是对nia1_p525l、nia1_p525s(m2代)的硝酸还原酶的活性(nr活性)在明亮条件(light)(左)、黑暗条件(dark)(右)下的活性化率进行分析而得到的试验的结果。在m2代中以不具有突变分离的突变的wt个体作为对照，分析了突变为纯合型、杂合型的个体。重复数为3或2，误差条为标准偏差。
[0079]
[图10]图10是nia1_p525l、nia1_p525s(m3代)的暗处亚硝酸溶出试验的结果。在m3代中以不具有突变分离的突变的wt个体作为对照，分析了突变为纯合型的个体。重复数为4，误差条为标准偏差，＊＊表示相对于对照具有显著差异。
[0080]
[图11]图11是对于nia1_p525l、nia1_p525s，将m3代的各品系进行液肥栽培，对烟叶(叶片)中的硝酸量进行调查而得到的结果。在m3代中以不具有突变分离的突变的wt个体作为对照，分析了突变为纯合型、杂合型的个体。重复数为4，误差条为标准偏差，＊表示相对于对照具有显著差异。
[0081]
[图12]图12是nia1_p525l、nia1_p525s的m3代各品系从移植起第16天后的植物体的照片。在m3代中以不具有突变分离的突变的wt个体作为对照，示出了突变为纯合型、杂合型的个体。
[0082]
[图13]图13是对p525l突变、p525s突变的纯合型个体或杂合型个体、对照的不具有突变的wt个体的干叶中的硝态氮浓度进行调查而得到的结果。对于重复数而言，p525l的wt为6，杂合为7，纯合为5，p525s的wt为4，杂合为6，纯合为2。误差条为标准偏差(se)。
[0083]
[图14]图14是tn90的s523d-oe、s523d-null、wt-oe、wt-null的t1代的品系在移植8天后的植物体的照片。
[0084]
[图15]图15是对于tn90的s523d-oe、s523d-null、wt-oe、wt-null的t1代的品系调查了地上叶数而得到的结果。重复数为4，基于t检验的显著差异：＊＊p＜0.01，误差条为标准偏差(sd)。
[0085]
[图16]图16是对于tn90的s523d-oe、s523d-null、wt-oe、wt-null的t1代的品系调查了株高而得到的结果。重复数为4，基于t检验的显著差异：＊＊p＜0.01，误差条为标准偏差(sd)。
[0086]
[图17]图17是对于tn90的s523d-oe、s523d-null、wt-oe、wt-null的t1代的品系调查了地上叶干重(biomass)而得到的结果。重复数为4，基于t检验的显著差异：＊＊p＜0.01，误差条为标准偏差(sd)。
[0087]
[图18]图18是对于tsukuba 1号的s523d-oe、s523d-null、p525l-homo、p525s-homo的t1代的品系调查了地上叶数而得到的结果。重复数为9(s523d-oe、null)或6(p525s、p525l)，基于t检验的显著差异：＊＊p＜0.01，误差条为标准偏差(sd)。
[0088]
[图19]图19是对于tsukuba 1号的s523d-oe、s523d-null、p525l-homo、p525s-homo的t1代的品系调查了株高而得到的结果。重复数为9(s523d-oe、null)或6(p525s、p525l)，基于t检验的显著差异：＊＊p＜0.01，误差条为标准偏差(sd)。
[0089]
[图20]图20是对于tsukuba 1号的s523d-oe、s523d-null、p525l-homo、p525s-homo的t1代的品系调查了地上叶干重(biomass)而得到的结果。重复数为9(s523d-oe、null)或6(p525s、p525l)，基于t检验的显著差异：＊＊p＜0.01，误差条为标准偏差(sd)。
[0090]
[图21]图21是示出了tsukuba 1号的s523d-oe、s523d-null的t1代的品系在播种92天后的开花期的照片。均为同时播种。左侧是s523d-oe，为开花13天前的状态，右侧是s523d-null，为开花6天后的状态。
[0091]
[图22a]图22a示出了在田地中栽培的p525l突变体、p525s突变体(bc2f3代)的干叶中尼古丁量的相对值(％)。分别为将wt的干叶中尼古丁浓度的平均值设为100％时的相对值。重复数为20(仅p525l的homo为19)，基于t检验的显著差异：＊＊p＜0.01，误差条为标准偏差。
[0092]
[图22b]图22b示出了在田地中栽培的p525l突变体、p525s突变体(bc2f3代)的干叶中tsnas的相对值(％)。分别为将wt的干叶中tsnas浓度的平均值设为100％时的相对值。重复数为20(仅p525l的homo为19)，基于t检验的显著差异：＊＊p＜0.01，误差条为标准偏差。tsnas为4种tsna(nnn、nat、nab、nnk)的合计值。
具体实施方式
[0093]
本发明非限定性地包含以下方式。在本说明书中，只要没有特别说明，本说明书中使用的技术及科学用语具有本领域技术人员通常理解的含义。本说明书中公开的物质、材料及例子仅为示例，并不进行限制。在本说明书中，提及“在一个方式中”的情况下，意味着并不限定于该方式，即，是非限定的。
[0094]
1.烟草植物
[0095]
在一个方式中，本发明涉及烟草植物。本发明的烟草植物包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶(以下，有时称为“突变的硝酸还原酶”)。
[0096]“烟草植物”是指茄科烟草属(nicotina)的植物，可以列举例如：无茎烟草(nicotiana acaulis)、渐尖叶烟草(nicotiana acuminata)、渐尖叶烟草多花型变种(nicotiana acuminata var.multzjlora)、非洲烟草(nicotiana africana)、花烟草
tabacum)具有被称为nia1和nia2的2个具有高度同源性的氮代谢酶基因。在一个方式中，本说明书中的硝酸还原酶包含nia1蛋白(nia1基因来自于t基因组)及其突变体、和/或nia2蛋白(nia2基因来自于s基因组)及其突变体。在一个方式中，本说明书中的硝酸还原酶包含nia1蛋白(nia1基因来自于t基因组)及其突变体。
[0100]
nia1基因及nia2基因分别具有序列号1、3的碱基序列。nia1蛋白、nia2蛋白分别具有由序列号1、3的碱基序列编码的序列号2及4的氨基酸序列。
[0101]
本发明的烟草植物包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶。在本说明书中，在没有特别说明的情况下，“包含硝酸还原酶”是指包含硝酸还原酶蛋白、或者包含编码硝酸还原酶蛋白的核酸。相当于序列号2或4的氨基酸序列的518-528的氨基酸序列为“lkksistpfmn”。红花烟草以外的植物的硝酸还原酶蛋白也包含具有与相当于序列号2或4的氨基酸序列的518-528的氨基酸序列“lkksistpfmn”相同的氨基酸序列的部位。该部位可以包含一些突变，例如，非专利文献1的表8中记载了在相当于序列号2或4的氨基酸序列的518-528中具有各植物的硝酸还原酶蛋白“lk(k/r)(s/t)(i/v/t/a)s(t/s)pfmn”的氨基酸序列。“与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基”例如为接着硝酸还原酶蛋白的野生型的s-(t/s)的氨基酸残基、并且是连接于f-m的氨基酸残基，在野生型的硝酸还原酶蛋白中为脯氨酸。
[0102]
对于本发明的烟草植物而言，野生型的硝酸还原酶的蛋白质中的525位的脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基。硝酸还原酶基因的突变可以为杂合型，也可以为纯合型。另外，在硝酸还原酶蛋白存在nia1蛋白、nia2蛋白这2种的情况下，突变可以为nia1蛋白、nia2蛋白中的任一者。
[0103]
在一个方式中，烟草植物包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为亮氨酸或丝氨酸的硝酸还原酶。
[0104]
在一个方式中，在突变的硝酸还原酶的氨基酸序列中，与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的523位相应的氨基酸残基为丝氨酸。这是指该位置的氨基酸残基没有从野生型的硝酸还原酶发生突变(包含未修饰)。
[0105]
在一个方式中，在突变的硝酸还原酶的氨基酸序列中，与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的527位相应的氨基酸残基为甲硫氨酸。这是指该位置的氨基酸残基没有从野生型的硝酸还原酶发生突变(包含未修饰)。
[0106]
只要满足如下的条件，则可以为与序列号2或4相比具有一些多样性(突变)的突变体，所述条件为：本发明的突变的硝酸还原酶的氨基酸序列是与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶，并且优选为在硝酸还原酶的氨基酸序列中与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的523位相应的氨基酸残基为丝氨酸。
[0107]
在一个方式中，上述发生了突变的硝酸还原酶为具有与序列号2或4的氨基酸序列80％以上同一的氨基酸序列。优选与序列号2或4的氨基酸序列82％以上同一、85％以上同一、88％以上同一、90％以上同一、92％以上同一、95％以上同一、97％以上同一、98％以上同一、99％以上同一。在任意情况下，均具备与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基这样的条件。
[0108]
在一个方式中，上述发生了突变的硝酸还原酶由具有与相当于序列号1或3的碱基序列80％以上同一的碱基序列的核酸所编码。优选由具有与相当于序列号1或3的碱基序列82％以上同一、85％以上同一、88％以上同一、90％以上同一、92％以上同一、95％以上同一、97％以上同一、98％以上同一、99％以上同一的碱基序列的核酸所编码。在任意情况下，均具备与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基这样的条件。
[0109]
在本说明书中，2个氨基酸序列的同一性％可以通过视觉检查和数学计算来确定。另外，也可以使用计算机程序来确定同一性％。作为这样的计算机程序，可以举出例如blast及clustalw等。特别是基于blast程序的同一性检索的各种条件(参数)记载于altschul等的(nucl.acids.res.,25,p.3389-3402,1997)，因此，可以从ncbi、dna data bank of japan(ddbj)的网站公开获取(blast手册、altschul等ncb/nlm/nih bethesda,md20894；altschul等)。另外，也可以使用遗传信息处理软件genetyx ver.7(genetyx)、dnasis pro(日立软件)、vector nti(infomax)等程序而确定。
[0110]
在本说明书中，2个碱基序列的同一性％可以通过视觉检查和数学计算来确定。另外，也可以使用计算机程序来确定同一性％。作为这样的序列比较计算机程序，可以举出例如由美国国家医学图书馆的网站：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi可以利用的blastn程序(altschul et al.(1990)j.mol.biol.215:p.403-10)：版本2.2.7、或者wu-blast2.0算法等。对于wu-blast2.0的标准默认参数的设定可以使用以下的网站：http://blast.wustl.edu所记载的参数。
[0111]
在一个方式中，上述发生了突变的硝酸还原酶可以具有在序列号2或4的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列。其中，硝酸还原酶具备与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基这样的条件。
[0112]“缺失、置换、插入或添加了1个或数个氨基酸”这样的情况是指，在作为对象的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生了缺失、或被置换为其它氨基酸、或插入了其它氨基酸、和/或添加了其它氨基酸的氨基酸序列。“数个氨基酸”非限定性地指200个以内、100个以内、50个以内、30个以内、20个以内、15个以内、12个以内、10个以内、8个以内、6个以内、4个以内、3个以内、2个以内的氨基酸。或者，数个氨基酸是指相对于氨基酸序列的全长为30％、优选为25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％或1％的氨基酸。
[0113]
在上述当中，置换优选为保守性置换。保守性置换是指以具有类似的物理化学特征的残基来替换特定的氨基酸残基，但只要不使与原序列的结构相关的特征发生实质上变化，则可以为任意的置换，例如，只要置换氨基酸不破坏原序列中存在的螺旋、不破坏表征原序列的其它种类的二级结构，则可以为任意的置换。以下，对于氨基酸残基的保守性置换，按照可置换的残基分类进行示例，但可置换的氨基酸残基并不限于以下的记载。
[0114]
a组：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸
[0115]
b组：天冬氨酸、谷氨酸
[0116]
c组：天冬酰胺、谷氨酰胺
[0117]
d组：赖氨酸、精氨酸
[0118]
e组：丝氨酸、苏氨酸
[0119]
f组：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸
[0120]
在非保守性置换的情况下，在上述种类中，可以将某1个成员与其它种类的成员进行交换。例如，为了排除意外的糖链修饰，可以将上述b、d、e组的氨基酸置换为除此以外的组的氨基酸。或者，为了防止在三级结构中被折叠于蛋白质中，可以使半胱氨酸缺失、或置换为其它氨基酸。或者，为了确保亲水性/疏水性的平衡、或为了易于合成而提高亲水度，可以考虑作为与氨基酸相关的疏水性/亲水性的指标的氨基酸的亲水指数(hydropathy index)(j.kyte及r.doolittle,j.mol.biol.,vol.157,p.105-132,1982)而对氨基酸进行置换。
[0121]
作为其它方式，可以进行：向比原氨基酸立体位阻小的氨基酸的置换、例如从f组向a、b、c、d、e组的置换；从具有电荷的氨基酸向不具有电荷的氨基酸的置换、例如从b组向c组的置换。
[0122]
在一个方式中，上述发生了突变的硝酸还原酶具有相当于序列号5-8中任一者的氨基酸序列。序列号5及6分别为与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为亮氨酸的氨基酸序列。序列号7及8分别为与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为丝氨酸的氨基酸序列。
[0123]
在一个方式中，上述烟草植物为突变体或基因修饰体。
[0124]
在本说明书中，“突变体”是由天然或人工产生的随机的突变所形成的烟草植物的修饰体。制备突变体的方法在以下的“3.烟草植物的制备方法”中详细说明。另外，突变体可以是从以突变体作为一个亲本与烟草植物交配而成的后代中选择具有编码如下硝酸还原酶蛋白者而得到的烟草植物或其后代，所述硝酸还原酶蛋白的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基，但并不限定于此。
[0125]“基因修饰体”为修饰了编码硝酸还原酶蛋白的内源性基因、使得烟草植物表达与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶蛋白的烟草植物，包括其后代。
[0126]“突变体”及“基因修饰体”不仅可以包括烟草植物的成熟体、整体，还可以包括其部分。上述部分非限定性地选自叶(包含叶身和叶柄)、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、分裂组织、子叶、胚轴、中柱鞘、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、芽、细胞、以及原生质体。
[0127]
另外，在一个方式中，上述烟草植物可以为通过人工操作从外部导入了编码硝酸还原酶蛋白的核酸、以便表达与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶蛋白的基因重组体及其后代。编码该蛋白的核酸优选能够稳定地整合至基因组内，以便传递给后代，但并不限定于此。
[0128]
2.烟草植物的性质
[0129]
本发明的烟草植物非限定性地具有以下的(a)-(c)中1种以上的性质：
[0130]
(a)黑暗条件下的硝酸还原酶的活性为明亮条件下的硝酸还原酶的活性的80％以上、
[0131]
(b)对照与个体的生长实质上等同、和/或
[0132]
(c)硝酸比对照有所降低。
[0133]
这里，对照是包含含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶的烟草植物。含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶是野生型烟草植物所具有的硝酸还原酶，未经任何修饰。在一个方式中，对照可以为包含含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶的红花烟草，优选可以为野生型的红花烟草。野生型的红花烟草包含含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶，其表达、活性均未经任何修饰。
[0134]
在一个方式中，本发明的烟草植物具有(a)-(c)中2种以上的性质、或全部3种性质。
[0135]“硝酸还原酶的活性”例如非限定性地可以通过本说明书的比较例2的(5)“nr酶活性”中记载的方法进行测定。例如，将采集到的烟草植物的叶(叶片)的组织冷冻干燥，制备粗提取液。向该粗提取液加入nr活性测定缓冲液使其反应，进行反应液中生成的亚硝酸量的测定。
[0136]
此外，“硝酸还原酶的活性”还可以通过以下方法进行测定：使用0.5mm铁氰化钾和0.1mm nadh测定340nm的吸光度来代替对亚硝酸进行定量的方法；使用还原型甲基紫精、溴酚蓝测定其氧化的方法等。
[0137]
即，在本说明书中，“硝酸还原酶的活性”可以是通过上述手法、方法对作为对象的烟草植物的组织进行测定而得到的活性，但并不限定于此。
[0138]
黑暗条件非限定性地指在光无法到达的条件(例如，1勒克斯以下、优选为0.1勒克斯以下的照度)下放置30分钟以上、60分钟以上、90分钟以上、120分钟以上。与此相对，明亮条件是指在光到达的条件(例如，5000勒克斯以上、优选为10000勒克斯以上)下放置30分钟以上、60分钟以上、90分钟以上、120分钟以上。
[0139]“黑暗条件下的硝酸还原酶的活性为明亮条件下的硝酸还原酶的活性的80％以上”是指，黑暗条件下的硝酸还原酶的活性为除光条件以外以相同的条件通过相同的方法测得的明亮条件下的硝酸还原酶的活性的80％以上。非限定性地优选黑暗条件下的硝酸还原酶的活性为明亮条件下的硝酸还原酶的活性的85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上。在一个方式中，与明亮条件下的硝酸还原酶的活性相比，黑暗条件下的硝酸还原酶的活性实质上没有降低，即，实质上相同。在一个方式中，黑暗条件下的硝酸还原酶的活性与明亮条件下的硝酸还原酶的活性相同。对于包含含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶的烟草植物(对照)而言，与明亮条件相比，在黑暗条件下硝酸还原酶的活性受到抑制。与此相对，对于包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶的烟草植物而言，在黑暗条件下，硝酸还原酶的活性也与明亮条件同样，硝酸还原酶的活性未被抑制或不易被抑制。在一个方式中，关于硝酸还原酶基因的突变，不仅是突变型纯合体，而且突变型杂合体的黑暗条件下的硝酸还原酶的活性也不易降低。
[0140]
在一个方式中，上述烟草植物包含含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶，作为烟草植物的对照与个体的生长实质上为同等水平。
[0141]
如本说明书的比较例2所示，在野生型的nia2_wt中，无论有无组成型表达，在生长方面没有观察到很大差异。专利文献1中记载的nia2_s523d组成型表达的基因重组烟草显示出个体尺寸变小的矮化性(图3)。在实施例6中，组成型表达nia2_s523d的品系与不表达的品系相比，观察到显著的生长不良，而且开花期也晚。
[0142]
与此相对，对于包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶的烟草植物而言，作为包含含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶的烟草植物的对照与个体的生长实质上等同。在实施例6中，nia1的p525l、p525s的氨基酸置换突变为纯合型的品系也未观察到生长的异常。
[0143]“个体的生长实质上等同”是指，植物体的高度、叶的数量、叶的大小等、个体的尺寸(生长)、质量(mass)(例如，地上叶干重(biomass))、以及开花的时期等实质上为相同程度。非限定性地，例如在对高度进行比较时，其差为20％以内、15％以内、10％以内、5％以内。
[0144]
在一个方式中，与对照相比，上述烟草植物含有的硝酸的量减少。硝酸非限定性地可以通过例如本说明书的比较例2的(2)硝酸定量中记载的方法进行测定。例如，可以使由烟草植物采集到的叶干燥，用水提取后，将过滤得到的滤液作为测定试样。
[0145]
在一个方式中，与对照相比，上述烟草植物的硝酸优选至少减少了10％、至少减少了15％、至少减少了20％、至少减少了25％、至少减少了30％、至少减少了35％、至少减少了40％、至少减少了45％、至少减少了50％。
[0146]
优选上述(a)-(c)中的1种以上的性质不仅是作为突变体或基因修饰体的m1代，而且在其以后的传代(m2代、m3代、m3代以后)中也可得到继承。
[0147]
3.烟草植物的制备方法
[0148]
在一个方式中，本发明涉及烟草植物的制备方法。烟草植物的制备方法包括：
[0149]
(i)将烟草植物的硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸改变为脯氨酸以外的氨基酸残基；或者
[0150]
(ii)通过突变，选择硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的烟草植物。
[0151]“硝酸还原酶”、“与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基”等的含义如“2.烟草植物的性质”中的说明所述。
[0152]
烟草植物中的硝酸还原酶蛋白中与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸修饰为脯氨酸以外的氨基酸残基可以通过如下方式进行：对编码硝酸还原酶蛋白的内源性基因进行修饰，使得烟草植物表达与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶蛋白。
[0153]
内源性基因的修饰例如可以使用基因组编辑系统进行。对于基因组编辑系统而言，为了制备在相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位具有突变的硝酸还原酶蛋白，能够在特定的位置结合内源性硝酸还原酶基因或将其切断。内源性硝酸还原酶基因可以通过包含将内源性硝酸还原酶基因结合及切断的部位特异性核酸酶的基因组编辑系统而进行修饰。基因组编辑系统也可以利用核酸酶介导的非同源末端结合或同源重组修复。可以对部位特异性核酸酶进行修饰。例如，修饰的部位特异性核酸酶可以为crispr/cas9类系统、zfn或talen。部位特异性核酸酶可以将内源性硝酸还原酶基因结合及切断。作为基因组编辑系统，也可以利用修饰的crispr/cas-9系统、修饰的转录激活因子样效应物核酸酶、修饰
的锌指核酸酶或修饰的大范围核酸酶等修饰的crispr/cas系统。
[0154]
上述烟草植物的制备方法可以包括如下工序：选择通过突变硝酸还原酶蛋白的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的烟草植物。
[0155]
使植物发生突变的方法在本领域是公知的，包括化学突变原或放射线在内，可以使用主要产生点突变及短的缺失、插入、碱基转换和/或转移的突变原而在植物所具有的硝酸还原酶基因中产生突变。化学突变原包括：乙基甲磺酸盐、甲基甲磺酸盐、n-乙基-n-亚硝基脲、三乙基三聚氰胺、n-甲基-n-亚硝基脲、甲基苄肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、二乙基硫酸盐、丙烯酰胺单体、苯丙氨酸氮芥、氮芥(nitrogen mustard/
ナイトロジェン
·
マスタードカラシナ
)、长春新碱、二甲基亚硝胺、n-甲基-n
’‑
硝基-亚硝基胍、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12二甲基苯并(a)蒽、氧化乙烯氧化物、六甲基膦酰胺、白消安(bisulfane)、二环氧烷(二环氧辛烷、二环氧丁烷及类似物)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯乙基)氨基丙基氨基]吖啶二盐酸盐及甲醛，但并不限定于此。另外，放射线包括：γ射线、重离子束、x射线、中子射线或uv，但并不限定于此。
[0156]
选择通过突变硝酸还原酶蛋白的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的烟草植物的工序可以包括一次以上的杂交工序。在一个方式中，可以将来自植物体的种子诱变后，进行播种、栽培，得到第一代的植物体，对于将其进行自花受粉而得到的第二代的植物体，进行突变体的筛选。筛选第二代的植物体的优点在于该突变为来自于生殖细胞的突变。诱变的对象没有限定，可以为种子、花粉。在以花粉作为对象进行诱变的情况下，对于由将该花粉与未进行诱变的植物体进行交配而得到的种子生长成的植物体，可以进行突变体的筛选。
[0157]
另外，作为上述烟草植物的制备方法，可以通过利用人工操作向烟草植物导入如下核酸而进行，所述核酸编码硝酸还原酶蛋白，使得烟草植物表达与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶蛋白。
[0158]
用于导入核酸的方法没有特别限定，可以使用用于导入核酸的公知的方法来进行。例如，可以优选使用聚乙二醇法(peg法)、电穿孔法、基因枪法、显微注射法、晶须法等物理化学方法(dna的直接导入法)或土壤杆菌(属)法等生物学方法(dna的间接导入法)。
[0159]
与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基的目标基因修饰体、突变体、或基因重组体的选择非限定性地可以通过例如从烟草植物提取基因组dna，利用pcr等进行扩增，然后对编码包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基的部分的dna的碱基序列进行分析而进行。此外，可以从以下方法中选择：使用sscp(single strand conformation polymorphism)法按照电泳距离的差异检测序列的差异的方法、通过使用t7 endonuleasei等将错配部位切断而检测有无突变的方法等。
[0160]
在一个方式中，本发明可以是为了挑选包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶的烟草植物而使用的挑选用核酸标记物。或者，可以是用于检测硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸向脯氨酸以外的氨基酸残基的突变所使用的检测用多核苷酸。非限定性地，挑选用核酸标记物或检测用多核苷酸可以是用于
将编码包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基的部分的dna的碱基序列进行扩增的核酸扩增用引物，可以是编码包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基的部分的dna的碱基序列的序列确定用引物，或者可以是和编码包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基的部分的dna结合的探针。本领域技术人员可以基于公知技术而适当选择这些挑选用核酸标记物或检测用多核苷酸。
[0161]
在一个方式中，本发明可以是试剂盒，所述试剂盒包含：为了挑选包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶的烟草植物而使用的挑选用核酸标记物、或者用于检测硝酸还原酶蛋白的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸向脯氨酸以外的氨基酸残基的突变所使用的检测用多核苷酸。
[0162]
在一个方式中，本发明可以是烟草植物及其后代，所述烟草植物是与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的烟草植物、和通过与本发明的烟草植物不同的机理降低了含有的硝酸量和/或tsna的烟草植物进行交配而得到的。作为这样的交配亲本的例子，可以举出：经过修饰而使作为主要的尼古丁去甲基化酶的cyp82e4不发挥功能的突变体、硝酸转运蛋白的突变体。
[0163]
在本说明书的实施例中，可以得到包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为亮氨酸或丝氨酸的硝酸还原酶的烟草植物。用于产生从脯氨酸向亮氨酸的氨基酸变化的碱基序列的突变为cca
→
cta，用于产生从脯氨酸向丝氨酸的氨基酸变化的碱基序列的突变为cca
→
tca，均为仅1个碱基的突变。
[0164]
为了得到非专利文献2、3中记载的硝酸还原酶s523d，为了在523位产生从丝氨酸向天冬氨酸的氨基酸变化，需要tca
→
gat这样的3个碱基置换。需要将3个碱基进行置换的事实意味着通过药剂等的突变对内源性的硝酸还原酶基因进行修饰而获得s523d突变体是极其困难的。与此相对，包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为亮氨酸或丝氨酸的硝酸还原酶的烟草植物易于通过突变而获得。考虑到包括欧洲在内的各国在制度上难以进行基因重组作物的栽培等，突变体在事业上是有效的。
[0165]
在硝酸还原酶中，连接着保守结构域之间的保守性低的区域(铰链1区域)是已知的。非专利文献2、3中记载的s523d存在于该铰链1区域。在本发明中，获得具有在铰链1区域中氨基酸发生了突变的硝酸还原酶的烟草植物26种，对其叶中硝酸量进行了调查，结果是观察到减少的只有本发明的2种p525突变体。
[0166]
4.烟叶及干燥叶
[0167]
在一个方式中，本发明涉及由本发明的烟草植物收获的烟叶。另外，本发明涉及由本发明的烟叶生成的干燥叶。
[0168]“本发明的烟叶”含义如在“3.烟草植物的制备方法”中的说明所述。
[0169]
由烟叶制作干燥叶的工序没有特别限定，可以使用公知的方法。对于烟草植物，可以收获其叶，作为用于制造烟草制品等的材料。烟叶可以进行空气干燥、烘烤干燥(fire-cured)、烟熏干燥(flue-cured)或日晒干燥。非限定性地，对于空气干燥，悬挂于通风良好的仓库，暴露于空气中干燥4～8周。对于烘烤干燥烟草，在大的仓库中悬挂，根据工序及烟
草用火力连续或间断地加热干燥3天～10周。对于烟熏干燥烟草，将烟草排成一列，在干燥小屋中悬挂，通常使温度缓慢上升使其干燥1周左右。对于日晒干燥处理烟草，在向阳处干燥。该方法是在土耳其、希腊、以及其它地中海各国为了制造东方烟叶而使用的。
[0170]
在一个方式中，本发明涉及来自于本发明的烟叶的干燥叶、烟叶的干燥叶。
[0171]
在一个方式中，上述烟叶及干燥叶包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶蛋白、或编码该蛋白的核酸。
[0172]
在一个方式中，上述干燥叶与由“2.烟草植物的性质”中记载的作为对照的烟草植物的烟叶所制成的干燥叶相比，烟草特有亚硝胺(tsna)有所减少。
[0173]
tsna的4种成分
[0174]
n-亚硝基降烟碱(nnn)
[0175]
n-亚硝基新烟草碱(nat)
[0176]
n-亚硝基假木贼碱(nab)
[0177]
来自尼古丁的亚硝基酮(nnk)
[0178]
在实施例7中，p525l、p525s的纯合体与由作为对照的烟草植物的烟叶所生成的干燥叶相比，tsna的4种成分(nnn、nat、nab及nnk)的总计减少了34-36％。在一个方式中，上述烟草植物与对照相比，tsna的至少1种成分、或tsna的成分的总计至少减少了5％、10％、15％、20％、25％、30％。
[0179]
5.去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒、提取物、组合物
[0180]
在一个方式中，本发明涉及由本发明的干燥叶制造的去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒、或提取物。
[0181]“本发明的干燥叶”的含义如“4.烟叶及干燥叶”中的说明所述。
[0182]“去筋烟丝”是指将干燥的烟叶细碎切断成细长的条状的烟丝，用于卷烟。
[0183]“叶脉”是指沿着叶的中央的最粗的叶脉部分。
[0184]“粉末”是指将干燥的烟叶粉碎而成为粉状的粉末。
[0185]“颗粒”是指将粉末成型为粒状的颗粒。
[0186]“提取物”是以改善烟草制品的香味的目的、降低烟草制品中的特定成分的含量的目的而对来自于烟草植物的叶、茎等材料(“部分”、优选包含“非增殖性部分”)进行提取所得到的物质。提取方法可以使用用于从植物提取精油、特定成分等的公知的方法。
[0187]
非限定性地，本发明涉及本发明的烟草植物(包含部分)或干燥叶、或包含来自于这些的烟草材料(去筋烟丝等)的组合物。组合物可以直接使用烟草植物或其部分，或者使用进行裁切、粉碎或磨碎而形成细片状、浆料状或微粉状的材料。作为组合物，烟草植物或其部分可以直接使用从田地等收获到的烟草，可以使用在给定期间的屋内或屋外中使水分部分散失的材料，或者可以使用利用干燥机等使水分基本上散失的材料。
[0188]
非限定性地，组合物可以包含由本发明的干燥叶制造的去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒或提取物。
[0189]
在一个方式中，本发明的去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒或提取物、以及组合物包含烟草植物的非增殖性部分。
[0190]
在一个方式中，本发明的去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒或提取物、以及组合物包
含编码与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶的核酸。
[0191]
6.制品
[0192]
在一个方式中，本发明涉及包含本发明的干燥叶、和/或本发明的去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒或提取物的烟草制品。
[0193]“本发明的干燥叶、和/或、本发明的去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒、或者提取物”的含义如“5.去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒、提取物、组合物”中的说明所述。
[0194]“烟草制品”的种类没有特别限定。除卷烟(香烟)以外，包括雪茄、烟斗烟草、鼻烟(包含唇烟(snus)、鼻烟(snuff))、嚼烟、烟丝(包含细烟丝)、水烟等。进一步，也包含以将烟草加热而产生的气溶胶作为气溶胶源而使用的非燃烧加热型烟草制品、不将烟草加热而抽吸其香味的非加热型烟草制品等。
[0195]
非限定性地，“烟草制品”包含烟草植物的非增殖性部分。
[0196]
在一个方式中，本发明提供本发明的烟草植物、烟叶、干燥叶的用于制造烟草制品的用途。
[0197]
在一个方式中，本发明涉及本发明的烟草植物、烟叶、干燥叶作为烟草制品的用途。
[0198]
在一个方式中，本发明涉及用于作为烟草制品的用途的发明的烟草植物、烟叶、干燥叶的烟草制品。
[0199]
在一个方式中，本发明包含烟草制品的制造方法。非限定性地，烟草制品的制造方法包括：从修饰烟草植物制备来自于烟草植物的材料，所述修饰烟草植物包含与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的硝酸还原酶。上述制造方法可以包括从上述烟草植物采集叶而制备干燥叶的工序。烟草制品的制造方法可以使用公知的方法。例如，可以从修饰烟草植物，将采集到的叶(烟叶)经由原料工序(分级、去骨、调整/干燥、贮藏/熟成)、原料加工工序(片材、提取、颗粒、加热、增香)、以及制品工序(混合、切碎、卷烟、包装)而制造烟草制品。
[0200]“烟草制品”的定义如上所述。
[0201]
实施例
[0202]
以下，基于实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。本领域技术人员可以基于本说明书的记载而容易地对本发明进行修改/变更，这些均包含于本发明的技术范围。
[0203]
比较例1s523d、wt组成型表达重组体的制备
[0204]
在本比较例中，进行了s523d、wt组成型表达重组体的制备。
[0205]
(1)载体构建
[0206]
关于导入了突变而使nia2多肽(序列号4)的第523位的丝氨酸(s)变为天冬氨酸(d)的orf(s523d)和野生型的nia2的orf(wt)，从genewiz购入了人工合成的dna。通过在5’末端添加cat、在3’末端添加gtcgac，使其可以用各ndei、sali切断。另外，将野生型nia2的orf(序列号3)的第1869～71位的ttc置换为aag(相当于序列号25的碱基1872～74)，导入了hindiii位点，使得能够在不发生氨基酸置换突变的情况下与内源的nia2相区别。以序列号24示出编码nia2的s523d的合成dna的碱基序列，以序列号25示出编码野生型nia2的合成
dna的碱基序列。
[0207]
在具有35s启动子的pri201-an(takara bio)中导入了上述dna的ndei/sali消化片段。使用序列确定用引物(表1)确认了包含与载体的结合部位的插入的整体的序列。
[0208]
[表1]
[0209]
引物名序列nia2_ex1_2faccgaagcatggtggtacaa(序列号9)nia2_ex2_3fggctattcttattctggcggag(序列号10)nia2_ex3_4rcatcattcccatgacgttcc(序列号11)nia2_ex4_hindiii_rgctgctgaagcttgaagatcc(序列号12)
[0210]
通过电穿孔法将确认了序列的质粒转化至土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens lba4404)，用于烟草转化。
[0211]
(2)烟草转化
[0212]
将(1)中制备的具有2种构建体的土壤杆菌分别转化至烟草(栽培品种：petit havana sr-1)。对于确认到生根的个体，分析了枝条的叶中的导入基因的表达。将通过以下的“(3)导入基因的表达确认”中记载的方法而确认了导入基因的表达的个体移植至装满肥土的3号盆。在基因重组温室中栽培这些t0代的个体，采集了自体繁殖t1种子。
[0213]
(3)导入基因的表达确认
[0214]
使用rneasy plant mini kit(qiagen)从叶提取rna，使用primescript(商标)rt reagent kit with gdna eraser(takara bio)合成cdna，使用taq man fast advanced master mix(thermo fisher scientific)和step oneplus real-time pcr systems(thermo fisher scientific)分析了导入的突变型nia2 cdna来源的表达水平。
[0215]
引物、探针序列如表2所述。使用作为对照的延伸因子-1α基因(accession no.af120093、elf)，以相对于对照的相对表达水平(dct)进行了比较
[0216]
[表2]
[0217][0218]
比较例2s523d、wt组成型表达重组体的分析
[0219]
在本比较例中，进行了比较例1中获得的s523d、wt组成型表达重组体的分析。在t1代中，也通过比较例1(3)中记载的方法确认导入基因的表达，实施了以下的试验。
[0220]
(1)液肥栽培
[0221]
播种比较例1(2)的t1种子约2周后进行假植，将假植后约2周的苗移植至4号盆。连带肥土一起移动假植苗，装入蛭石400ml左右。施加硝酸液肥(以no3计为20mm：4mm ca(no3)2、4mm mg(no3)2、4mm kno3)，在明期25℃/暗期18℃、12小时天长、湿度60％条件下进行栽培。明期为10000勒克斯～15000勒克斯的明亮程度进行栽培，暗期在将koitotoron内的
灯全部关闭(off)的遮光条件下进行栽培。
[0222]
(2)硝酸定量
[0223]
采集叶(3-8片)，将去除叶脉的叶片以80℃干燥一晚以上。对于这些干燥粉末，添加平均每干燥粉末100mg为1ml的mq水，振荡提取1小时以上。将滤液作为测定试样，使用ntrachek 404meter(kpg products ltd)按照附带的手册测定了硝酸。
[0224]
如以前的报告(例如，专利文献1、非专利文献2)所述，确认了通过具有s523d突变的nia2(nia2_s523d)的组成型表达，叶(叶片)中的硝酸量急剧减少(图1)。另一方面，野生型的nia2(nia2_wt)的组成型表达也观察到与不组成型表达nia2的对照相比减少了1/2～1/4左右的硝酸量(图1)。
[0225]
关于生长，在nia2_wt中，无论有无组成型表达，未观察到很大的差异，nia2_s523d显示出因组成型表达而个体的尺寸变小的矮化性(图2)。该矮化性的形状从生长初期可观察到(图3)。
[0226]
(3)亚硝酸定量
[0227]
在样品100μl中混合50μl的显色试剂1(3n hcl中，2％对氨基苯磺酰胺)，在室温下反应5分钟。添加/混合50μl的显色试剂2(水中，0.1％n-萘基乙二胺)，在室温下反应10分钟。利用酶标仪infinite 200pro(tecan)测定a540和作为对照的a700，将a540-a700(差分)作为测定值。用于校准曲线的nano2(和光纯药/特级)100μl也同样地测定，作出校准曲线，计算出亚硝酸量。
[0228]
(4)暗处亚硝酸溶出试验
[0229]
参考lea等的方法(非专利文献4)进行了暗处亚硝酸溶出试验。使nia2_s523d的叶盘浸渍于溶出缓冲液(50mm hepes-naoh ph7、50mm kno3)，用铝箔遮光，在28℃、100rpm的条件下振荡反应5小时。回收溶出缓冲液，按照“(3)亚硝酸定量”中记载的方法对亚硝酸进行了定量。使用了平均每4mm直径的叶盘200μl的溶出缓冲液。
[0230]
将对照的sr-1、nia2_s523d组成型表达重组体、以及nia2_wt组成型表达重组体移植至4号盆，从液肥栽培10天的烟草采集5片叶盘(直径4mm)，测定重量后，浸渍于1ml的溶出缓冲液。以每单位鲜叶重量表示溶出至溶出缓冲液中的亚硝酸。
[0231]
在野生型的sr-1及nia2_wt组成型表达重组体中基本没有观察到暗处的亚硝酸的溶出，与此相对，在nia2_s523d组成型表达重组体中观察到显著的溶出(图4)。
[0232]
(5)nr酶活性
[0233]
将(1)中假植的植物置于明亮条件(l)或黑暗条件(d)。明亮条件、黑暗条件均设为室温25℃、湿度60％。需要说明的是，明亮条件设为10000勒克斯～15000勒克斯的明亮程度，黑暗条件将koitotoron内的灯全部关闭(off)进行遮光。在2小时后，将0.1g左右的叶(叶片)采集至2ml管，立即用液氮进行冷冻。用shakemaster neo(bio-medical science)将采集到的叶组织冷冻破碎(1000rpm、30秒钟、2次)。将8倍容量的提取缓冲液(最终浓度；0.1m hepes ph7.5、10mm mgcl2、3％ pvp、1x complete
tm
,edta-free(roche)、2mm dtt)加入冷冻破碎后的组织，充分混合，置于冰上。进行离心(6000rpm、4℃、15分钟)，将上清回收至1.5ml管(粗提取液)。然后，将一部分转移至另外的1.5ml管并用超纯水稀释5倍。根据情况，将最终浓度10mm mgcl2或最终浓度10mm edta加入提取缓冲液，制备了粗提取液。
[0234]
活性测定如下所述实施。将5倍稀释后的20μl粗提取液加入至80μl的活性测定缓
kit(thermo fisher scientific)，按照试剂盒附带的方法进行了纯化。通过applied biosystems(注册商标)3730dna analyzer(thermo fisher scientific)获得序列信息，通过顺序组装软件atgc(genetyx)进行了分析。
[0252]
作为序列确定用引物，使用了序列号20及22中记载的序列。
[0253]
(4)ems突变体
[0254]
作为“(3)序列分析”的序列分析的结果，在由突变体组合得到的m2品系中，挑选出了在nia1及nia2的铰链1区域具有氨基酸置换的26个品系的错义突变体(表3、4)
[0255]
[表3]
[0256][0257]
[表4]
[0258][0259]
实施例2硝酸减少品系的挑选
[0260]
在本实施例中，对于实施例1中挑选的ems突变体品系，在m2代或m3代中进行液肥栽培，分析了烟叶(叶片)中的硝酸与对照相比是否减少。从m2、m3个体的叶提取基因组dna，以其作为模板，实施实施例1的(2)pcr及(3)序列分析，选出突变的纯合体、杂合体、以及不含突变的分离wt个体。
[0261]
烟草植物的栽培、硝酸定量的方法与比较例2的“(1)液肥栽培”、“(2)硝酸定量”同样地进行。将实施例1中检测到的在铰链1区域具有错义置换突变的nia1突变体16个品系和nia2突变体10个品系(表3)作为对象。在26种突变体中，仅观察到在nia1基因中的第525位的氨基酸导入了置换突变的nia1_p525l和nia1_p525s这2个品系的硝酸显著减少(图6-图8)。
[0262]
实施例3nia1_p525l、nia1_p525s的nr活性分析
[0263]
在本实施例中，进行了nia1_p525l、nia1_p525s的nr活性分析。
[0264]
在实施例2中，对于确认了叶片中的硝酸减少的p525l和p525s，在明亮条件、黑暗条件下分析了nr酶活性的活性化率。方法与比较例2的“(5)nr酶活性”同样地进行。
[0265]
(1)酶活性
[0266]
对于将在活性测定时添加了mg的情况下的nr活性值相对于添加了edta的情况下的nr活性值(nr最大活性)以百分率(％)表示的nr酶活性化率进行了分析。其结果是，对于nia1_p525l、nia1_p525s这两个突变品系而言，纯合体、杂合体在明亮条件下也均具有与黑暗条件同等程度的高nr活性化率(图9)。另一方面，对于不具有突变的分离wt(野生型)而言，与明亮条件相比，黑暗条件下的nr活性化率显著低。根据这些结果可以认为，两种突变体在暗处时活性不受到抑制，因此硝酸的蓄积量减少。另外，不仅是突变型纯合体，突变型杂合体的黑暗条件下的活性化率的降低也很小，该结果与突变型杂合体也观察到了硝酸的
减少的实施例2的结果一致(图7-6、图7-7)。
[0267]
实施例4nia1_p525l、nia1_p525s的m3代的再确认
[0268]
在本实施例中，对于nia1_p525l、nia1_p525s的m3代的硝酸水平和暗处的nr活性进行了分析。
[0269]
对于在m2代中确认了暗处的高nr活性化率和硝酸减少的nia1_p525l、nia1_p525s这两个突变品系，在m3代中进行了再确认试验。方法与比较例2的“(1)液肥栽培”、“(2)硝酸定量”、“(4)暗处亚硝酸溶出试验”同样地进行。其中，暗处亚硝酸溶出试验是根据单位叶盘片数的亚硝酸溶出量计算的。
[0270]
(1)暗处亚硝酸溶出
[0271]
nia1_p525l、nia1_p525s这两个突变品系均在纯合体中观察到显著的亚硝酸的溶出(图10)。另一方面，在分离wt(不具有p525突变)中，与野生型的tsukuba 1号同样地基本上没有观察到亚硝酸的溶出。由此，再确认了nia1_p525l、nia1_p525s的突变型纯合体均在暗处具有高nr活性。
[0272]
(2)硝酸定量
[0273]
对于nia1_p525l、nia1_p525s这两个突变品系而言，纯合体、杂合体与分离wt个体相比，硝酸均明显减少(图11)。与对照相比，硝酸水平在nia1_p525l中为68％，在nia1_p525s中为34％。
[0274]
另外，nia1_p525l、nia1_p525s这两个突变品系与nia2_s523d组成型表达重组体不同，未观察到因有无突变而引起的生长异常(图12)。
[0275]
实施例5nia1-p525l、nia1 p525s的田地栽培个体的硝酸量
[0276]
在本实施例中，对于nia1_p525l、nia1_p525s，调查了田地栽培的个体的硝酸量。
[0277]
将tn90(白肋(burley)种)与nia1基因上具有p525l、p525s的氨基酸置换突变的突变体进行交配，得到了bc1f1品系。在将其自体繁殖的bc1f2代中，在田地中栽培nia1的氨基酸置换突变的纯合体、杂合体、以及不含突变的分离wt个体。按照白肋种的标准耕作法进行了栽培，在掐尖时在田埂间追肥了基肥量的6成。
[0278]
将掐尖起36天后的3片上部叶作为硝酸的分析样品。使用恒温恒湿器(espec)进行了程序干燥。以黄变条件(温度38℃、相对湿度80％rh)下5天、褐变条件(温度32℃、相对湿度：上部2片为85％rh、下部1片为90％rh)下14天、叶脉干燥条件(温度50℃、相对湿度40％rh)下3天进行了干燥。将干叶的叶片粉碎，使用自动分析仪quaatro 2hr(bl tec公司)按照操作说明书分析了硝态氮。
[0279]
p525l突变的纯合体或杂合体的干叶中的硝态氮浓度与对照(不具有突变的wt)相比为1/2左右(图13)。同样地，纯合(纯合体)或杂合(杂合体)地具有p525s突变的个体的干叶中的硝态氮浓度与对照(不具有突变的wt)相比也为1/2左右。
[0280]
实施例6s523d组成型表达重组体和p525突变体的生长、生物量、开花
[0281]
在本实施例中，调查了s523d组成型表达重组体和p525突变体的生长、生物量、以及开花。
[0282]
(1)s523d组成型表达重组体的生长不良
[0283]
通过“比较例1s523d、wt组成型表达重组体的制备(1)、(2)”中记载的方法转化至tn90(白肋种)，采集了t1种子。在t1代中挑选导入基因高表达的个体(s523d-oe、wt-oe)和
未观察到表达的个体(空分离(null segregant)。s523d-null、wt-null)，用于试验。具体而言，将使导入了nia2_s523d的t0代自体繁殖而得到的t1代的各3个品系(s523d-oe_1、2、3及s523d-null_1、2、3)、使导入了nia2_wt的t0代自体繁殖而得到的t1代的各2个品系(wt-oe_1、2及wt-null_1、2)、并以作为转化的宿主的tn90作为野生型用于试验。
[0284]
使用在25℃的封闭型温室中栽培的幼体植物的叶，按照“比较例1s523d、wt组成型表达重组体的制备(3)”中记载的方法挑选了导入基因高表达的个体(s523d-oe、wt-oe)和不表达的个体(s523d-null、wt-null)。将挑选出的各个体移植至盆中继续栽培。在移植8天后，记录了各品系的个体的照片。高表达nia2_s523d的t1代的3个品系的s523d-oe与s523d-null相比，生长均明显差(图14)。另一方面，在高表达nia2_wt的t1代的2个品系的wt-oe和wt-null中，没有观察到显著的生长差异(图14)。
[0285]
s523d-oe特异性生长不良在幼苗阶段已可观察到。在移植23天后，对于各品系4个个体测定了地上叶数、株高、地上叶的干物重量。对于地上叶数而言，s523d-oe比s523d-null少2-3片，但在wt-oe和wt-null中没有观察到显著差异(图15)。对于株高和地上叶的干物重量(生物量)，s523d-oe比s523d-null显著低，在wt-oe和wt-null中没有观察到显著差异(图16、图17)。
[0286]
以上表明，在tn90(白肋种)中，nia2_s523d的高表达引起显著的生长不良。由于在wt-oe中未观察到生长不良，因此，可以认为这不是nr蛋白质的高表达本身的影响，而是在暗处活性未被抑制的突变型(nia2_s523d)的nr蛋白质的高表达的影响。
[0287]
(2)s523d组成型表达重组体与p525突变体的生长比较
[0288]
以tsukuba 1号(黄色种)代替tn90作为宿主，按照(1)中记载的要点制备转化体，同样地进行了分析。将使高表达nia2_s523d的t0代自体繁殖而得到的t1代的3个品系用于试验。
[0289]
使用在恒定25℃的封闭型温室中栽培的幼体植物的叶，挑选导入基因高表达的个体(s523d-oe)和不表达的个体(s523d-null)，移植至盆中继续栽培。同时，同样地栽培了在nia1纯合地具有(纯合体)p525l、p525s的氨基酸置换突变的m3代的各2个品系。在移植34天后，对于各品系3个个体测定了地上叶数、株高、地上叶的干物重量。对于高表达s523d-oe的3个品系、nia1的p525l、p525s的氨基酸置换突变的纯合体的各2个品系而言，分别汇集统计了多个品系的结果，进行了比较。
[0290]
与对照(s523d-null)相比，高表达nia2_s523d的品系(s523d-oe)的地上叶数少了1片(图18)。另一方面，nia1的p525l、p525s的氨基酸置换突变的纯合体与对照(s523d-null)等同。株高也与地上叶数同样，仅在高表达nia2_s523d的品系(s523d-oe)中观察到显著差异，低于对照(图19)。
[0291]
对于地上叶的干重(生物量)而言，也仅在高表达nia2_s523d的品系(s523d-oe)中观察到与对照(s523d-null)相比为约一半的显著差异(图20)。
[0292]
这些结果表明，在tsukuba 1号(黄色种)的遗传背景下，因高表达nia2_s523d而显著生长不良。另一方面，nia1的p525l、p525s的氨基酸置换突变的纯合体与高表达nia2_s523d的品系(s523d-oe)不同，未观察到生长的异常。
[0293]
在恒定25℃的条件下持续栽培至开花，对开花期也进行了调查。高表达nia2_s523d的品系(s523d-oe)与对照(s523d-null)相比，观察到了开花也有延迟的倾向(图21)。
[0294]
实施例7田地栽培的p525l、p525s突变体的叶中成分(尼古丁、tsnas)
[0295]
对于实施例5中记载的回交品系bc1f1，分离了进一步回交tn90而得到的bc2f1品系。分离由该品系进行2代自体繁殖而得到的bc2f3代，在田地中进行栽培。p525l_homo和p525s_homo是在nia1基因中分别纯合地具有p525l或p525s的突变的纯合体。p525l_wt和p525s_wt是分别在bc2f2代中作为在nia1基因中不具有突变的个体而分离的品系。各分离品系的基因型按照实施例1的ems突变体的挑选中记载的方法利用pcr对nia1基因的nia1_hinge1区域进行扩增，通过对其碱基序列进行序列分析而进行。
[0296]
按照白肋种的标准耕作法(栽植密度：2380株/10a、复混肥料白肋s625：216kg/10a)进行栽培，在掐尖8天后追肥了基肥的50％的复混肥料。在从移植起约2个月后的开花期进行掐尖，然后，分约3次去除了下部叶。在掐尖56天后，将最上部2片取样，使用恒温恒湿器(espec)在表5中记载的条件下使其干燥。
[0297]
[表5]
[0298][0299]
将干燥的叶粉碎后，以干燥粉末作为试样分析了尼古丁、烟草特有亚硝胺(tsna)。相对于0.25g的试样加入4ml的2n氢氧化钠，在室温下静置30分钟后，加入40ml的甲醇，振荡提取，对用0.45μm过滤器过滤后的滤液进行气相色谱-质谱(gc-ms)分析，由此测定了尼古丁。
[0300]
相对于0.5g试样加入20ml的0.1m乙酸铵，振荡提取，在用0.1m乙酸铵稀释10倍后，进行液相色谱-质谱/质谱(lc-ms/ms)分析，由此测定了tsna的4种成分(nnn、nat、nab及nnk)。
[0301]
尼古丁在p525l_homo、p525s_homo及wt之间未观察到很大差异(图22a)。p525l、p525s的wt的尼古丁分别为6.3％、5.8％。另一方面，对于tsnas而言，将nnn、nat、nab、nnk的分析值合计而得到的值作为tsnas进行了比较，p525l、p525s均在纯合体中比wt显著减少了34-36％(图22b)。p525l、p525s的wt的tsnas分别为3.8ppm、1.0ppm。根据这些结果确认了，在nia1基因具有p525l及p525s的突变的突变体中，通过硝酸水平降低，干叶中的tsnas水平降低。
[0302]
工业实用性
[0303]
通过利用硝酸盐蓄积量减少的本发明的修饰烟草植物，将能减少烟草原料、烟草制品的tsna。本发明的修饰烟草植物不仅叶中硝酸量降低，而且优选植物体的生长也良好。其能够作为用于制造烟草制品的烟叶的材料而利用。

技术特征：
1.一种烟草植物，其包含硝酸还原酶，该硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的烟草植物，其具有以下的(a)-(c)中1种以上的性质：(a)黑暗条件下的硝酸还原酶的活性为明亮条件下的硝酸还原酶的活性的80％以上、(b)对照与个体的生长实质上等同、和/或(c)硝酸比对照有所降低，其中，对照包含含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶。3.根据权利要求1或2所述的烟草植物，其包含硝酸还原酶，该硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为亮氨酸或丝氨酸。4.根据权利要求1～3中任一项所述的烟草植物，其中，在上述发生了突变的硝酸还原酶的氨基酸序列中，与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的523位相应的氨基酸残基为丝氨酸。5.根据权利要求1-4中任一项所述的烟草植物，其中，上述发生了突变的硝酸还原酶具有与序列号2或4的氨基酸序列80％以上同一的氨基酸序列。6.根据权利要求1～5中任一项所述的烟草植物，其中，上述发生了突变的硝酸还原酶具有相当于序列号5-8中任一者的氨基酸序列。7.根据权利要求2～6中任一项所述的烟草植物，其中，与对照相比，硝酸至少减少了10％。8.根据权利要求1～7中任一项所述的烟草植物，其为突变体或基因修饰体。9.根据权利要求1～8中任一项所述的烟草植物，其中，所述烟草植物为红花烟草(nicotiana tabacum)。10.权利要求1～9中任一项所述的烟草植物的制备方法，该方法包括：(i)将烟草植物的硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸改变为脯氨酸以外的氨基酸残基；或者(ii)选择硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基通过突变从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基的烟草植物。11.一种烟叶，其是由权利要求1～9中任一项所述的烟草植物收获而得到的。12.一种干燥叶，其是由权利要求11所述的烟叶制成的。13.去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒或提取物，其是由权利要求12所述的干燥叶制造的。14.一种烟草制品，其包含权利要求12所述的干燥叶、和/或权利要求13所述的去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒或提取物。

技术总结
本发明涉及烟草植物等。本发明的烟草植物包含硝酸还原酶，该硝酸还原酶的与相当于序列号2或4的氨基酸序列中的525位相应的氨基酸残基从脯氨酸突变为脯氨酸以外的氨基酸残基。在一个方式中，烟草植物具有以下的(a)-(c)中的1种以上的性质：(a)黑暗条件下的硝酸还原酶的活性为明亮条件下的硝酸还原酶的活性的80％以上、(b)对照与个体的生长实质上等同、和/或(c)硝酸比对照有所降低，其中，对照包含含有序列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶。列号2或4的氨基酸序列的硝酸还原酶。


技术研发人员：铃木庄一 冈田龙 野口总一郎
受保护的技术使用者：日本烟草产业株式会社
技术研发日：2021.12.09
技术公布日：2023/8/13