L-氨基酸的制造方法与流程

l-氨基酸的制造方法
技术领域
1.本发明涉及使用了细菌的发酵法的l-谷氨酸等l-氨基酸的制造方法。l-氨基酸作为调味料原料等在产业上是有用的。


背景技术：

2.l-氨基酸例如通过使用了具有l-氨基酸生产能力的细菌等微生物的发酵法而进行工业生产(非专利文献1)。作为这样的微生物，例如，会使用从自然界中分离的菌株、或它们的变异株。此外，可以通过重组dna技术使微生物的l-氨基酸生产能力提高。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.非专利文献1：明石邦彦等著氨基酸发酵，学会出版中心，195～215页，1986年


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题
7.本发明以开发一种使细菌的l-氨基酸生产能力提高的新技术，提供一种高效的l-氨基酸的制造方法为技术问题。
8.解决技术问题的技术手段
9.本发明者为了解决所述技术问题而进行了深入研究，结果发现：通过以使其具有选自下述(a)～(e)的修饰中的1种或1种以上的修饰的方式对棒状细菌进行修饰，能够使该细菌的l-氨基酸生产能力提高，从而完成了本发明：
10.(a)乙酸激酶(acetate kinase)的活性增大的修饰；
11.(b)果糖-1,6-双磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase)的活性增大的修饰；
12.(c)丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)的活性降低的修饰；
13.(d)天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase)的活性降低的修饰；
14.(e)苹果酸酶(malic enzyme)的活性降低的修饰。
15.即，本发明可以如下例示。
16.1.17.一种l-氨基酸的制造方法，其包含：
18.用培养基培养具有l-氨基酸生产能力的棒状细菌，使l-氨基酸积蓄在该培养基中和/或该细菌的菌体内；和
19.从所述培养基和/或所述菌体中采集所述l-氨基酸，
20.所述l-氨基酸为谷氨酸类l-氨基酸，
21.所述细菌具有下述(x)和/或(y)的修饰：
22.(x)使经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高的修饰；
23.(y)使细胞内的草酰乙酸池增大的修饰。
24.2.25.根据上述方法，其中，
26.所述细菌至少具有所述(x)的修饰。
27.3.28.根据上述方法，其中，
29.所述(x)的修饰为选自下述(a)、(b)和(c)的修饰中的1种或1种以上的修饰；
30.所述(y)的修饰为选自下述(d)和(e)的修饰中的1种或1种以上的修饰：
31.(a)乙酸激酶的活性增大的修饰；
32.(b)果糖-1,6-双磷酸酶的活性增大的修饰；
33.(c)丙酮酸脱氢酶的活性降低的修饰；
34.(d)天冬氨酸转氨酶的活性降低的修饰；
35.(e)苹果酸酶的活性降低的修饰。
36.4.37.一种l-氨基酸的制造方法，其包含：
38.用培养基培养具有l-氨基酸生产能力的棒状细菌，使l-氨基酸积蓄在该培养基中和/或该细菌的菌体内；和
39.从所述培养基和/或所述菌体中采集所述l-氨基酸，
40.所述l-氨基酸为谷氨酸类l-氨基酸，
41.所述细菌具有选自下述(a)～(e)的修饰中的1种或1种以上的修饰：
42.(a)乙酸激酶的活性增大的修饰；
43.(b)果糖-1,6-双磷酸酶的活性增大的修饰；
44.(c)丙酮酸脱氢酶的活性降低的修饰；
45.(d)天冬氨酸转氨酶的活性降低的修饰；
46.(e)苹果酸酶的活性降低的修饰。
47.5.48.根据上述方法，其中，
49.所述细菌至少具有所述(a)的修饰。
50.6.51.根据上述方法，其中，
52.所述天冬氨酸转氨酶由aspt基因编码；
53.所述苹果酸酶由male基因编码；
54.所述丙酮酸脱氢酶由poxb基因编码；
55.所述乙酸激酶由ack基因编码；并且/或者
56.所述果糖-1,6-双磷酸酶由glpx基因编码。
57.7.58.根据上述方法，其中，
59.所述天冬氨酸转氨酶的活性，通过使编码天冬氨酸转氨酶的基因的表达降低或通过破坏该基因而降低；
60.所述苹果酸酶的活性，通过使编码苹果酸酶的基因的表达降低或通过破坏该基因而降低；
61.所述丙酮酸脱氢酶的活性，通过使编码丙酮酸脱氢酶的基因的表达降低或通过破坏该基因而降低；
62.所述乙酸激酶的活性，通过使编码乙酸激酶的基因的表达上升而增大；并且/或者
63.所述果糖-1,6-双磷酸酶的活性，通过使编码果糖-1,6-双磷酸酶的基因的表达上升而增大。
64.8.65.根据上述方法，其中，
66.编码乙酸激酶的基因的表达，通过提高该基因的拷贝数并且/或者对该基因的表达调节序列进行修饰而上升；并且/或者
67.编码果糖-1,6-双磷酸酶的基因的表达，通过提高该基因的拷贝数并且/或者对该基因的表达调节序列进行修饰而上升。
68.9.69.根据上述方法，其中，
70.所述天冬氨酸转氨酶为下述(1a)、(1b)或(1c)所述的蛋白质：
71.(1a)包含seq id no.2所示的氨基酸序列的蛋白质；
72.(1b)包含在seq id no.2所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有天冬氨酸转氨酶活性的蛋白质；
73.(1c)包含相对于seq id no.2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有天冬氨酸转氨酶活性的蛋白质；
74.所述苹果酸酶为下述(2a)、(2b)或(2c)所述的蛋白质：
75.(2a)包含seq id no.4所示的氨基酸序列的蛋白质；
76.(2b)包含在seq id no.4所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有苹果酸酶活性的蛋白质；
77.(2c)包含相对于seq id no.4所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有苹果酸酶活性的蛋白质；
78.所述丙酮酸脱氢酶为下述(3a)、(3b)或(3c)所述的蛋白质：
79.(3a)包含seq id no.6所示的氨基酸序列的蛋白质；
80.(3b)包含在seq id no.6所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有丙酮酸脱氢酶活性的蛋白质；
81.(3c)包含相对于seq id no.6所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有丙酮酸脱氢酶活性的蛋白质；
82.所述乙酸激酶为下述(4a)、(4b)或(4c)所述的蛋白质：
83.(4a)包含seq id no.8或10所示的氨基酸序列的蛋白质；
84.(4b)包含在seq id no.8或10所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有乙酸激酶活性的蛋白质；
85.(4c)包含相对于seq id no.8或10所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有乙酸激酶活性的蛋白质；并且/或者
86.所述果糖-1,6-双磷酸酶为下述(5a)、(5b)或(5c)所述的蛋白质：
87.(5a)包含seq id no.12或14所示的氨基酸序列的蛋白质；
88.(5b)包含在seq id no.12或14所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有果糖-1,6-双磷酸酶活性的蛋白质；
89.(5c)包含相对于seq id no.12或14所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有果糖-1,6-双磷酸酶活性的蛋白质。
90.10.91.根据上述方法，其中，所述细菌与非修饰株相比进一步以使磷酸酮醇酶的活性增大的方式进行了修饰。
92.11.93.根据上述方法，其中，
94.所述磷酸酮醇酶为d-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和/或果糖6-磷酸磷酸酮醇酶。
95.12.96.根据上述方法，其中，
97.所述细菌为棒状杆菌属细菌。
98.13.99.根据上述方法，其中，
100.所述细菌为谷氨酸棒状杆菌。
101.14.102.根据上述方法，其中，
103.所述谷氨酸类l-氨基酸为选自l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-脯氨酸、l-精氨酸、l-瓜氨酸和l-鸟氨酸中的1种或1种以上的l-氨基酸。
104.15.105.根据上述方法，其中，
106.所述谷氨酸类l-氨基酸为l-谷氨酸。
107.16.108.根据上述方法，其中，
109.所述l-谷氨酸为l-谷氨酸铵或l-谷氨酸钠。
附图说明
110.[图1]表示以葡萄糖为碳源的情况下的对照株和ack基因的表达增强株的l-谷氨酸的积蓄量的图。
[0111]
[图2]表示以葡萄糖为碳源的情况下的对照株和ack基因的表达增强株的l-谷氨酸的相对糖收率的图。
[0112]
[图3]表示以果糖为碳源的情况下的对照株和glpx基因的表达增强株的l-谷氨酸的积蓄量的图。
[0113]
[图4]表示以葡萄糖为碳源的情况下的对照株和glpx基因的表达增强株的l-谷氨酸的相对糖收率的图。
具体实施方式
[0114]
以下，将对本发明详细地进行说明。
um glutamicum))
[0135]
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(brevibacterium flavum(corynebacterium glutamicum))
[0136]
未成熟短杆菌(brevibacterium immariophilum)
[0137]
乳糖发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(brevibacterium lactofermentum(cory nebacterium glutamicum))
[0138]
玫瑰色短杆菌(brevibacterium roseum)
[0139]
解糖短杆菌(brevibacterium saccharolyticum)
[0140]
brevibacterium thiogenitalis
[0141]
产氨棒杆菌(停滞棒杆菌)(corynebacterium ammoniagenes(corynebacteri um stationis))
[0142]
白短杆菌(brevibacterium album)
[0143]
蜡状短杆菌(brevibacterium cerinum)
[0144]
嗜氨微杆菌(microbacterium ammoniaphilum)
[0145]
作为棒状细菌，特别可以举出谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamic um)(旧名称：乳糖发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum))。
[0146]
作为棒状细菌，具体而言，可以举出下述的菌株。
[0147]
嗜乙酰乙酸棒杆菌atcc 13870
[0148]
醋谷棒杆菌atcc 15806
[0149]
解烷棒杆菌atcc 21511
[0150]
帚石南棒杆菌atcc 15991
[0151]
钝齿棒杆菌as1.542
[0152]
谷氨酸棒状杆菌atcc 13020、atcc 13032、atcc 13060、atcc 13869、ferm bp-734
[0153]
百合棒状杆菌atcc 15990
[0154]
栖糖蜜棒杆菌atcc 17965
[0155]
有效棒杆菌(热产氨棒状杆菌)aj12340(ferm bp-1539)
[0156]
力士棒杆菌atcc 13868
[0157]
叉开短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)atcc 14020
[0158]
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)atcc 13826、atcc 14067、aj12418(ferm bp-2205)
[0159]
未成熟短杆菌atcc 14068
[0160]
乳糖发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)atcc 13869
[0161]
玫瑰色短杆菌atcc 13825
[0162]
解糖短杆菌atcc 14066
[0163]
brevibacterium thiogenitalis atcc 19240
[0164]
产氨棒杆菌(停滞棒杆菌)atcc 6871、atcc 6872
[0165]
白短杆菌atcc 15111
[0166]
蜡状短杆菌atcc 15112
[0167]
嗜氨微杆菌atcc 15354
[0168]
作为棒状细菌，进一步可以特别举出乳糖发酵短杆菌(新名称：谷氨酸棒状杆菌)
atcc 13869。
[0169]
需要说明的是，棒状杆菌属细菌中，也包含曾被分类为短杆菌属，但现在被并入棒状杆菌属的细菌(int.j.syst.bacteriol.,41,255(1991))。此外，停滞棒杆菌中，也包含曾被分类为产氨棒杆菌，但通过16s rrna的碱基序列解析等被再分类为停滞棒杆菌的细菌(int.j.syst.evol.microbiol.,60,874-879(2010))。
[0170]
这些的菌株例如可以从美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，atcc)(地址12301parklawn drive,rockville,maryland 20852p.o.box 1549,manassas,va20108,united states of america)处接受分开出售。即各菌株被赋予了对应的登录编号，可以利用该登录编号来接受分开出售(参照http://www.atcc.org/)。与各菌株对应的登录编号记载在美国典型培养物保藏中心的目录中。此外，这些菌株例如可以从寄存有各菌株的寄存机关处获得。
[0171]
本发明的细菌可以是本来就具有l-氨基酸生产能力的细菌，也可以是以使其具有l-氨基酸生产能力的方式进行了修饰的细菌。具有l-氨基酸生产能力的细菌例如，可以通过对如上所述的细菌赋予l-氨基酸生产能力，或者使如上所述的细菌的l-氨基酸生产能力增强而取得。
[0172]
l-氨基酸生产能力的赋予或增强可以通过以往在棒状细菌或埃希氏菌属细菌等氨基酸生产菌的育种中使用的方法进行(参照氨基酸发酵，(株式会社)学会出版中心，1986年5月30日初版发行，第77～100页)。作为这样的方法，例如，可以举出营养缺陷型变异株的取得、l-氨基酸的类似物抗性株的取得、代谢控制变异株的取得、l-氨基酸的生物合成系酶的活性得到了增强的重组株的创制。在l-氨基酸生产菌的育种中，被赋予的营养缺陷型、类似物抗性、代谢控制变异等性质可以是单独一种，也可以是2种或3种以上。此外，在l-氨基酸生产菌的育种中，活性得到了增强的l-氨基酸生物合成系酶可以是单独一种，也可以是2种或3种以上。此外，也可以将营养缺陷型、类似物抗性、代谢控制变异等性质的赋予与生物合成系酶的活性的增强组合。
[0173]
具有l-氨基酸生产能力的营养缺陷型变异株、类似物抗性株或代谢控制变异株可以通过将亲本株或野生株供至通常的变异处理，从得到的变异株中，选择表现营养缺陷型、类似物抗性或代谢控制变异，且具有l-氨基酸生产能力的细菌而取得。作为通常的变异处理，可以举出基于x射线或紫外线的照射、n-甲基-n
’‑
硝基-n-亚硝基胍(mnng)、甲基磺酸乙酯(ems)、甲基磺酸甲酯(mms)等变异剂的处理。
[0174]
此外，l-氨基酸生产能力的赋予或增强可以通过使参与目标l-氨基酸的生物合成的酶的活性增强而进行。酶活性的增强例如可以通过以使得编码该酶的基因的表达得到增强的方式对细菌进行修饰而进行。使基因的表达增强的方法在wo00/18935、ep1010755a等中有所记载。使酶活性增强的详细手法在后详述。
[0175]
此外，l-氨基酸生产能力的赋予或增强也可以通过使催化从目标l-氨基酸的生物合成途径中分支出来的生成目标l-氨基酸以外的化合物的反应的酶的活性降低来进行。需要说明的是，此处的“催化从目标l-氨基酸的生物合成途径中分支出来的生成目标l-氨基酸以外的化合物的反应的酶”中，也包含参与目标氨基酸的分解的酶。关于使酶活性降低的手法在后详述。
[0176]
以下，将对l-氨基酸生产菌和赋予或增强l-氨基酸生产能力的方法具体地给出例
示。需要说明的是，如以下例示的l-氨基酸生产菌所具有的性质和用于赋予或增强l-氨基酸生产能力的修饰都可以单独使用，也可以适宜组合使用。
[0177]
《l-谷氨酸生产菌》
[0178]
作为用于赋予或增强l-谷氨酸生产能力的方法，例如，可以举出以使得选自l-谷氨酸生物合成系酶中的1种或1种以上的酶的活性增大的方式对细菌进行修饰的方法。作为这样的酶，无特别限制，可以举出谷氨酸脱氢酶(gd ha)、谷氨酰胺合成酶(glna)、谷氨酸合酶(gltbd)、异柠檬酸脱氢酶(icda)、乌头酸水合酶(acna,acnb)、柠檬酸合酶(glta)、甲基柠檬酸合酶(prpc)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceef,lpda)、丙酮酸激酶(pyka,pykf)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsa)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油变位酶(pgma,pgmi)、磷酸丙三醇酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapa)、磷酸丙糖异构酶(tpia)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)、6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(ed d)、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(eda)、转氢酶(pntab)。需要说明的是，括号内为编码该酶的基因的一个例子(在以下的记载中也是同样的)。在这些酶中，例如，优选增强选自谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以及甲基柠檬酸合酶中的1种或1种以上的酶的活性。
[0179]
作为以谷氨酸合酶基因(gltbd)的表达增大的方式进行了修饰的棒状细菌，可以举出wo99/07853中公开的细菌。
[0180]
此外，作为用于赋予或增强l-谷氨酸生产能力的方法，例如，可以举出以使得选自催化从l-谷氨酸的生物合成途径中分支出来而生成l-谷氨酸以外的化合物的反应的酶中的1种或1种以上的酶的活性降低的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，无特别限制，可以举出异柠檬酸裂解酶(acea)、α-酮戊二酸脱氢酶(suca,odha)、乙酰乳酸合酶(ilvi)、甲酸乙酰基转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、醇脱氢酶(adh)、谷氨酸脱羧酶(gadab)、琥珀酸脱氢酶(sdhabc d)。在这些酶中，例如，优选使α-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺损。
[0181]
α-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺损了的棒状细菌以及它们的取得方法在wo2008/075483中有所记载。作为α-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺损了的棒状细菌，具体而言，例如，可以举出下述菌株。
[0182]
谷氨酸棒状杆菌(乳糖发酵短杆菌)l30-2株(日本特开2006-340603)
[0183]
谷氨酸棒状杆菌(乳糖发酵短杆菌)δs株(wo95/34672)
[0184]
谷氨酸棒状杆菌(乳糖发酵短杆菌)aj12821(ferm bp-4172；法国专利第9401748号公报)
[0185]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj12822(ferm bp-4173；法国专利第9401748号公报)
[0186]
谷氨酸棒状杆菌aj12823(ferm bp-4174；法国专利第9401748号公报)
[0187]
此外，作为l-谷氨酸生产菌或用于进行诱导的亲本株，还可以举出α-酮戊二酸脱氢酶(suca)活性和琥珀酸脱氢酶(sdh)活性这两者降低或缺损了的菌株(日本特开2010-041920)。作为这样的菌株，具体而言，例如，可以举出谷氨酸棒状杆菌atcc14067株的odhasdha双重缺损株(谷氨酸棒状杆菌8l3gδsdh株)(日本特开2010-041920)。
[0188]
此外，作为用于赋予或增强l-谷氨酸生产能力的方法，例如，可以举出使yhfk基因(wo2005/085419)、ybjl基因(wo2008/133161)等l-谷氨酸排出基因的表达增强的方法。
[0189]
此外，作为对于棒状细菌赋予或增强l-谷氨酸生产能力的方法，可以举出赋予针
对有机酸类似物、呼吸抑制剂等的抗性的方法、或赋予针对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。作为这样的方法，具体而言，例如，可以举出赋予单氟乙酸抗性的方法(日本特开昭50-113209)、赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法(日本特开昭57-065198)、使脲酶弱化的方法(日本特开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(日本特开昭52-038088)、赋予针对苯并吡喃酮类或萘醌类的抗性的方法(日本特开昭56-1889)、赋予hoqno抗性的方法(日本特开昭56-140895)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(日本特开昭57-2689)、赋予胍抗性的方法(日本特开昭56-35981)、赋予针对青霉素的敏感性的方法(日本特开平4-88994)。
[0190]
作为这样的抗性菌或敏感性菌的具体例，可以举出如下所述的菌株。
[0191]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj3949(ferm bp-2632；日本特开昭50-113209)
[0192]
谷氨酸棒状杆菌aj11628(ferm p-5736；日本特开昭57-065198)
[0193]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj11355(ferm p-5007；日本特开昭56-1889)
[0194]
谷氨酸棒状杆菌aj11368(ferm p-5020；日本特开昭56-1889)
[0195]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj11217(ferm p-4318；日本特开昭57-2689)
[0196]
谷氨酸棒状杆菌aj11218(ferm p-4319；日本特开昭57-2689)
[0197]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj11564(ferm p-5472；日本特开昭56-140895)
[0198]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj11439(ferm p-5136；日本特开昭56-35981)
[0199]
谷氨酸棒状杆菌h7684(ferm bp-3004；日本特开平04-88994)
[0200]
谷氨酸棒状杆菌(乳糖发酵短杆菌)aj11426(ferm p-5123；日本特开平56-048890)
[0201]
谷氨酸棒状杆菌aj11440(ferm p-5137；日本特开平56-048890)
[0202]
谷氨酸棒状杆菌(乳糖发酵短杆菌)aj11796(ferm p-6402；日本特开平58-158192)
[0203]
此外，作为对于棒状细菌赋予或增强l-谷氨酸生产能力的方法，还可以举出使yggb基因的表达增强的方法、导入编码区域内导入有变异的变异型yggb基因的方法(wo2006/070944)。即，本发明的细菌可以是以使yggb基因的表达增大的方式进行了修饰的，也可以是以使其保持(具有)变异型yggb基因的方式进行了修饰的。
[0204]
yggb基因是编码机械力敏感通道(mechanosensitive channel)的基因。作为yggb基因，可以举出棒状细菌的yggb基因。作为棒状细菌的yggb基因，具体而言，例如，可以举出谷氨酸棒状杆菌atcc13869、谷氨酸棒状杆菌at cc13032、谷氨酸棒状杆菌atcc14967、栖糖蜜棒杆菌atcc17965的ygg b基因(wo2006/070944)。谷氨酸棒状杆菌atcc13032的yggb基因相当于ncbi数据库中以genbank accession no.nc_003450登录的基因组序列中，1336091～1337692的序列的互补序列，也被称为ncgl1221。由谷氨酸棒状杆菌atcc13032的yggb基因编码的yggb蛋白以genbank accession no.np_600492的形式而登录。此外，谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的yggb基因的碱基序列以及该基因编码的yggb蛋白的氨基酸序列分别如seq id no.15和16所示。
[0205]
本发明中，具有后述的“特定的变异”的yggb基因也称为变异型yggb基因，由其编码的蛋白质也称为变异型yggb蛋白。此外，在本发明中，不具有后述的“特定的变异”的yggb基因也称为野生型yggb基因，由其编码的蛋白质也称为野生型yggb蛋白。需要说明的是，就yggb蛋白而言，yggb基因中的“特定的变异”引起的氨基酸序列的变化也称为“特定的变
异”。此处的“野生型”是为了方便与“变异型”区别所作的记载，只要不具有“特定的变异”，就不限于天然得到的蛋白。作为野生型yggb蛋白，可以举出所述例示的yggb蛋白，例如具有seq id no.16所示的氨基酸序列的蛋白质。此外，作为野生型yggb蛋白，可以举出为所述例示的yggb蛋白的保守变体(保持原来的功能的变体)且不具有“特定的变异”的蛋白质。对于yggb蛋白而言的“原来的功能”例如可以是指，作为机械力敏感通道(mechanosensitive channel)的功能，也可以是指使其在棒状细菌中的表达上升时提高棒状细菌的l-谷氨酸生产能力的性质。
[0206]
就“特定的变异”而言，只要是使如上所述的野生型yggb蛋白的氨基酸序列变化，使棒状细菌的l-谷氨酸生产能力提高的变异，就无特别限制。作为“特定的变异”，可以举出c末端侧变异、跨膜区域的变异(wo2006/070944)。此外，“特定的变异”可以是这些变异的组合。
[0207]
(1)c末端侧变异
[0208]
c末端侧变异是野生型yggb基因中的、编码野生型yggb蛋白的419～533位的氨基酸残基的区域中的变异。c末端侧变异可以导入至该区域中的1处或1处以上的位置。通过c末端侧变异引起的氨基酸序列的变化的种类无特别限制。c末端侧变异例如可以引起氨基酸残基的置换(错义变异)、氨基酸残基的插入、氨基酸残基的缺失、终止密码子的出现(无义变异)、移码变异、或它们的组合。作为c末端侧变异，例如，优选插入序列(以下，也称为“is”)、转座子等碱基序列的插入。
[0209]
(1-1)碱基序列的插入
[0210]
作为c末端侧变异，例如，可以举出向编码野生型yggb蛋白的419位的缬氨酸残基的位置插入碱基序列的变异(2a-1型变异)。2a-1型变异例如可以引起野生型yggb蛋白的419～533位的氨基酸残基的一部分或全部的缺失或置换。作为具有2a-1型变异的变异型yggb基因，具体而言，例如，seq id no.15的1255位的“g”之后插入有is，编码比原来的野生型yggb蛋白(seq id no.16)短的全长为423氨基残基的变异型yggb蛋白的yggb基因。该变异型yggb基因(v419::is)的碱基序列以及该基因编码的变异型yggb蛋白(v419::is)的氨基酸序列分别如seq id no.17和18所示。seq id no.17中，1～1269位为变异型yggb蛋白(v419::is)的cds。作为具有变异型ygg b基因(v419::is)的l-谷氨酸生产菌，具体而言，例如，可以举出c.glutami cum 2256δsucaδldha yggb
*
株(wo2014/185430)。
[0211]
(1-2)脯氨酸残基的置换
[0212]
作为c末端侧变异，例如，还可以举出将存在于野生型yggb蛋白的419～533位的脯氨酸残基置换为其他氨基酸的变异。作为这样的脯氨酸残基，可以举出野生型yggb蛋白的424位、437位、453位、457位、462位、469位、484位、489位、497位、515位、529位和533位的脯氨酸残基。其中，优选将424位和/或437位的脯氨酸残基置换为其他氨基酸。就“其他氨基酸”而言，只要是脯氨酸以外的天然型氨基酸就无特别限制。作为“其他氨基酸”，可以举出lys、glu、thr、val、leu、ile、ser、asp、asn、gln、arg、cys、met、phe、trp、tyr、gly、ala、his。例如，424位的脯氨酸残基可以优选置换为疏水性氨基酸(ala、gly、val、leu或ile)，可以更优选置换为支链氨基酸(le u、val或ile)。此外，例如，437位的脯氨酸残基可以优选置换为侧链具有羟基的氨基酸(thr、ser或tyr)，更可以优选置换为ser。
[0213]
(2)跨膜区域的变异
[0214]
推测yggb蛋白具有5个跨膜区域。跨膜区域分别相当于野生型yggb蛋白的1～23位(第1跨膜区域)、25～47位(第2跨膜区域)、62～84位(第3跨膜区域)、86～108位(第4跨膜区域)、110～132位(第5跨膜区域)的氨基酸残基。跨膜区域的变异是野生型yggb基因中的编码这些跨膜区域的区域中的变异。跨膜区域的变异可以导入至该区域中的1处或1处以上的位置。跨膜区域的变异优选为1个或者数个氨基酸的置换、缺失、添加、插入或逆位所引起，且不伴随移码变异和无义变异的变异。“1个或者数个”优选是指1～20个，更优选是指1～10个，进一步优选是指1～5个，特别优选是指1～3个。作为跨膜区域的变异，可以举出向野生型yggb蛋白的14位的亮氨酸残基和15位的色氨酸残基之间插入1个或数个氨基酸(例如、cys-ser-leu)的变异、将100位的丙氨酸残基置换为其他氨基酸残基(例如、侧链具有羟基的氨基酸(thr、ser或tyr)、优选为thr)的变异、111位的丙氨酸残基置换为其他氨基酸残基(例如、val或侧链具有羟基的氨基酸(thr、ser或tyr)、优选为val或thr)的变异等。
[0215]
本发明中，除非有特别记载，否则“野生型yggb蛋白的x位的氨基酸残基”，是指与seq id no.16中的x位的氨基酸残基相当的氨基酸残基。氨基酸序列中的“x位”是指，从该氨基酸序列的n末端数起第x个的位置，n末端的氨基酸残基为1位的氨基酸残基。需要说明的是，氨基酸残基的位置表示的是相对位置，其绝对位置可能由于氨基酸的缺失、插入、添加等而前后变化。例如，“野生型yggb蛋白的419位的氨基酸残基”是指相当于seq id no.16中的419位的氨基酸残基的氨基酸残基，在比419位更靠近n末端侧的1个氨基酸残基缺失的情况下，以从n末端起第418个的氨基酸残基为“野生型yggb蛋白的419位的氨基酸残基”。此外，在比419位更靠近n末端侧插入了1个氨基酸残基的情况下，以从n末端起第420个的氨基酸残基为“野生型yggb蛋白的419位的氨基酸残基”。具体而言，例如，在谷氨酸棒状杆菌atcc14967株的yggb蛋白中，419～529位的氨基酸残基相当于野生型yggb蛋白的419～533位的氨基酸残基。
[0216]
在任意的yggb蛋白的氨基酸序列中，哪个氨基酸残基为“相当于seq id no.16中的x位的氨基酸残基的氨基酸残基”要通过进行该yggb蛋白的氨基酸序列与seq id no.16的氨基酸序列的对准来决定。对准例如可以通过公知的基因解析软件进行。作为具体的软件，可以举出hitachi solutio ns制的dnasis、genetyx(
ゼネティックス
)制的genetyx等(elizabeth c.tyler et al.,computers and biomedical research,24(1),72-96,1991；ba rton gj et al.,journal of molecular biology,198(2),327-37.1987)。
[0217]
变异型yggb基因可以通过以使得野生型yggb基因具有上述“特定的变异”的方式进行修饰而取得。dna的修饰可以通过公知的手法进行。具体而言，例如，作为向dna的目标位点导入目标变异的位点特异性变异法，可以举出使用pcr的方法(higuchi,r.,61,in pcr technology,erlich,h.a.ed s.,stockton press(1989)；carter,p.,meth.in enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(kramer,w.and frits,h.j.,meth.in enzymol.,154,350(1987)；kunkel,t.a.et al.,meth.in enzymol.,154,367(1987))。此外，变异型yggb基因也可以通过化学合成而取得。
[0218]
以使其具有变异型yggb基因的方式修饰细菌可以通过将变异型yggb基因导入至细菌中而达成。此外，以使其具有变异型yggb基因的方式修饰细菌还可以通过以自然变异或变异原处理向细菌所具有的yggb基因中导入变异而达成。
[0219]
需要说明的是，就赋予或增强l-谷氨酸的生产能力的方法而言，可能对赋予或增
强以l-谷氨酸为中间体而生物合成的l-氨基酸(例如，l-谷氨酰胺、l-脯氨酸、l-精氨酸、l-瓜氨酸、l-鸟氨酸)的生产能力也是有效的。即，具有这些以l-谷氨酸为中间体而生物合成的l-氨基酸的生产能力的细菌可以适宜具有如上所述的l-谷氨酸生产菌所具有的性质。例如，具有这些以l-谷氨酸为中间体而生物合成的l-氨基酸的生产能力的细菌可以以使得α-酮戊二酸脱氢酶和/或琥珀酸脱氢酶的活性降低的方式进行修饰。
[0220]
《l-谷氨酰胺生产菌》
[0221]
作为用于赋予或增强l-谷氨酰胺生产能力的方法，例如，可以举出以使得选自l-谷氨酰胺生物合成系酶中的1种或1种以上的酶的活性增大的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，无特别限制，可以举出谷氨酸脱氢酶(gdha)、谷氨酰胺合成酶(glna)。需要说明的是，谷氨酰胺合成酶的活性也可以通过谷氨酰胺腺苷酰转移酶基因(glne)的破坏、pii控制蛋白质基因(glnb)的破坏而增强(ep1229121)。
[0222]
此外，作为用于赋予或增强l-谷氨酰胺生产能力的方法，例如，还可以举出以使得选自催化从l-谷氨酰胺的生物合成途径中分支出来而生成l-谷氨酰胺以外的化合物的反应的酶中的1种或1种以上的酶的活性降低的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，无特别限制，可以举出谷氨酰胺酶。
[0223]
作为l-谷氨酰胺生产菌或用于进行诱导的亲本株，具体而言，例如，可以举出使谷氨酸脱氢酶(gdha)和/或谷氨酰胺合成酶(glna)的活性增强了的棒状细菌(ep1229121,ep1424398)、谷氨酰胺酶活性降低了的棒状细菌(日本特开2004-187684)。
[0224]
此外，关于棒状细菌，作为赋予或增强l-谷氨酰胺生产能力的方法，可以举出赋予6-重氮-5-氧代-正亮氨酸抗性的方法(日本特开平3-232497)、赋予嘌呤类似物抗性以及蛋氨酸亚砜抗性的方法(日本特开昭61-202694)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(日本特开昭56-151495)。作为具有l-谷氨酰胺生产能力的棒状细菌，具体而言，例如，可以举出以下的菌株。
[0225]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj11573(ferm p-5492；日本特开昭56-151495)
[0226]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj11576(ferm bp-10381；日本特开昭56-151495)
[0227]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj12212(ferm p-8123；日本特开昭61-202694)
[0228]
《l-脯氨酸生产菌》
[0229]
作为用于赋予或增强l-脯氨酸生产能力的方法，例如，可以举出以使得选自l-脯氨酸生物合成系酶中的1种或1种以上的酶的活性增大的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，可以举出谷氨酸-5-激酶(prob)、γ-谷氨酰-磷酸还原酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶(puta)。酶活性的增强中，例如，可以优选地使用编码基于l-脯氨酸的反馈抑制被解除了的谷氨酸-5-激酶的prob基因(德国专利第3127361号)。
[0230]
此外，作为用于赋予或增强l-脯氨酸生产能力的方法，例如，可以举出以使得参与l-脯氨酸分解的酶的活性降低的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，可以举出脯氨酸脱氢酶、鸟氨酸氨基转移酶。
[0231]
《l-精氨酸生产菌》
[0232]
作为用于赋予或增强l-精氨酸生产能力的方法，例如，可以举出以使得选自l-精氨酸生物合成系酶中的1种或1种以上的酶的活性增大的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，无特别限制，可以举出n-乙酰基谷氨酸合酶(ar ga)、n-乙酰基谷氨酸激酶(argb)、n-乙
酰基谷氨酰磷酸还原酶(argc)、乙酰基鸟氨酸转氨酶(argd)、乙酰基鸟氨酸脱乙酰酶(arge)、鸟氨酸氨基甲酰基转移酶(argf,argi)、精氨琥珀酸合酶(argg)、精氨琥珀酸裂解酶(argh)、鸟氨酸乙酰基转移酶(argj)、氨基甲酰基磷酸合酶(carab)。作为n-乙酰基谷氨酸合酶(arga)基因，例如，可以优选使用编码相当于野生型的15位～19位的氨基酸残基被置换并且基于l-精氨酸的反馈抑制被解除了的变异型n-乙酰基谷氨酸合酶的基因(ep1170361a)。
[0233]
此外，作为l-精氨酸生产菌或用于进行诱导的亲本株，还可以举出使作为精氨酸阻遏蛋白的argr缺损了的菌株(us2002-0045223a)、使细胞内的谷氨酰胺合成酶活性上升了的菌株(us2005-0014236a)等棒状细菌。
[0234]
此外，作为l-精氨酸生产菌或用于进行诱导的亲本株，还可以举出具有针对氨基酸类似物等的抗性的棒状细菌的变异株。作为这样的菌株，例如，可以举出在2-噻唑丙氨酸抗性的基础上，具有l-组氨酸、l-脯氨酸、l-苏氨酸、l-异亮氨酸、l-蛋氨酸或l-色氨酸需求性的菌株(日本特开昭54-44096)；对酮丙二酸、氟丙二酸或单氟乙酸具有抗性的菌株(日本特开昭57-18989)；对精氨醇具有抗性的菌株(特公昭62-24075)；对x-胍(x为脂肪链或其衍生物)具有抗性的菌株(日本特开平2-186995)；对精氨酸异羟肟酸酯以及6-氮杂尿嘧啶具有抗性的菌株(日本特开昭57-150381)。作为具有l-精氨酸生产能力的棒状细菌的具体例，可以举出如下所述的菌株。
[0235]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj11169(ferm bp-6892)
[0236]
谷氨酸棒状杆菌(乳糖发酵短杆菌)aj12092(ferm bp-6906)
[0237]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj11336(ferm bp-6893)
[0238]
谷氨酸棒状杆菌(黄色短杆菌)aj11345(ferm bp-6894)
[0239]
谷氨酸棒状杆菌(乳糖发酵短杆菌)aj12430(ferm bp-2228)
[0240]
《l-瓜氨酸生产菌和l-鸟氨酸生产菌》
[0241]
l-瓜氨酸和l-鸟氨酸是l-精氨酸生物合成途径中的中间体。因此，作为用于赋予或增强l-瓜氨酸和/或l-鸟氨酸的生产能力的方法，例如，可以举出以使得选自l-精氨酸生物合成系酶中的1种或1种以上的酶的活性增大的方式修饰细菌的方法。作为这样的酶，无特别限制，关于l-瓜氨酸，可以举出n-乙酰基谷氨酸合酶(arga)、n-乙酰基谷氨酸激酶(argb)、n-乙酰基谷氨酰磷酸还原酶(argc)、乙酰基鸟氨酸转氨酶(argd)、乙酰基鸟氨酸脱乙酰酶(arge)、鸟氨酸氨基甲酰基转移酶(argf,argi)、鸟氨酸乙酰基转移酶(argj)、氨基甲酰基磷酸合酶(carab)。此外，作为这样的酶，无特别限制，关于l-鸟氨酸，可以举出n-乙酰基谷氨酸合酶(arga)、n-乙酰基谷氨酸激酶(argb)、n-乙酰基谷氨酰磷酸还原酶(argc)、乙酰基鸟氨酸转氨酶(argd)、乙酰基鸟氨酸脱乙酰酶(arge)、鸟氨酸乙酰基转移酶(argj)。
[0242]
此外，l-瓜氨酸生产菌例如可以从任意的l-精氨酸生产菌出发，通过使由argg基因编码的精氨琥珀酸合酶的活性降低而容易地得到。此外，l-鸟氨酸生产菌例如可以从任意的l-精氨酸生产菌出发，通过使由argf以及argi两个基因编码的鸟氨酸氨基甲酰基转移酶的活性降低而容易地得到。
[0243]
此外，作为赋予或增强l-氨基酸生产能力的方法，例如，可以举出以使得使l-氨基酸从细菌的细胞中排出的活性增大的方式修饰细菌的方法。就使l-氨基酸排出的活性而言，例如，可以通过使编码使l-氨基酸排出的蛋白质的基因的表达上升而增大。作为编码使
各种氨基酸排出的蛋白质的基因，例如，可以举出b2682基因(ygaz)、b2683基因(ygah)、b1242基因(yche)、b3434基因(yhgn)(日本特开2002-300874)。
[0244]
此外，作为赋予或增强l-氨基酸生产能力的方法，例如，可以举出以使得参与糖代谢的蛋白质、参与能量代谢的蛋白质的活性增大的方式修饰细菌的方法。
[0245]
作为参与糖代谢的蛋白质，可以举出参与糖的摄入的蛋白质、解糖系酶。作为编码参与糖代谢的蛋白质的基因，可以举出葡萄糖6-磷酸异构酶基因(pg i；wo01/02542)、丙酮酸羧化酶基因(pyc；wo99/18228,ep1092776a)、磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm；wo03/04598)、果糖二磷酸醛缩酶基因(pfkb,fbp；wo03/04664)、转醛缩酶基因(talb；wo03/008611)、富马酸酶基因(fum；wo 01/02545)、non-pts蔗糖摄入基因(csc；ep1149911a)、蔗糖同化性基因(scra b操纵子；美国专利第7179623号)。
[0246]
作为编码参与能量代谢的蛋白质的基因，可以举出转氢酶基因(pntab；美国专利第5830716号)、细胞色素bo型氧化酶(cytochrome bo type oxidase)基因(cyob；ep1070376a)。
[0247]
此外，作为用于赋予或增强l-氨基酸等有用物质的生产能力的方法，例如，还可以举出以使得磷酸酮醇酶的活性增大的方式修饰细菌的方法(wo2006/016705)。即，本发明的细菌可以是以使得磷酸酮醇酶的活性增大的方式进行了修饰。该方法特别可能对赋予或增强l-谷氨酸等谷氨酸类l-氨基酸的生产能力是有效的。作为磷酸酮醇酶，可以举出d-木酮糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶、果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶。可以使d-木酮糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶活性以及果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性中的任一者增强，也可以使这两者增强。
[0248]
d-木酮糖-5-磷酸-磷酸酮醇酶活性是指，消耗磷酸，将木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰基磷酸，放出一分子的h2o的活性。该活性可以通过goldberg,m.等的文献(methods enzymol.,9,515-520(1966))或l.meile的文献(j.bacteriol.(2001)183；2929-2936)所述的方法进行测定。作为d-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶，可以举出属于醋酸杆菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属、硫杆菌属、链球菌属、甲基球菌属、丁酸弧菌属或纤维杆菌属的细菌的d-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶；或属于念珠菌属、红酵母属、红孢子菌属、毕赤酵母属、耶氏酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、毛孢菌属或温氏菌属的酵母的d-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶。d-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和编码它的基因的具体例在wo2006/016705中有所公开。
[0249]
此外，果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性是指，消耗磷酸，将果糖6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰基磷酸，放出一分子的h2o的活性。该活性可以通过racker,e.的文献(methods enzymol.,5,276-280(1962))或l.meile的文献(j.bacteriol.(2001)183；2929-2936)所述的方法进行测定。作为果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶，可以举出属于醋酸杆菌属、双歧杆菌属、绿菌属、布鲁氏菌属、甲基球菌属或加德纳菌属的细菌的果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶；或属于红酵母属、念珠菌属、酵母属等的酵母的果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶。果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶和编码其的基因的具体例在wo2006/016705中有所公开。
[0250]
也存在单一的酶(d-木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶)保持有两种磷酸酮醇酶活性的情况。
[0251]
l-氨基酸生产菌的育种中使用的基因和蛋白质分别例如可以具有所述例示的基因和蛋白质等公知的基因和蛋白质的碱基序列和氨基酸序列。此外，l-氨基酸生产菌的育
种中使用的基因和蛋白质分别可以为所述例示的基因和蛋白质等公知的基因和蛋白质的保守变体。具体而言，例如，只要保持有原来的功能，则l-氨基酸生产菌的育种中使用的基因可以是编码具有在公知的蛋白质的氨基酸序列中，在1个或者数个位置处置换、缺失、插入或添加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的基因。对于基因和蛋白质的保守变体，可以准用后述关于靶标基因和靶标蛋白的保守变体的记载。
[0252]
《1-2》特定的性质
[0253]
本发明的细菌以使其具有特定的性质的方式进行了修饰。本发明的细菌可以通过将具有l-氨基酸生产能力的细菌修饰为具有特定的性质而取得。此外，本发明的细菌也可以通过在以使其具有特定的性质的方式对细菌进行了修饰后，赋予或增强l-氨基酸生产能力而取得。需要说明的是，本发明的细菌可以是通过以使其具有特定的性质的方式进行了修饰而获得了l-氨基酸生产能力的细菌。本发明的细菌也可以是在以使其具有特定的性质的方式进行了修饰之外，例如，适宜具有如上所述的l-氨基酸生产菌所具有的性质。用于构建本发明的细菌的修饰可以以任意的顺序进行。
[0254]
通过以使其具有特定的性质的方式修饰细菌，可以使细菌的l-氨基酸生产能力提高，即可以使基于该细菌的l-氨基酸生产增大。作为“l-氨基酸生产的增大”，可以举出在l-氨基酸的培养基中的积蓄量的提高(增大)。
[0255]
作为特定的性质，可以举出使细胞内的草酰乙酸(oaa)池增大的修饰。“细胞内的草酰乙酸(oaa)池增大”是指，细胞内的草酰乙酸(oaa)的积蓄量增大。
[0256]
此外，作为特定的性质，可以举出使经由磷酸酮醇酶途径(phosphoketola se pathway)的碳源的利用性提高的修饰。“经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高”是指，磷酸酮醇酶途径的通量(即，经由磷酸酮醇酶途径的碳源的代谢量)增大并且/或者可能从经由磷酸酮醇酶途径而被代谢的碳源中生成的副产物的积蓄量降低。作为副产物，可以举出乙酸。乙酸例如可以通过磷酸酮醇酶途径的通量的增大而积蓄。作为使经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高的修饰，可以举出使磷酸酮醇酶途径的通量增大的修饰、使乙酸的同化性提高的修饰。
[0257]
此外，作为特定的性质，可以举出以下的(a)～(e)的修饰：
[0258]
(a)乙酸激酶(acetate kinase)的活性增大的修饰；
[0259]
(b)果糖-1,6-双磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase)的活性增大的修饰；
[0260]
(c)丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)的活性降低的修饰；
[0261]
(d)天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase)的活性降低的修饰；
[0262]
(e)苹果酸酶(malic enzyme)的活性降低的修饰。
[0263]
所述(d)和(e)的修饰可以是使细胞内的草酰乙酸(oaa)池增大的修饰的一个例子。所述(a)、(b)和(c)的修饰可以是使经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高的修饰的一个例子。所述(a)和(c)的修饰具体而言可以是使乙酸的同化性提高的修饰的一个例子。所述(b)的修饰具体而言可以是使磷酸酮醇酶途径的通量增大的修饰的一个例子。
[0264]
本发明的细菌可以具有选自所述例示的性质中的1种或1种以上的性质。
[0265]
本发明的细菌例如可以具有使细胞内的草酰乙酸(oaa)池增大的修饰和/或使经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高的修饰。本发明的细菌例如，可以至少具有使经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高的修饰。即，具体而言，就本发明的细菌而言，例如，在
使细胞内的草酰乙酸(oaa)池增大的修饰和使经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高的修饰中，可以仅具有使经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高的修饰，也可以具有使经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高的修饰和使细胞内的草酰乙酸(oaa)池增大的修饰的组合。
[0266]
本发明的细菌例如可以具有使细胞内的草酰乙酸(oaa)池增大的修饰、使磷酸酮醇酶途径的通量增大的修饰、和/或使乙酸的同化性提高的修饰。本发明的细菌例如可以至少具有使乙酸的同化性提高的修饰。即，具体而言，本发明的细菌例如可以在使细胞内的草酰乙酸(oaa)池增大的修饰、使磷酸酮醇酶途径的通量增大的修饰和使乙酸的同化性提高的修饰中，仅具有使乙酸的同化性提高的修饰，也可以具有使乙酸的同化性提高的修饰、使细胞内的草酰乙酸(oaa)池增大的修饰和/或使磷酸酮醇酶途径的通量增大的修饰的组合。
[0267]
本发明的细菌例如可以具有选自所述(a)～(e)的修饰中的1种或1种以上，例如，可以具有1种、2种、3种、4种或5种全部的修饰。本发明的细菌具体而言，例如可以举出(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(a)+(b)、(a)+(c)、(a)+(d)、(a)+(e)、(b)+(c)、(b)+(d)、(b)+(e)、(c)+(d)、(c)+(e)、(d)+(e)、(a)+(b)+(c)、(a)+(b)+(d)、(a)+(b)+(e)、(a)+(c)+(d)、(a)+(d)+(e)、(b)+(c)+(d)、(b)+(c)+(e)、(b)+(d)+(e)、(c)+(d)+(e)、(a)+(b)+(c)+(d)、(a)+(b)+(c)+(e)、(a)+(b)+(d)+(e)、(a)+(c)+(d)+(e)、(b)+(c)+(d)+(e)、(a)+(b)+(c)+(d)+(e)的修饰。“(a)+(b)的修饰”是指(a)的修饰与(b)的修饰的组合。该说明也可以准用于其他的组合。本发明的细菌例如可以至少具有所述(a)的修饰。即，具体而言，本发明的细菌例如可以在所述(a)～(e)的修饰中，仅具有所述(a)的修饰，也可以具有所述(a)的修饰和选自所述(b)～(e)的修饰中的1种或1种以上、例如1种、2种、3种或4种全部的修饰的组合。此外，本发明的细菌例如可以至少具有所述(b)的修饰。
[0268]“天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase)”可以是指，具有催化天冬氨酸和/或谷氨酸的氨基转移反应的活性的蛋白质(例如，ec 2.6.1.1)。该活性也称为“天冬氨酸转氨酶活性。”具体而言，天冬氨酸转氨酶活性可以是催化使l-天冬氨酸和α-酮戊二酸转化为草酰乙酸和l-谷氨酸的反应和/或其逆反应的活性。也将天冬氨酸转氨酶称为“谷氨酸草酰乙酸转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase)。”编码天冬氨酸转氨酶的基因也称为“天冬氨酸转氨酶基因”。作为天冬氨酸转氨酶基因，可以举出aspt基因。修饰的细菌所具有的aspt基因等天冬氨酸转氨酶基因的碱基序列和由它们编码的aspt蛋白等天冬氨酸转氨酶的氨基酸序列例如可以从ncbi等公开数据库处取得。谷氨酸棒状杆菌atcc 13869的aspt基因(cgbl_0102840)的碱基序列和该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如seq id no.1和2所示。
[0269]“苹果酸酶(malic enzyme)”可以是指，具有催化苹果酸的氧化的脱碳酸反应的活性的蛋白质(例如，ec ec 1.1.1.38、ec 1.1.1.39或ec 1.1.1.40)。也将该活性称为“苹果酸酶活性。”具体而言，苹果酸酶活性可以是在电子受体的存在下催化使苹果酸脱碳酸而生成丙酮酸的反应的活性。作为电子受体，可以举出nad
+
、nadp
+
。苹果酸酶至少能够利用1个电子受体即可。苹果酸酶可以进一步具有催化草酰乙酸的脱碳酸反应(具体而言，是将草酰乙酸转化为丙酮酸和二氧化碳的反应)的活性。苹果酸酶也称为“苹果酸脱氢酶(malat e dehydrogenase)”。编码苹果酸酶的基因也称为“苹果酸酶基因”。作为苹果酸酶基因，可以举出male基因。修饰的细菌所具有的male基因等苹果酸酶基因的碱基序列和由它们编码的
male蛋白等苹果酸酶的氨基酸序列例如可以从ncbi等公开数据库处取得。谷氨酸棒状杆菌atcc 13869的male基因(cg bl_0129850)的碱基序列和该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如seq id no.3和4所示。
[0270]“丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)”可以是指，具有催化丙酮酸的氧化的脱碳酸反应的活性的蛋白质(例如，ec 1.2.5.1)。也将该活性称为“丙酮酸脱氢酶活性”。具体而言，丙酮酸脱氢酶活性可以是在电子受体的存在下催化使丙酮酸脱碳酸而生成乙酸的反应的活性。作为电子受体，可以举出泛醌等醌。丙酮酸脱氢酶可以至少能够利用1个电子受体即可。编码丙酮酸脱氢酶的基因也称为“丙酮酸脱氢酶基因”。作为丙酮酸脱氢酶基因，可以举出poxb基因。修饰的细菌所具有的poxb基因等丙酮酸脱氢酶基因的碱基序列和由它们编码的poxb蛋白等丙酮酸脱氢酶的氨基酸序列例如可以从ncbi等公开数据库处取得。谷氨酸棒状杆菌atcc 13869的poxb基因(cgbl_0125410)的碱基序列和该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如seq id no.5和6所示。
[0271]“乙酸激酶(acetate kinase)”可以是指，具有催化乙酸的磷酸化反应的活性的蛋白质(例如，ec 2.7.2.1)。也将该活性称为“乙酸激酶活性”。具体而言，乙酸激酶活性可以是在磷酸基供体的存在下催化将乙酸磷酸化而生成乙酰基磷酸的反应的活性。作为磷酸基供体，可以举出atp。乙酸激酶至少能够利用1个磷酸基供体即可。编码乙酸激酶的基因也称为“乙酸激酶基因”。作为乙酸激酶基因，可以举出ack基因。作为ack基因等乙酸激酶基因，可以举出属于棒状细菌、肠杆菌科的细菌等各种生物的基因。作为ack基因，具体而言，可以举出谷氨酸棒状杆菌、e.coli的ack基因。各种生物的ack基因等乙酸激酶基因的碱基序列和由它们编码的ack蛋白等乙酸激酶的氨基酸序列例如可以从ncbi等公开数据库处取得。谷氨酸棒状杆菌atcc 13869的ack基因(cgbl_0126910)的碱基序列和该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如seq id no.7和8所示。e.coli mg1655的ack基因的碱基序列和该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如seq id no.9和10所示。
[0272]“果糖-1,6-双磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase)”可以是指，具有催化果糖-1,6-双磷酸的脱磷酸化反应的活性的蛋白质(例如，ec 3.1.3.11)。也将该活性称为“果糖-1,6-双磷酸酶活性”。具体而言，果糖-1,6-双磷酸酶活性可以是催化将果糖-1,6-双磷酸转化为果糖-6-磷酸的反应的活性。编码果糖-1,6-双磷酸酶的基因也称为“果糖-1,6-双磷酸酶基因”。作为果糖-1,6-双磷酸酶基因，可以举出glpx基因。作为glpx基因等果糖-1,6-双磷酸酶基因，可以举出属于棒状细菌、肠杆菌科的细菌等各种生物的基因。作为glpx基因，具体而言，可以举出谷氨酸棒状杆菌、e.coli的glpx基因。各种生物的glpx基因等果糖-1,6-双磷酸酶基因的碱基序列和由它们编码的glpx蛋白等果糖-1,6-双磷酸酶的氨基酸序列例如可以从ncbi等公开数据库处取得。谷氨酸棒状杆菌atc c 13032的glpx基因(ncgl0976)的碱基序列和该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如seq id no.11和12所示。e.coli mg1655的glpx基因的碱基序列和该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如seq id no.13和14所示。
[0273]
关于使蛋白质的活性降低的手法，在后详述。就蛋白质的活性而言，例如，可以通过使编码该蛋白质的基因的表达降低或通过破坏该基因，来使其降低。这样的使蛋白质的活性降低的手法可以单独使用，或适宜组合使用。
[0274]
关于使蛋白质的活性增大的手法，在后详述。就蛋白质的活性而言，例如，可以通
过使编码该蛋白质的基因的表达上升而使其增大。就基因的表达而言，例如，可以通过提高基因的拷贝数或通过对基因的表达调节序列进行修饰，而使其上升。这样的使蛋白质的活性增大的手法可以单独使用，或适宜组合使用。
[0275]
也将在特定的性质中，活性降低或增大的蛋白质总称为“靶标蛋白”。也将编码靶标蛋白的基因总称为“靶标基因”。
[0276]
靶标基因例如可以是具有所述例示的靶标基因的碱基序列(例如，seq id no.1、3、5、7、9、11或13所示的碱基序列)的基因。此外，靶标蛋白例如可以是具有所述例示的靶标蛋白的氨基酸序列(例如，seq id no.2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列)的蛋白质。需要说明的是，除非有特别记载，否则“具有(氨基酸或碱基)序列”这一表达是指“包含该(氨基酸或碱基)序列”，也包含“由该(氨基酸或碱基)序列构成”的情况。
[0277]
只要保持有原来的功能，则靶标基因可以为所述例示的靶标基因(例如，具有seq id no.1、3、5、7、9、11或13所示的碱基序列的基因)的变体。同样地，只要保持有原来的功能，则靶标蛋白可以为所述例示的靶标蛋白(例如，具有seq id no.2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列的蛋白质)的变体。需要说明的是，有时也将这样的保持原来的功能的变体称为“保守变体”。“aspt基因”、“male基因”、“poxb基因”、“ack基因”和“glpx基因”这样的用语分别在所述例示的aspt基因、male基因、poxb基因、ack基因和glpx基因之外，还包含它们的保守变体。同样地，“aspt蛋白”、“male蛋白”、“poxb蛋白”、“ack蛋白”和“glpx蛋白”这样的用语分别在所述例示的aspt蛋白、male蛋白、poxb蛋白、ack蛋白和glpx蛋白之外，还包含它们的保守变体。作为保守变体，例如，可以举出所述例示的靶标基因、靶标蛋白的同源物(homolo g)或人工修饰体。
[0278]“保持有原来的功能”可以是指，基因或蛋白质的变体具有与原来的基因或蛋白质的功能(例如活性、性质)对应的功能(例如活性、性质)。关于基因的“保持有原来的功能”可以是指，基因的变体编码保持原来的功能的蛋白质。即，关于各靶标基因的“保持有原来的功能”可以是指，基因的变体编码具有各靶标蛋白的活性的蛋白质：就天冬氨酸转氨酶而言为天冬氨酸转氨酶活性；就苹果酸酶而言为苹果酸酶活性；就丙酮酸脱氢酶而言为丙酮酸脱氢酶活性；就乙酸激酶而言为乙酸激酶活性；就果糖-1,6-双磷酸酶而言为果糖-1,6-双磷酸酶活性。此外，关于各靶标蛋白的“保持有原来的功能”可以是指，蛋白质的变体具有各靶标蛋白的活性：就天冬氨酸转氨酶而言为天冬氨酸转氨酶活性；就苹果酸酶而言为苹果酸酶活性；就丙酮酸脱氢酶而言为丙酮酸脱氢酶活性；就乙酸激酶而言为乙酸激酶活性；就果糖-1,6-双磷酸酶而言为果糖-1,6-双磷酸酶活性。
[0279]
就天冬氨酸转氨酶活性而言，例如，可以通过以下方法测定：将酶与对应的基质(例如l-天冬氨酸和α-酮戊二酸)一同孵育，测定酶和基质依赖性的对应产物(例如草酰乙酸和l-谷氨酸)的生成。
[0280]
就苹果酸酶活性而言，例如，可以通过以下方法测定：在电子受体的存在下将酶与对应的基质(例如苹果酸)一同孵育，测定酶和基质依赖性的对应产物(例如丙酮酸)的生成。
[0281]
就丙酮酸脱氢酶活性而言，例如，可以通过以下方法测定：在电子受体的存在下将酶与对应的基质(例如丙酮酸)一同孵育，测定酶和基质依赖性的对应产物(例如乙酸)的生成。
id no.1、3、5、7、9、11或13所示的碱基序列)制备的探针、例如相对于所述碱基序列的整体或一部分的互补序列，在严格条件下杂交的基因(例如dna)。“严格条件”可以是指，形成所谓的特异杂交体，而不形成非特异杂交体的条件。作为一个例子，可以举出同一性较高的dna彼此杂交，例如，具有50％以上，65％以上，80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选97％以上，特别优选99％以上的同一性的dna彼此杂交，比该同一性低的dna彼此不杂交的条件，或者以相当于作为通常的southern杂交的清洗条件的60℃、1
×
ssc、0.1％ sds，优选为60℃、0.1
×
ssc、0.1％ sd s，更优选为68℃、0.1
×
ssc、0.1％ sds的盐浓度和温度，清洗1次，优选为2～3次的条件。
[0290]
如上所述，所述杂交中使用的探针可以是基因的互补序列的一部分。这样的探针可以通过以基于公知的基因序列而制备的寡核苷酸作为引物，以包含上述的基因的dna片段作为模板的pcr而制备。例如，作为探针，可以使用300bp左右的长度的dna片段。在使用300bp左右的长度的dna片段作为探针情况下，作为杂交的清洗条件，可以举出50℃、2
×
ssc、0.1％ sds。
[0291]
此外，由于根据宿主不同，密码子的简并性也不同，因此靶标基因可以为将任意的密码子置换为与之等价的密码子的基因。即，靶标基因可以是基于遗传编码的简并的所述例示的靶标基因的变体。例如，靶标基因可以根据使用的宿主的密码子使用频率而以具有最适宜的密码子的方式进行了修饰。
[0292]
需要说明的是，氨基酸序列间的“同一性”是指，通过blastp使用默认设定的scoring parameters(matrix：blosum62；gap costs：existence＝11,exte nsion＝1；compositional adjustments：conditional compositional score matri x adjustment)算出的氨基酸序列间的同一性。此外，碱基序列间的“同一性”是指，通过blastn使用默认设定的scoring parameters(match/mismatch scores＝1,-2；gap costs＝linear)而算出的碱基序列间的同一性。
[0293]
需要说明的是，关于所述的基因、蛋白质的保守变体的记载也可以准用于l-氨基酸生物合成系酶等任意的蛋白质和编码它们的基因中。
[0294]
《1-3》使蛋白质的活性增大的手法
[0295]
以下对使蛋白质的活性增大的手法进行说明。
[0296]“蛋白质的活性增大”是指，该蛋白质的活性与非修饰株相比有所增大。“蛋白质的活性增大”是指，具体而言，该蛋白质的每细胞的活性与非修饰株相比有所增大。此处的“非修饰株”是指，未以使靶标蛋白的活性增大的方式进行修饰的对照株。作为非修饰株，可以举出野生株、亲本株。作为非修饰株，具体而言，可以举出各细菌种的基准株(type strain)。此外，作为非修饰株，具体而言，还可以举出细菌的说明中例示的菌株。即，在一个方式中，蛋白质的活性可以与基准株(即本发明的细菌所属的种的基准株)相比有所增大。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与c.glutamicum atcc 13869株相比有所增大。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与c.glutamicumatcc 13032株相比有所增大。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与c.glutamicum aj12036(ferm bp-734)相比有所增大。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与c.glutamicum ydk010株相比有所增大。需要说明的是，“蛋白质的活性增大”也称为“蛋白质的活性得到了增强”。更具体而言，“蛋白质的活性增大”可以是指，与非修饰株相比，该蛋白质的每细胞的分子数增加并且/或者该蛋白
质的每分子的功能增大。即，“蛋白质的活性增大”时的“活性”不限于蛋白质的催化活性，可以是指编码蛋白质的基因的转录量(mrna量)或翻译量(蛋白质的量)。“蛋白质的每细胞的分子数”可以是指，该蛋白质的分子数的每细胞的平均值。此外，“蛋白质的活性增大”中不仅包含使原本具有靶标蛋白的活性的菌株中该蛋白质的活性增大，还包含对原本不存在靶标蛋白的活性的菌株赋予该蛋白质的活性。此外，只要结果蛋白质的活性增大，也可以在使宿主本来具有的靶标蛋白的活性降低或消失的基础上，赋予适宜的靶标蛋白的活性。
[0297]
就蛋白质的活性增大的程度而言，只要蛋白质的活性与非修饰株相比有所增大就无特别限制。就蛋白质的活性而言，例如，可以上升至非修饰株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。此外，在非修饰株不具有靶标蛋白的活性的情况下，只要通过导入编码该蛋白质的基因，使该蛋白质生成即可，例如，可以使该蛋白质被生产到其活性可以被测定的程度。
[0298]
就使蛋白质的活性增大的修饰而言，例如，可以通过使编码该蛋白质的基因的表达上升而达成。“基因的表达上升”可以是指，该基因的表达与野生株、亲本株等非修饰株相比有所增大。具体而言，“基因的表达上升”可以是指，该基因的每细胞的表达量与非修饰株相比有所增大。“基因的每细胞的表达量”可以是指，该基因的表达量的每细胞的平均值。更具体而言，“基因的表达上升”可以是指，基因的转录量(mrna量)增大和/或基因的翻译量(蛋白质的量)增大。需要说明的是，“基因的表达上升”也称为“基因的表达得到了增强。”基因的表达例如可以上升至非修饰株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。此外，“基因的表达上升”中不仅包含在原本表达靶标基因的菌株中使该基因的表达量上升，还包含在原本不表达靶标基因的菌株中，使该基因表达。即，“基因的表达上升”例如可以是指，向不保持靶标基因的菌株中导入该基因，使该基因表达。
[0299]
就基因的表达的上升而言，例如，可以通过使基因的拷贝数增加而达成。
[0300]
基因的拷贝数的增加可以通过向宿主的染色体中导入该基因而达成。就向染色体中导入基因而言，例如，可以利用同源重组而进行(miller,j.h.ex periments in molecular genetics,1972,cold spring harbor laboratory)。作为利用同源重组的基因导入法，例如，可以举出red驱动整合(red-driven int egration)法(datsenko,k.a,and wanner,b.l.proc.natl.acad.sci.u sa.97:6640-6645(2000))等使用直链状dna的方法、使用包含温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用可以接合传递的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥功能的复制起点的自杀载体的方法、使用了噬菌体的转导(transduction)法。具体而言，可以通过用包含靶标基因的重组dna转化宿主，与宿主的染色体上的靶标位点发生同源重组，而将该基因导入至宿主的染色体上。就同源重组中使用的重组dna的结构而言，只要同源重组能够以期望的方式发生就无特别限制。例如，可以用一种包含靶标基因的线状dna转化宿主，所述线状dna是在该基因的两端分别具备与染色体上的靶标位点的上游和下游相同的碱基序列的线状dna，通过在靶标位点的上游和下游分别引起同源重组，而能够将该基因置换到靶标位点。同源重组中使用的重组dna可以具备用于选择转化子的标记基因。基因可以仅导入1个拷贝，也可以导入2个拷贝或2个拷贝以上。例如，通过以在染色体上存在多个拷贝的碱基序列作为靶标进行同源重组，可以将基因的多个拷贝导入至染色体。作为在染色体上存在多个拷贝的碱基序列，可以举出重复dna序列(repetitive dna)、存在于转座子的两端的反向重复。此外，也可以以目标物质的生产中不需要的基因等染色体上的适当的碱基序列作为靶标进行同源重组。此外，基因也可以使用转座子、mini-mu而
随机地导入至染色体上(日本特开平2-109985号公报，us5882888，ep805867b1)。需要说明的是，就这样的利用了同源重组的染色体的修饰手法而言，不限于靶标基因的导入，也可以用于表达调节序列的修饰等染色体的任意的修饰。
[0301]
就靶标基因导入至染色体上的确认而言，可以通过使用了具有与该基因的全部或一部分互补的序列的探针的southern杂交、或使用了基于该基因的序列而制备的引物的pcr等进行确认。
[0302]
此外，基因的拷贝数的增加也可以通过将包含该基因的载体导入至宿主中而达成。例如，将包含靶标基因的dna片段与在宿主中发挥功能的载体连接而构建该基因的表达载体，通过用该表达载体转化宿主，可以使该基因的拷贝数增加。就包含靶标基因的dna片段而言，例如，可以通过以具有靶标基因的微生物的基因组dna作为模板的pcr而取得。作为载体，可以使用能够在宿主的细胞内自主复制的载体。载体优选为多拷贝载体。此外，为了选择转化子，优选载体具有抗生素抗性基因等标记物。此外，载体可以具有用于使插入的基因表达的启动子、终止子。载体例如可以为来源于细菌质粒的载体、来源于酵母质粒的载体、来源于噬菌体的载体、粘粒或噬菌粒等。作为可以在棒状细菌中自主复制的载体，具体而言，例如，可以举出phm1519(agric.biol.chem.,48,2901-2903(1984))；pam330(agric.biol.chem.,48,2901-2903(1984))；对它们进行了改良的具有药剂抗性基因的质粒；pcry 30(日本特开平3-210184)；pcry21、pcry2ke、pcry2kx、pcry31、pcr y3ke和pcry3kx(日本特开平2-72876、美国专利5185262号)；pcry2和pcry3(日本特开平1-191686)；paj655、paj611和paj1844(日本特开昭58-192900)；pcg1(日本特开昭57-134500)；pcg2(日本特开昭58-35197)；pcg4和pcg11(日本特开昭57-183799)；pvk7(日本特开平10-215883)；pvk9(us 2006-0141588)；pvc7(日本特开平9-070291)；pvs7(wo2013/069634)。
[0303]
在导入基因的情况下，基因只要以可以表达的方式保持在宿主中即可。具体而言，基因只要以受到基于在宿主中发挥功能的启动子的控制而表达的方式被保持即可。就启动子而言，只要是在宿主中发挥功能的启动子就无特别限制。“在宿主中发挥功能的启动子”可以是指，在宿主中具有启动子活性的启动子。启动子可以是来源于宿主的启动子，也可以是来源于异种的启动子。启动子可以是导入的基因的固有的启动子，也可以是其他基因的启动子。作为启动子，例如，可以如后所述，使用更为强力的启动子。
[0304]
基因的下游可以配置终结转录用的终止子。就终止子而言，只要是在宿主中发挥功能的终止子就无特别限制。终止子可以是来源于宿主的终止子，也可以是来源于异种的终止子。终止子可以是导入的基因的固有终止子，也可以是其他基因的终止子。
[0305]
关于可以在各种微生物中利用的载体、启动子、终止子，例如在“微生物学基础讲座8基因工学，共立出版，1987年”中有详细的记载，可以使用它们。
[0306]
此外，在导入2种或2种以上的基因的情况下，各基因以可以表达的方式保持在宿主中即可。例如，各基因可以都保持在单一的表达载体上，也可以都保持在染色体上。此外，各基因可以分别保持在多个表达载体上，也可以分别保持在单一或多个表达载体上以及染色体上。此外，也可以以2种或2种以上的基因构成操纵子进行导入。作为“导入2种或2种以上的基因的情况，”例如，可以举出导入分别编码2种或2种以上的蛋白质(例如酶)的基因的情况、导入分别编码构成单一的蛋白质复合体(例如酶复合体)的2种或2种以上的亚基的基
因的情况、以及它们的组合。
[0307]
就导入的基因而言，只要是编码在宿主中发挥功能的蛋白质的基因就无特别限制。导入的基因可以是来源于宿主的基因，也可以是来源于异种的基因。就导入的基因而言，例如，可以使用基于该基因的碱基序列而设计的引物，以具有该基因的生物的基因组dna或搭载该基因的质粒等作为模板，通过pcr而取得。此外，导入的基因例如也可以基于该基因的碱基序列而进行全合成(gene,60(1),115-127(1987))。取得的基因可以就这样使用，或进行适宜修饰而使用。即，通过对基因进行修饰，可以取得其变体。基因的修饰可以通过公知的手法进行。例如，通过位点特异性的变异法，可以对dna的目标位点导入目标变异。即，例如，通过位点特异性的变异法，可以对基因的编码区域进行修饰，以使得编码的蛋白质在特定的位点处包含氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加。作为位点特异性的变异法，可以举出使用pcr的方法(higuchi,r.,61,in pcr technology,erlich,h.a.eds.,stocktonpress(1989)；carter,p.,meth.in enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(kramer,w.and frits,h.j.,meth.in enzymol.,154,350(1987)；kunkel,t.a.et al.,meth.in enzymol.,154,367(1987))。或者可以对基因的变体进行全合成。
[0308]
需要说明的是，在蛋白质作为包含多个亚基的复合体而发挥功能的情况下，只要作为结果，蛋白质的活性有所增大，则可以对这些多个亚基的全部进行修饰，也可以仅对一部分进行修饰。即，例如，在通过使基因的表达上升而使蛋白质的活性增大的情况下，可以使编码这些亚基的多个基因的表达全部都增强，也可以仅使一部分的表达增强。通常而言，优选使编码这些亚基的多个基因的表达全都增强。此外，就构成复合体的各亚基而言，只要复合体具有靶标蛋白的功能，则可以来源于1种生物，也可以来源于2种或2种以上的不同生物。即，例如，可以将编码多个亚基的、来源于同一生物的基因导入至宿主中，也可以将分别来源于不同生物的基因导入至宿主中。
[0309]
此外，基因的表达的上升可以通过使基因的转录效率提高而达成。此外，基因的表达的上升可以通过使基因的翻译效率提高而达成。基因的转录效率或翻译效率的提高例如可以通过表达调节序列的修饰而达成。“表达调节序列”可以是指对基因的表达产生影响的位点的总称。作为表达调节序列，例如，可以举出启动子、shine-dalgarno(sd)序列(也称为核糖体结合位点(rbs))、以及rbs与起始密码子之间的间隔区域。表达调节序列可以通过启动子检索载体、genetyx等基因解析软件来确定。这些表达调节序列的修饰例如可以通过使用了温度敏感性载体的方法、red驱动整合法(wo2005/010175)而进行。
[0310]
就基因的转录效率的提高而言，例如，可以通过将染色体上的基因的启动子置换为更为强力的启动子来达成。“更为强力的启动子”可以是指，基因的转录与原本存在的野生型的启动子相比有所提高的启动子。作为可以在棒状细菌中利用的更为强力的启动子，例如，可以举出人为地进行了设计变更的p54-6启动子(appl.microbiol.biotechnol.,53,674-679(2000))、在棒状细菌内可以以乙酸、乙醇、丙酮酸等进行诱导的pta、acea、aceb、adh、amye启动子、作为在棒状细菌内的表达量较多的强力启动子的cspb、sod、tuf(ef-tu)启动子(journal of biotechnology 104(2003)311-323,appl environ microbiol.2005dec；71(12):8587-96.)、lac启动子、tac启动子、trc启动子。此外，作为更强力的启动子，也可以通过使用各种报告基因，来取得原有的启动子的高活性型。例如，通过使启动子区域内的-35、-10区域接近共有序列，能够提高启动子的活性(国际公开第00/
18935号)。作为高活性型启动子，可以举出各种tac样启动子(katashkina ji et al.russian federation patent applicat ion 2006134574)、pnlp8启动子(wo2010/027045)。启动子的强度的评价法和强力的启动子的例子在goldstein等的论文(prokaryotic promoters in biotechn ology.biotechnol.annu.rev.,1,105-128(1995))等中有所记载。
[0311]
就基因的翻译效率的提高而言，例如，可以通过将染色体上的基因的sh ine-dalgarno(sd)序列(也称为核糖体结合位点(rbs))置换更为强力的sd序列而达成。“更为强力的sd序列”可以是指，mrna的翻译与原本存在的野生型的sd序列相比有所提高的sd序列。作为更为强力的sd序列，例如，可以举出来源于噬菌体t7的基因10的rbs(olins p.o.et al,gene,1988,73,227-235)。此外，已知rbs与起始密码子之间的间隔区域，特别是起始密码子的上游侧靠近处的序列(5
’‑
utr)中的数个核苷酸的置换或插入或缺失会对mrna的稳定性和翻译效率产生非常大的影响，也可以对它们进行修饰来使基因的翻译效率提高。
[0312]
基因的翻译效率的提高例如也可以通过密码子的修饰来达成。例如，通过将基因中存在的稀有密码子置换为以更高频率利用的同义密码子，能够使基因的翻译效率提高。即，就导入的基因而言，例如，可以进行修饰以使其根据使用的宿主的密码子使用频率而具有最适合的密码子。密码子的置换例如可以通过位点特异性变异法进行。此外，也可以全合成密码子经过置换的基因片段。各种生物中的密码子的使用频率在“密码子使用数据库”(http://ww w.kazusa.or.jp/codon；nakamura,y.et al,nucl.acids res.,28,292(2000))中有所公开。
[0313]
此外，就基因的表达的上升而言，也可以通过使得使基因的表达上升的调节子扩增，或使得使基因的表达降低的调节子缺失或弱化而达成。
[0314]
如上所述的使基因的表达上升的手法可以单独使用，也可以以任意的组合使用。
[0315]
此外，以使得蛋白质的活性增大的修饰例如也可以通过使蛋白质的比活性增强来达成。比活性的增强中也包含反馈抑制的脱敏(desensitization to fee dback inhibition)。就比活性得到了增强的蛋白质而言，例如，可以对各种生物进行探索而取得。此外，也可以向原有的蛋白质中导入变异而取得高活性型。就导入的变异而言，例如，可以是蛋白质的1个或者数个位置处的1或数个氨基酸被置换、缺失、插入和/或添加的变异。变异的导入例如可以通过如上所述的位点特异性的变异法进行。此外，变异的导入例如也可以通过突变处理进行。作为突变处理，可以举出x射线的照射、紫外线的照射以及基于n-甲基-n'-硝基-n-亚硝基胍(mnng)、甲基磺酸乙酯(ems)和甲基磺酸甲酯(mms)等变异剂的处理。此外，也可以在体外对dna直接用羟胺进行处理，诱发随机变异。比活性的增强可以单独使用，也可以与如上所述的使基因的表达增强的手法任意组合地使用。
[0316]
转化的方法无特别限定，可以使用以往已知的方法。作为转化棒状细菌的方法，可以举出原生质体法(gene,39,281-286(1985))、电穿孔法(bio/tech nology,7,1067-1070(1989))、电脉冲法(日本特开平2-207791号公报)。
[0317]
蛋白质的活性增大这一点，可以通过对该蛋白质的活性进行测定来确认。
[0318]
蛋白质的活性增大这一点，也可以通过确认编码该蛋白质的基因的表达有所上升来确认。基因的表达上升这一点，可以通过确认该基因的转录量有所上升，或确认由该基因表达的蛋白质的量有所上升来确认。
[0319]
基因的转录量上升这一点的确认，可以通过将由该基因转录的mrna的量与野生株或亲本株等非修饰株相比较来进行。作为对mrna的量进行评价的方法，可以举出northern杂交、rt-pcr、微阵列、rna-seq等(sambrook,j.,et al.,molecular cloning:a laboratory manual/third edition,cold spri ng harbor laboratory press,cold spring harbor(usa),2001)。就mrna的量(例如，每细胞的分子数)而言，例如，可以上升至非修饰株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。
[0320]
蛋白质的量上升这一点的确认，可以使用抗体通过蛋白质印迹法来进行(sambrook,j.,et al.,molecular cloning:a laboratory manual/third editio n,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor(usa),2001)。蛋白质的量(例如，每细胞的分子数)例如，可以上升至非修饰株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。
[0321]
所述使蛋白质的活性增大的手法可以用于任意的蛋白质的活性增强或任意的基因的表达增强。
[0322]
《1-4》使蛋白质的活性降低的手法
[0323]
以下将对使蛋白质的活性降低的手法进行说明。
[0324]“蛋白质的活性降低”是指，该蛋白质的活性与非修饰株相比有所降低。具体而言，“蛋白质的活性降低”是指，该蛋白质的每细胞的活性与非修饰株相比有所降低。此处的“非修饰株”是指，未以使靶标蛋白的活性降低的方式进行了修饰的对照株。作为非修饰株，可以举出野生株、亲本株。作为非修饰株，具体而言，可以举出各细菌种的基准株(type strain)。此外，作为非修饰株，具体而言，还可以举出细菌的说明中例示的菌株。即，在一个方式中，蛋白质的活性可以与基准株(即本发明的细菌所属的种的基准株)相比有所降低。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与c.glutamicum atcc 13869株相比有所降低。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与c.glutamicumatcc 13032株相比有所降低。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与c.glutamicum aj12036(ferm bp-734)相比有所降低。此外，在别的方式中，蛋白质的活性可以与c.glutamicum ydk010株相比有所降低。需要说明的是，“蛋白质的活性降低”中也包含该蛋白质的活性完全消失的情况。更具体而言，“蛋白质的活性降低”可以是指，与非修饰株相比，该蛋白质的每细胞的分子数有所降低并且/或者该蛋白质的每分子的功能有所降低。即，“蛋白质的活性降低”这一情况中的“活性”不限于蛋白质的催化剂活性，可以是指编码蛋白质的基因的转录量(mrna量)或翻译量(蛋白质的量)。“蛋白质的每细胞的分子数”可以是指，该蛋白质的分子数的每细胞的平均值。需要说明的是，“蛋白质的每细胞的分子数降低”中也包含该蛋白质完全不存在的情况。此外，“蛋白质的每分子的功能降低”中也包含该蛋白质的每分子的功能完全消失的情况。就蛋白质的活性的降低的程度而言，只要蛋白质的活性与非修饰株相比有所降低就无特别限制。蛋白质的活性例如可以降低至非修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
[0325]
就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可以通过使编码该蛋白质的基因的表达降低而达成。“基因的表达降低”是指，该基因的表达与野生株、亲本株等非修饰株相比有所降低。具体而言，“基因的表达降低”是指，该基因的每细胞的表达量与非修饰株相比有所降低。“基因的每细胞的表达量”可以是指，该基因的表达量的每细胞的平均值。更具体而言，“基因的表达降低”可以是指，基因的转录量(mrna量)降低和/或基因的翻译量(蛋白质的量)降低。“基因的表达降低”中也包含该基因完全不表达的情况。需要说明的是，“基因的
表达降低”也称为“基因的表达弱化。”基因的表达例如可以降低至非修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
[0326]
基因的表达的降低例如可以是转录效率的降低所带来的，可以是翻译效率的降低所带来的，也可以是它们的组合所带来的。就基因的表达的降低而言，例如，可以通过对基因的启动子、shine-dalgarno(sd)序列(也称为核糖体结合位点(rbs))、rbs与起始密码子之间的间隔区域等表达调节序列进行修饰而达成。在对表达调节序列进行修饰的情况下，优选表达调节序列的1个碱基以上，更优选2个碱基以上，特别优选3个碱基以上受到修饰。就基因的转录效率的降低而言，例如，可以通过将染色体上的基因的启动子置换为更弱的启动子而达成。“更弱的启动子”是指，基因的转录与原本存在的野生型的启动子相比有所弱化的启动子。作为更弱的启动子，例如，可以举出诱导型的启动子。即，诱导型的启动子在非诱导条件下(例如，不存在诱导物质的条件下)可以作为更弱的启动子而发挥功能。此外，也可以使表达调节序列的一部分或全部的区域缺失(缺损)。此外，就基因的表达的降低而言，例如，也可以通过对涉及表达控制的因子进行操作而达成。作为涉及表达控制的因子，可以举出涉及转录、翻译控制的低分子(诱导物质、抑制物质等)、蛋白质(转录因子等)、核酸(sirna等)等。此外，就基因的表达的降低而言，例如，也可以通过向基因的编码区域中导入使基因的表达降低的变异而达成。例如，通过将基因的编码区域的密码子置换为在宿主中以更低的频率被使用的同义密码子，可以使基因的表达降低。此外，例如，也可以通过如后所述的基因的破坏，使基因的表达本身降低。
[0327]
此外，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可以通过破坏编码该蛋白质的基因来达成。“基因被破坏”是指，以使得不产生正常发挥功能的蛋白质的方式对该基因进行修饰。“不产生正常发挥功能的蛋白质”中包含：从该基因中完全不产生蛋白质的情况、由该基因中产生每分子的功能(例如活性、性质)降低或消失了的蛋白质的情况。
[0328]
就基因的破坏而言，例如，可以通过使染色体上的基因缺失(缺损)而达成。“基因的缺失”是指，基因的编码区域的一部分或全部的区域的缺失。进一步而言，也可以连同染色体上的基因的编码区域的前后的序列，使基因整体缺失。基因的编码区域的前后的序列中，例如，可以包含基因的表达调节序列。只要能够达成蛋白质的活性的降低，使之缺失的区域可以为n末端区域(编码蛋白质的n末端侧的区域)、内部区域、c末端区域(编码蛋白质的c末端侧的区域)等任一区域。通常，使之缺失的区域越长，则更能够可靠地使基因失活。使之缺失的区域例如可以为基因的编码区域全长的10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上的长度的区域。此外，就使之缺失的区域的前后的序列而言，优选阅读框不一致。通过阅读框的不一致，可使缺失的区域的下游发生移码。
[0329]
此外，就基因的破坏而言，例如，也可以通过向染色体上的基因的编码区域中导入氨基酸置换(错义变异)、导入终止密码子(无义变异)或导入1～2个碱基的添加或缺失(移码变异)等来达成(journal of biological chemistry 272:8611-8617(1997),proceedings of the national academy of sciences,usa 95 5511-5515(1998),journal of biological chemistry 26 116,20833-20839(1991))。
[0330]
此外，就基因的破坏而言，例如，也可以通过向染色体上的基因的编码区域中插入其他碱基序列来达成。插入位点可以为基因的任一区域，插入的碱基序列越长则更能够可
靠地使基因失活。此外，就插入位点的前后的序列而言，优选阅读框不一致。通过阅读框的不一致，可使插入位点的下游发生移码。作为其他碱基序列，只要使编码的蛋白质的活性降低或消失就无特别限制，例如，可以举出抗生素抗性基因等标记基因、对目标物质的生产有用的基因。
[0331]
就基因的破坏而言，特别可以以使编码的蛋白质的氨基酸序列缺失(缺损)的方式实施。换言之，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可以通过使蛋白质的氨基酸序列(氨基酸序列的一部分或全部的区域)缺失，具体而言，以使其编码氨基酸序列(氨基酸序列的一部分或全部的区域)缺失了的蛋白质的方式对基因进行修饰，而达成。需要说明的是，“蛋白质的氨基酸序列的缺失”是指，蛋白质的氨基酸序列的一部分或全部的区域的缺失。此外，“蛋白质的氨基酸序列的缺失”是指，蛋白质中原来的氨基酸序列变得不存在，也包含原来的氨基酸序列变化为其他氨基酸序列的情况。即，例如，由于移码而变化为其他氨基酸序列的区域可以视为缺失了的区域。通过蛋白质的氨基酸序列的缺失，典型而言，蛋白质的全长会缩短，也存在蛋白质的全长不变化或延长的情况。例如，可以通过基因的编码区域的一部分或全部的区域的缺失，而使得编码的蛋白质的氨基酸序列中，该缺失了的区域编码的区域缺失。此外，例如，通过向基因的编码区域中导入终止密码子，能够使编码的蛋白质的氨基酸序列中，该导入位点下游的区域编码的区域缺失。此外，例如，通过基因的编码区域中的移码，能够使该移码位点编码的区域缺失。关于氨基酸序列的缺失中的使之缺失的区域的位置和长度，可以准用基因的缺失中的使之缺失的区域的位置和长度的说明。
[0332]
就对染色体上的基因以所述的方式进行修饰而言，例如，可以制备以使其不产生正常发挥功能的蛋白质的方式进行了修饰的破坏型基因，用包含该破坏型基因的重组dna转化宿主，使破坏型基因与染色体上的野生型基因发生同源重组，将染色体上的野生型基因置换为破坏型基因而达成。此时，重组dna中，如果根据宿主的营养缺陷型等性状而包含标记基因，则容易操作。作为破坏型基因，可以举出使基因的编码区域的一部分或全部的区域缺失了的基因、导入了错义变异的基因、导入了无义变异的基因、导入了移码变异的基因、插入了转座子、标记基因等插入序列的基因。由破坏型基因编码的蛋白质即使生成，也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，功能降低或消失。就同源重组中使用的重组dna的结构而言，只要以期望的方式引起同源重组就无特别限制。例如，用一种包含破坏型基因的线状dna转化宿主，所述线状dna为两端分别具备染色体上的野生型基因的上游和下游的序列的线状d na，在野生型基因的上游和下游分别引起同源重组，由此能够将野生型基因置换为破坏型基因。这样的基于利用同源重组的基因置换的基因破坏方法已经被确立，有被称为“red驱动整合(red-driven integration)”的方法(datsenko,k.a,and wanner,b.l.proc.natl.acad.sci.u s a.97:6640-6645(2000))、red驱动整合法与来源于λ噬菌体的切出系统(cho,e.h.,gumport,r.i.,gardner,j.f.j.bacteriol.184:5200-5203(2002))组合的方法(参wo2005/010175号)等使用直链状dna的方法、使用包含温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用可以接合传递的质粒的方法、使用不包含在宿主内发挥功能的复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号，日本特开平05-007491号)。需要说明的是，就这样的利用同源重组的染色体的修饰手法而言，不限于靶标基因的破坏，也可以用于表达调节序列的修饰等染色体的任意的修饰。
[0333]
此外，就使蛋白质的活性降低的修饰而言，例如，可以通过突变处理进行。作为突
变处理，可以举出x射线的照射、紫外线的照射以及基于n-甲基-n'-硝基-n-亚硝基胍(mnng)、甲基磺酸乙酯(ems)和甲基磺酸甲酯(mms)等变异剂的处理。
[0334]
需要说明的是，在蛋白质作为包含多个亚基的复合体而发挥功能的情况下，只要作为结果，蛋白质的活性降低，则可以对这些多个亚基全都进行修饰，也可以仅对一部分进行修饰。即，例如，可以将编码这些亚基的多个基因的全部破坏等，也可以仅破坏一部分等。此外，在蛋白质存在多个同工酶的情况下，只要作为结果，蛋白质的活性降低，则可以使多个同工酶的活性全部降低，也可以仅使一部分的活性降低。即，例如，可以使编码这些同工酶的多个基因的全部破坏等，也可以仅破坏一部分等。
[0335]
如上所述的使蛋白质的活性降低的手法可以单独使用，也可以以任意的组合使用。
[0336]
蛋白质的活性降低这一点，可以通过测定该蛋白质的活性来确认。
[0337]
蛋白质的活性降低这一点，也可以通过确认编码该蛋白质的基因的表达降低来确认。基因的表达降低这一点，可以通过确认该基因的转录量降低或确认由该基因表达的蛋白质的量降低，来进行确认。
[0338]
就基因的转录量降低这一点的确认而言，可以通过将由该基因转录的mr na的量与非修饰株相比较而进行。作为对mrna的量进行评价的方法，可以举出northern杂交、rt-pcr、微阵列、rna-seq等(sambrook,j.,et al.,molecular cloning:a laboratory manual/third edition,cold spring harborlaboratory press,cold spring harbor(usa),2001)。mrna的量(例如，每细胞的分子数)例如可以降低至非修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
[0339]
蛋白质的量降低这一点的确认，可以使用抗体通过蛋白质印迹法来进行(sambrook,j.,et al.,molecular cloning:a laboratory manual/third editio n,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor(usa),2001)。蛋白质的量(例如，每细胞的分子数)例如可以降低至非修饰株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。
[0340]
基因被破坏这一点，可以根据用于破坏的手段，通过确定该基因的一部分或全部的碱基序列、限制酶图谱或全长等来确认。
[0341]
所述的使蛋白质的活性降低的手法可以用于任意的蛋白质的活性降低、任意的基因的表达降低。
[0342]
《2》本发明的l-氨基酸的制造方法
[0343]
本发明的方法是l-氨基酸的制造方法，其包含：用培养基培养本发明的细菌，使l-氨基酸积蓄在该培养基中和/或该细菌的菌体内；以及从所述培养基和/或所述菌体中采集所述l-氨基酸。关于l-氨基酸，如上所述。本发明中，可以制造1种l-氨基酸，也可以制造2种或2种以上的l-氨基酸。
[0344]
就使用的培养基而言，只要本发明的细菌能够增殖，目标l-氨基酸能够生产，就无特别限制。作为培养基，例如，可以使用棒状细菌等细菌的培养中使用的通常的培养基。作为培养基，例如，可以使用根据需要而含有选自碳源、氮源、磷酸源、硫源、其它各种有机成分或无机成分中的成分的培养基。培养基成分的种类、浓度可以根据使用的细菌的种类等各种条件而适宜设定。
[0345]
作为碳源，具体而言，例如，可以举出葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、废糖蜜、淀粉水解物、生物质的水解物等糖类、乙酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类、甘油、粗甘油、乙醇等醇类、脂肪酸类。作为碳源，特别可以举出糖类。作为碳源，可以进一步特别举出葡萄糖、果糖。葡萄糖、果糖等糖类可以单独使用，或与其他碳源组合，而作为碳源使用。作为碳源，例如，可以使用以果糖作为构成糖的糖。作为以果糖作为构成糖的糖，可以举出果糖、蔗糖、果寡糖。以果糖作为构成糖的糖可以单独使用，或与其他的碳源组合，而作为碳源使用。需要说明的是，作为碳源，可以适宜使用来源于植物的原料。作为植物，例如，可以举出玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜根、棉花。作为来源于植物的原料，例如，可以举出根、茎、干、枝、叶、花、种子等器官、包含它们的植物体、它们的植物器官的分解产物。来源于植物的原料的利用形态无特别限制，例如，可以利用未加工品、榨汁、粉碎物、纯化物等任一形态。此外，就木糖等戊糖、葡萄糖等己糖或它们的混合物而言，例如，可以从植物生物物质中取得并利用。具体而言，这些糖类可以通过将植物生物物质供至水蒸气处理、浓酸水解、稀酸水解、基于纤维素酶等酶的水解、碱处理等处理而取得。需要说明的是，半纤维素比一般的纤维素更易于水解，因此也可以使植物生物物质中的半纤维素预先水解而使戊糖游离，接下来，使纤维素水解而生成己糖。此外，就木糖而言，例如，可以使本发明的细菌保有从葡萄糖等己糖到木糖的转化途径，通过从己糖出发的转化而进行供给。作为碳源，可以使用1种碳源，也可以将2种或2种以上的碳源组合使用。
[0346]
作为氮源，具体而言，例如，可以举出硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、大豆蛋白质分解物等有机氮源、氨、尿素。也可以将ph调节中使用的氨气、氨水作为氮源利用。作为氮源，可以使用1种氮源，也可以将2种或2种以上的氮源组合使用。
[0347]
作为磷酸源，具体而言，例如，可以举出磷酸2氢钾、磷酸氢2钾等磷酸盐、焦磷酸等磷酸聚合物。作为磷酸源，可以使用1种磷酸源，也可以将2种或2种以上的磷酸源组合使用。
[0348]
作为硫源，具体而言，例如，可以举出硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合物、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸。作为硫源，可以使用1种硫源，也可以将2种或2种以上的硫源组合使用。
[0349]
作为其它各种有机成分或无机成分，具体而言，例如，可以举出氯化钠、氯化钾等无机盐类；铁、锰、镁、钙等微量金属类；维生素b1、维生素b2、维生素b6、烟酸、烟酸酰胺、维生素b12等维生素类；氨基酸类；核酸类；含有它们的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白质分解物等有机成分。作为其它各种有机成分或无机成分，可以使用1种成分，也可以将2种或2种以上的成分组合使用。
[0350]
此外，在使用增殖时需要氨基酸等的营养缺陷型变异株的情况下，优选向培养基中补添所要求的营养素。
[0351]
此外，优选限制培养基中的生物素量、向培养基中添加表面活性剂或青霉素。
[0352]
就培养条件而言，只要本发明的细菌能够增殖，能够生产目标l-氨基酸，就无特别限制。培养例如可以在棒状细菌等细菌的培养中使用的通常的条件下进行。培养条件可以根据使用的细菌的种类等各种条件而适宜设定。
[0353]
培养可以使用液体培养基进行。培养时，可以将用琼脂培养基等固体培养基培养本发明的细菌而得到的产物直接接种至液体培养基中，也可以将用液体培养基对本发明的
细菌进行种培养而得的产物接种至主培养用的液体培养基中。即，培养可以分为种培养和主培养来进行。在该情况下，种培养和主培养的培养条件可以相同，也可以不同。在培养开始时培养基中含有的本发明的细菌的量无特别限制。主培养例如可以通过向主培养的培养基中，植菌1～50％(v/v)的种培养液来进行。
[0354]
培养可以通过分批培养(batch culture)、流加培养(fed-batch culture)、连续培养(continuous culture)、或它们的组合来实施。需要说明的是，也将培养开始时的培养基称为“初始培养基”。此外，也将在流加培养或连续培养中向培养体系(发酵槽)中供给的培养基称为“流加培养基”。此外，也将在流加培养或连续培养中向培养体系中供给流加培养基的工序称为“流加”。需要说明的是，在培养分为种培养和主培养进行的情况下，例如，可以将种培养和主培养都以分批培养进行。此外，例如，也可以将种培养以分批培养进行，将主培养以流加培养或连续培养进行。
[0355]
本发明中，各培养基成分可以在初始培养基、流加培养基或这两者中含有。初始培养基中含有的成分的种类与流加培养基中含有的成分的种类可以相同，也可以不同。此外，初始培养基中含有的各成分的浓度与流加培养基中含有的各成分的浓度可以相同，也可以不同。此外，也可以使用含有的成分的种类和/或浓度不同的2种或2种以上的流加培养基。例如，在间歇地进行多次流加的情况下，各次的流加培养基中含有的成分的种类和/或浓度可以相同，也可以不同。
[0356]
就培养基中的碳源的浓度而言，只要本发明的细菌能够增殖，能够生产l-氨基酸，就无特别限制。就培养基中的碳源的浓度而言，例如，可以在l-氨基酸的生产不受到抑制的范围内尽可能高。就培养基中的碳源的浓度而言，例如，作为初始浓度(初始培养基中的浓度)，可以为1～30w/v％，优选为3～10w/v％。此外，也可以适宜地将碳源通过追加添加至培养基中。例如，可以根据伴随发酵的进行的碳源的消耗，而将碳源通过追加添加至培养基中。
[0357]
培养例如可以在好氧条件下进行。好氧条件是指，液体培养基中的溶解氧浓度为作为氧膜电极的检测极限的0.33ppm以上，可以优选为1.5ppm以上。就氧浓度而言，例如，可以控制为相对于饱和氧浓度为5～50％，优选为10％左右。具体而言，好氧条件下的培养可以通过通气培养、振荡培养、搅拌培养或它们的组合来进行。就培养基的ph而言，例如，可以为ph3～10，优选为ph4.0～9.5。在培养中，可以根据需要对培养基的ph进行调节。培养基的ph可以使用氨气、氨水、碳酸钠、重碳酸钠、碳酸钾、重碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁等各种碱性或酸性物质进行调节。培养温度例如可以为20～40℃，优选为25℃～37℃。培养期间例如可以为10小时～120小时。培养例如可以持续至培养基中的碳源消耗完或本发明的细菌失去活性。通过在这样的条件下培养本发明的细菌，l-氨基酸积蓄在培养基中和/或菌体内。
[0358]
此外，在制造l-谷氨酸的情况下，也可以使用调节至l-谷氨酸析出的条件的液体培养基，一边使l-谷氨酸在培养基中析出一边进行培养。作为l-谷氨酸析出的条件，例如，可以举出ph5.0～4.0，优选为ph4.5～4.0，进一步优选为ph4.3～4.0，特别优选为ph4.0的条件(ep1078989a)。此外，在使用调节至l-谷氨酸析出的条件的液体培养基的情况下，通过将泛酸添加至培养基中，能够更高效地晶析(wo2004/111258)。此外，在使用调节至l-谷氨酸析出的条件的液体培养基的情况下，通过将l-谷氨酸的结晶作为种晶而添加至培养基
中，能够更高效地晶析(ep1233069a)。此外，在使用调节至l-谷氨酸析出的条件的液体培养基的情况下，通过将l-谷氨酸的结晶和l-赖氨酸的结晶作为种晶添加至培养基中，能够更高效地晶析(ep1624069a)。
[0359]
此外，在制造碱性氨基酸的情况下，培养工序(发酵工序)可以以使重碳酸离子和/或碳酸离子为碱性氨基酸的反离子的方式实施。这样的发酵形态也称为“碳酸盐发酵”。根据碳酸盐发酵，能够在削减以往作为碱性氨基酸的反离子而使用的硫酸离子和/或氯化物离子的使用量的同时，发酵生产碱性氨基酸。碳酸盐发酵例如可以如us2002-025564a、ep1813677a、日本特开2002-65287中所记载的方式实施。
[0360]
就发酵液而言，例如，可以用液体旋流器进行处理。作为液体旋流器，例如，可以使用一般形状的、圆筒部直径为10～110mm的、陶瓷制、不锈钢钢制或树脂制的装置。就发酵液向液体旋流器中的进料量而言，例如，可以根据发酵液中的菌体浓度、l-氨基酸浓度而设定。发酵液向液体旋流器中的进料量例如可以为2～1200l/min。
[0361]
生成了l-氨基酸这一点，可以通过化合物的检测或鉴定中使用的公知手法来确认。作为这样的手法，例如，可以举出hplc、lc/ms、gc/ms、nm r。这些手法可以单独使用，或适宜组合使用。
[0362]
就从发酵液中回收l-氨基酸而言，可以通过化合物的分离纯化中使用的公知手法进行。作为这样的手法，例如，可以举出离子交换树脂法(nagai,h.et al.,separation science and technology,39(16),3691-3710)、沉淀法、膜分离法(日本特开平9-164323、日本特开平9-173792)、晶析法(wo2008/078448、wo2008/078646)。这些手法可以单独使用，或适宜组合使用。需要说明的是，在l-氨基酸积蓄于菌体内的情况下，例如，可以从用超声波等使菌体破碎，通过离心分离将菌体除去而得到的上清中，通过离子交换树脂法等回收l-氨基酸。回收的l-氨基酸可以为游离体、其盐、或它们的混合物。作为盐，例如，可以举出硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。具体而言，在制造l-谷氨酸的情况下，就回收的l-谷氨酸而言，例如，可以为游离体的l-谷氨酸、l-谷氨酸钠(例如monosodium l-glutamate；msg)、l-谷氨酸铵(例如monoammonium l-glutamate)、或它们的混合物。例如，加入酸使发酵液中的l-谷氨酸铵晶析，添加与结晶等摩尔的氢氧化钠，由此能够得到l-谷氨酸钠(msg)。需要说明的是，也可以在晶析前后添加活性碳进行脱色(参照谷氨酸钠的工业晶析日本海水学会志56卷5号川喜田哲哉)。l-谷氨酸钠结晶例如可以作为鲜味调味料使用。l-谷氨酸钠结晶也可以与同样具有鲜味的鸟苷酸钠、肌苷酸钠等核酸混合而作为调味料使用。
[0363]
此外，在l-氨基酸在培养基中析出的情况下，可以通过离心分离或过滤等回收。此外，培养基中析出的l-氨基酸可以在使溶解于培养基中的l-氨基酸晶析后，一并分离。
[0364]
需要说明的是，就回收的l-氨基酸而言，除了l-氨基酸之外，还可以包含细菌菌体、培养基成分、水分以及细菌的代谢副产物等成分。l-氨基酸可以纯化至期望的程度。回收的l-氨基酸的纯度例如可以为50％(w/w)以上，优选为85％(w/w)以上，特别优选为95％(w/w)以上(jp1214636b,usp5431933,usp4956471,usp4777051,usp4946654,usp5840358,usp6238714,us2005/0025878)。
[0365]
实施例
[0366]
以下，将参照非限定性的实施例对本发明进行更为具体的说明。
jcm1217的磷酸酮醇酶基因(xfp)的表达载体(us2018-0282773)。
[0382]
通过将构建的glpx基因的表达载体pvk9-plac glpx和pvs7-xfp(us2018-0282773)导入c.glutamicum 2256δsucaδldha yggb
*
株(wo2014/185430)，得到了glpx基因的表达增强株。
[0383]
将pvk9单独地，或与pvs7-xfp(us2018-0282773)组合地导入c.glutam icum 2256δsucaδldha yggb
*
株(wo2014/185430)，得到了对照株。
[0384]
c.glutamicum 2256δsucaδldha yggb
*
株是从c.glutamicum 2256株(atcc 13869)出发诱导而得的l-谷氨酸生产株，使ldha基因和suca基因缺损，使yggb基因具有is变异(v419::is)。该变异型yggb基因(v419::is)的碱基序列以及由该基因编码的变异型yggb蛋白(v419::is)的氨基酸序列分别如seqid no.17和18所示。
[0385]
《2》l-谷氨酸生产培养
[0386]
使用构建的各菌株(即，对照株以及其ack基因的表达增强株和glpx基因的表达增强株)实施了l-谷氨酸生产培养。使用的培养基的组成如表1所示。碳源为葡萄糖的培养基也称为“glc培养基”，碳源为果糖的培养基也称为“frc培养基”。
[0387]
[表1]
[0388]
表1培养基组成
[0389][0390]
制备用koh调节至ph8.0的上述组成的培养基，通过高压釜(115℃、10min)灭菌。向
[0391]
灭菌后的培养基中添加进行了干热灭菌(180℃、6小时)的碳酸钙并使其终浓度为50g/l，
[0392]
并用于培养。
[0393]
将各菌株植菌于铺在粗试验管内的所述培养基(包含50g/l碳酸钙)5ml上，使用31.5℃的箱式摇床(able ml-190)在120rpm下振荡培养。在培养开始25或30小时后实施培养液的采样。使用生物技术分析仪(biotech analy zer)as-310(sakura si)定量培养液中的l-谷氨酸浓度，算出了l-谷氨酸的相对糖收率。
[0394]
结果如图1～4所示。ack基因的表达增强株(2256δsucaδldha yggb*/pv k9-plac acka/pvs7-xfp、2256δsucaδldha yggb*/pvk9-pmsra acka/pvs7-xfp、2256δsucaδldha yggb*/pvk9-plac acka和2256δsucaδldha yggb*/pv k9-pmsra acka)在以葡萄糖为碳源的情况下，与对应的对照株(就2256δsucaδldha yggb*/pvk9-plac acka/pvs7-xfp和2256δsucaδldha yggb*/pvk9-pmsra acka/pvs7-xfp而言为2256δsucaδldha yggb*/pvk9/pvs7-xfp；就2256δsucaδldha yggb*/pvk9-plac acka和2256δsucaδldha yggb*/pvk9-pm sra acka而言为2256δsucaδldha yggb*/pvk9)相比，表现出了更高的l-谷氨酸的积蓄量和l-谷氨酸的相对糖收率(图1和2)。此外，glpx基因的表达增强株(2256δsucaδldha yggb*/pvk9-plac glpx/pvs7-xfp)在以果糖为碳源的情况下，表现出比对应的对照株(2256δsucaδldha yggb
*
/pvk9/pvs7-xfp)更高的l-谷氨酸的积蓄量(图3)，在以葡萄糖为碳源的情况下，表现出比对应的对照株(2256δsucaδldha yggb
*
/pvk9/pvs7-xfp)更高的l-谷氨酸的相对糖收率(图4)。
[0395]
此外，对于aspt基因缺损株、male基因缺损株和poxb基因缺损株以同样的步骤实施了l-谷氨酸生产培养，由此确认了l-谷氨酸生产的提高。
[0396]
工业实用性
[0397]
根据本发明，能够使棒状细菌的l-氨基酸生产能力提高，能够高效率地制造l-氨基酸。
[0398]
〔序列表的说明〕
[0399]
seq id no.1：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的aspt基因的碱基序列
[0400]
seq id no.2：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的aspt蛋白的氨基酸序列
[0401]
seq id no.3：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的male基因的碱基序列
[0402]
seq id no.4：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的male蛋白的氨基酸序列
[0403]
seq id no.5：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的poxb基因的碱基序列
[0404]
seq id no.6：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的poxb蛋白的氨基酸序列
[0405]
seq id no.7：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的ack基因的碱基序列
[0406]
seq id no.8：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的ack蛋白的氨基酸序列
[0407]
seq id no.9：大肠杆菌(escherichia coli)k-12mg1655的ack基因的碱基序列
[0408]
seq id no.10：大肠杆菌k-12mg1655的ack蛋白的氨基酸序列
[0409]
seq id no.11：谷氨酸棒状杆菌atcc 13032的glpx基因的碱基序列
[0410]
seq id no.12：谷氨酸棒状杆菌atcc 13032的glpx蛋白的氨基酸序列
[0411]
seq id no.13：大肠杆菌k-12mg1655的glpx基因的碱基序列
[0412]
seq id no.14：大肠杆菌k-12mg1655的glpx蛋白的氨基酸序列
[0413]
seq id no.15：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的yggb基因的碱基序列
[0414]
seq id no.16：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的yggb蛋白的氨基酸序列
[0415]
seq id no.17：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的变异型yggb基因(v419::is)的碱基序列
[0416]
seq id no.18：谷氨酸棒状杆菌2256(atcc 13869)的变异型yggb蛋白(v419::is)的氨基酸序列
[0417]
seq id no.19～25：引物。

技术特征：
1.一种l-氨基酸的制造方法，其包含：用培养基培养具有l-氨基酸生产能力的棒状细菌，使l-氨基酸积蓄在该培养基中和/或该细菌的菌体内；和从所述培养基和/或所述菌体中采集所述l-氨基酸，所述制造方法中，所述l-氨基酸为谷氨酸类l-氨基酸，所述细菌具有下述(x)和/或(y)的修饰：(x)使经由磷酸酮醇酶途径的碳源的利用性提高的修饰；(y)使细胞内的草酰乙酸池增大的修饰。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌至少具有所述(x)的修饰。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述(x)的修饰为选自下述(a)、(b)和(c)的修饰中的1种或1种以上的修饰；所述(y)的修饰为选自下述(d)和(e)的修饰中的1种或1种以上的修饰：(a)乙酸激酶的活性增大的修饰；(b)果糖-1,6-双磷酸酶的活性增大的修饰；(c)丙酮酸脱氢酶的活性降低的修饰；(d)天冬氨酸转氨酶的活性降低的修饰；(e)苹果酸酶的活性降低的修饰。4.一种l-氨基酸的制造方法，其包含：用培养基培养具有l-氨基酸生产能力的棒状细菌，使l-氨基酸积蓄在该培养基中和/或该细菌的菌体内；和从所述培养基和/或所述菌体中采集所述l-氨基酸，所述制造方法中，所述l-氨基酸为谷氨酸类l-氨基酸，所述细菌具有选自下述(a)～(e)的修饰中的1种或1种以上的修饰：(a)乙酸激酶的活性增大的修饰；(b)果糖-1,6-双磷酸酶的活性增大的修饰；(c)丙酮酸脱氢酶的活性降低的修饰；(d)天冬氨酸转氨酶的活性降低的修饰；(e)苹果酸酶的活性降低的修饰。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述细菌至少具有所述(a)的修饰。6.根据权利要求3～5中任一项所述的方法，其中，所述天冬氨酸转氨酶由aspt基因编码；所述苹果酸酶由male基因编码；所述丙酮酸脱氢酶由poxb基因编码；所述乙酸激酶由ack基因编码；并且/或者所述果糖-1,6-双磷酸酶由glpx基因编码。
7.根据权利要求3～6中任一项所述的方法，其中，所述天冬氨酸转氨酶的活性，通过使编码天冬氨酸转氨酶的基因的表达降低或通过破坏该基因而降低；所述苹果酸酶的活性，通过使编码苹果酸酶的基因的表达降低或通过破坏该基因而降低；所述丙酮酸脱氢酶的活性，通过使编码丙酮酸脱氢酶的基因的表达降低或通过破坏该基因而降低；所述乙酸激酶的活性，通过使编码乙酸激酶的基因的表达上升而增大；并且/或者所述果糖-1,6-双磷酸酶的活性，通过使编码果糖-1,6-双磷酸酶的基因的表达上升而增大。8.根据权利要求7所述的方法，其中，编码乙酸激酶的基因的表达，通过提高该基因的拷贝数并且/或者对该基因的表达调节序列进行修饰而上升；并且/或者编码果糖-1,6-双磷酸酶的基因的表达，通过提高该基因的拷贝数并且/或者对该基因的表达调节序列进行修饰而上升。9.根据权利要求3～8中任一项所述的方法，其中，所述天冬氨酸转氨酶为下述(1a)、(1b)或(1c)所述的蛋白质：(1a)包含seq id no.2所示的氨基酸序列的蛋白质；(1b)包含在seq id no.2所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有天冬氨酸转氨酶活性的蛋白质；(1c)包含相对于seq id no.2所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有天冬氨酸转氨酶活性的蛋白质，所述苹果酸酶为下述(2a)、(2b)或(2c)所述的蛋白质：(2a)包含seq id no.4所示的氨基酸序列的蛋白质；(2b)包含在seq id no.4所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有苹果酸酶活性的蛋白质；(2c)包含相对于seq id no.4所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有苹果酸酶活性的蛋白质，所述丙酮酸脱氢酶为下述(3a)、(3b)或(3c)所述的蛋白质：(3a)包含seq id no.6所示的氨基酸序列的蛋白质；(3b)包含在seq id no.6所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有丙酮酸脱氢酶活性的蛋白质；(3c)包含相对于seq id no.6所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有丙酮酸脱氢酶活性的蛋白质，所述乙酸激酶为下述(4a)、(4b)或(4c)所述的蛋白质：(4a)包含seq id no.8或10所示的氨基酸序列的蛋白质；(4b)包含在seq id no.8或10所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有乙酸激酶活性的蛋白质；(4c)包含相对于seq id no.8或10所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸
序列，且具有乙酸激酶活性的蛋白质，并且/或者所述果糖-1,6-双磷酸酶为下述(5a)、(5b)或(5c)所述的蛋白质：(5a)包含seq id no.12或14所示的氨基酸序列的蛋白质；(5b)包含在seq id no.12或14所示的氨基酸序列中包含1～10个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，且具有果糖-1,6-双磷酸酶活性的蛋白质；(5c)包含相对于seq id no.12或14所示的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，且具有果糖-1,6-双磷酸酶活性的蛋白质。10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述细菌与非修饰株相比进一步以使磷酸酮醇酶的活性增大的方式进行了修饰。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述磷酸酮醇酶为d-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和/或果糖6-磷酸磷酸酮醇酶。12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述细菌为棒状杆菌属细菌。13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述细菌为谷氨酸棒状杆菌。14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，所述谷氨酸类l-氨基酸为选自l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-脯氨酸、l-精氨酸、l-瓜氨酸和l-鸟氨酸中的1种或1种以上的l-氨基酸。15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，所述谷氨酸类l-氨基酸为l-谷氨酸。16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述l-谷氨酸为l-谷氨酸铵或l-谷氨酸钠。

技术总结
提供一种L-谷氨酸等L-氨基酸的制造方法。用培养基培养以使其具有选自下述(A)～(E)的修饰中的1种或1种以上的修饰的方式进行了修饰的、具有L-氨基酸生产能力的棒状细菌，从该培养基和/或该细菌的菌体处采集L-氨基酸，从而制造L-氨基酸：(A)乙酸激酶的活性增大的修饰；(B)果糖-1,6-双磷酸酶的活性增大的修饰；(C)丙酮酸脱氢酶的活性降低的修饰；(D)天冬氨酸转氨酶的活性降低的修饰；(E)苹果酸酶的活性降低的修饰。性降低的修饰。


技术研发人员：平野圣子 井上公太 林和之 横田康介 守屋美加 铃木智子 门仓嘉知 长彦健 田代明梨
受保护的技术使用者：味之素株式会社
技术研发日：2021.10.25
技术公布日：2023/8/13