一种用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法

一种用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法
技术领域
1.本发明涉及肿瘤免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，通过g4s肽段连接kras-tcr的α链和β链胞外区段作为胞外识别区后，并在其羧基端融合铰链区（cd28-hinge）、跨膜区（cd8-tm）、胞内信号转导区（cd28、41bb及cd3ζ的胞内区段融合）组成新的嵌合型tcr-t（ntcr-t）。


背景技术：

2.近年来，随着t细胞受体(tcr)分离技术和基因工程技术的进步，以肿瘤新抗原为基础的基因工程tcr-t细胞治疗技术得到了广泛重视，并在临床应用中实现良好的肿瘤控制和疾病缓解。该技术首先筛选出可特异识别mhc递呈肿瘤新抗原的t细胞克隆，并经单细胞测序，分别获取该克隆的配对tcr-α链和β链信息；再用编码该tcr-α链和β链全长基因序列的慢病毒，转导患者外周血t淋巴细胞，从而得到特异性识别mhc-肿瘤相关抗原的tcr-t细胞，经体外大量扩增后回输患者，实现肿瘤治疗的目的。
3.在满足hla限制性的前提下，tcr-t识别肿瘤突变抗原无瘤种和个体差异性，这使得以肿瘤高频突变新抗原为代表的tcr-t技术蓬勃发展。kras是人类恶性肿瘤中突变率最高的致癌驱动基因之一，约占所有肿瘤的15%~20%。其中50%以上肺腺癌、胰腺癌、结直肠癌等高死亡率肿瘤患者伴随kras突变，且超过97%的kras突变发生于外显子2和3(g12、g13位点)。以kras高频突变为代表的肿瘤特异性驱动突变产生的“新抗原表位”，因其具有肿瘤特异强、免疫原性高、无异质性表达或丢失发生、可被蛋白酶体自然处理，并由hla等位基因递呈等诸多优点，现已成为tcr-t疗法治疗多种恶性肿瘤的广谱、特异、理想靶抗原。
4.然而，常规tcr-t（ctcr-t）疗法中，tcr-α链和β链需要与三个cd3的二聚体（包括：cd3γε，cd3δε，cd3ζζ）形成一个8条链、10个itam的tcr-cd3复合体，结构极为复杂；其信号传递模式需要tcr与抗原肽-mhc分子复合物的识别提供第一信号，共刺激分子（如cd28）提供第二信号，细胞因子提供第三信号，信号传递效率极低，加之“错配”异源二聚体可能产生不可预测风险，严重限制了tcr-t疗法的进一步临床应用的发展。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明基于优化tcr-t结构，提升tcr-t信号传递和肿瘤控制效率的目的，提供了一种靶向kras高频突变肿瘤新抗原的嵌合型ntcr-t构建方法，通过将tcr-α链和β链胞外区段，通过g4s肽段连接，并在其羧基端融合铰链区（hinge）、跨膜区（tm）和胞内信号转导区（cd28、41bb及cd3ζ胞内区段融合）组成，形成一个可以特异性识别以kras高频突变抗原肽表位-mhc复合体为代表靶抗原的ntcr-t技术。本发明提供的方法不仅可以避免“错配”异源二聚体风险，同时可以实现tcr-t信号高效传递，提升抗肿瘤疗效。
6.一种用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，g4s肽段连接kras-tcr的α链和β链胞外区段作为胞外识别区后，通过在胞外识别区的羧基端融合铰链区、跨膜区、胞内信号转导区组成新的嵌合型ntcr-t。
7.优选的，所述α链的cdr3核苷酸序列如seq id no.7所示。
8.优选的，所述β链的cdr3核苷酸序列如seq id no.15所示。
9.优选的，所述g4s肽段的数量为3至4个，核苷酸序列如seq id no.9所示。
10.优选的，所述铰链区的核苷酸序列如seq id no.17所示。
11.优选的，所述跨膜区的核苷酸序列如seq id no.18所示。
12.优选的，所述胞内信号转导区的cd28核苷酸序列如seq id no.19所示。
13.优选的，所述胞内信号转导区的41bb的核苷酸序列如seq id no.20所示。
14.优选的，所述胞内信号转导区的cd3ζ包括如seq id no.21所示的核苷酸序列。
15.本发明的核心是：1、用高亲和识别kras高频突变mhci表位的t细胞受体α和β链高变区（v）的cdr3片段，替换患者自身tcr相应区域的cdr3片段，从而获得kras高频突变肿瘤tcr的胞外识别片段；2、将改造后的α链v区和β链v区经3-4个g4s肽段串联，并在其羧基端融合铰链区（cd28-hinge）、跨膜区（cd8-tm）、胞内信号转导区（cd28、41bb及cd3ζ的胞内区段融合），组成新的嵌合型tcr-t（ntcr-t）细胞治疗技术。
16.本发明具有以下优势：1、以kras高频突变或肿瘤特异性高频突变为代表的“新抗原表位”，具有肿瘤特异强、免疫原性高、无异质性表达或丢失发生、可被蛋白酶体自然处理，并由hla等位基因递呈等诸多优点。
17.2、嵌合型ntcr结构简单且自带信号转导和共刺激信号，可高效识别kras高频突变肽表位-mhc复合体，可避免常规tcr-t疗法中信号传递复杂、效率低，易“错配”等问题。
附图说明
18.图1是hla-a*11：01且kras高频突变胰腺癌患者tcr-α链和β链信息获取和cdr3替换图，其中，对具有hla-a*11：01且kras高频突变胰腺癌患者的外周血进行单细胞测序，获得构建具有hla限制性配对tcr-α链和β链的序列信息；并用表2中已报道的cdr3区域序列信息替换该配对tcr-α/β链的cdr3区域，从而获得具有kras-g12v/d抗原肽高识别功能的hla限制性tcr-α/β链序列信息。
19.图2是3-4个g4s作为linker连接kras-tcr-α链和β两条链的嵌合型ntcr-t设计示意图。
20.图3是嵌合型tcr（ntcr-t）的设计元件和序列示意图。
21.图4是嵌合型ntcr-t与常规ctcr-t的对比图。
22.图5是pcdh-cmv-kras-g12d-tcr-α-3 g4s-β-28bbz目的质粒构建、病毒包装、jurkat和t细胞感染及表达验证。
23.图6是嵌合型kras-ntcr-t细胞与hla-a*11:01基因型且kras-g12d突变胰腺癌细胞进行共培养3天后的效果验证图，其中，细胞因子il2，il4，il6，tnfα和ifnγ在嵌合型kras-ntcr-t细胞组均显著增加，而抑制性细胞因子il10呈现显著下降。
具体实施方式
24.本发明涉及基于个体化肿瘤高频突变mhci抗原表位识别的tcrα链v区和β链v区cdr3片段的基因取代其自身相应区域基因，并用3-4个g4s肽段串联形成胞外识别区，进一步在其羧基端融合铰链区（cd28-hinge）、跨膜区（cd8-tm）、胞内的信号转导区（cd28、41bb及cd3ζ的胞内区段融合），构建新的、结构简单、自带信号转导和共刺激信号的嵌合型ntcr-t。本发明涉及利用识别kras高频突变（g12c, g12v）mhci抗原表位的tcrα链区v区和β链v区cdr3基因片段，取代患者自身tcr相应区域的嵌合型ntcr-t构建与应用。本发明涉及3-4个g4s肽段作为连接子串联上述改造后的tcr-α链v区和β链v区肽段，作为胞外抗原识别区的结构设计和应用。本发明涉及胞外抗原识别区的羧基端融合铰链区cd28-hinge、跨膜区cd8-tm，胞内信号转导区cd28、41bb及cd3ζ的胞内区段融合为嵌合型tcr-t的结构设计和应用。本发明还涉及基于linker连接tcr-α链和β链胞外区段，在其羧基端融合hinge、跨膜区，并由cd28、41bb及cd3ζ胞内区段融合组成胞内信号转导区的嵌合型tcr-t疗法结构设计和应用。
25.本发明的第一个目的是：确定能特异识别mhc递呈kras突变肽的tcr-α链和β链信息（尤其是cdr3区）。
26.针对kras高频突变的特异性受体t细胞疗法（tcr-t）需要确定三个关键因素：kras高频突变新抗原肽、具备结合kras突变肽能力的hla分型以及能特异识别hla结合肽的tcr-α链和β链信息（尤其是cdr3区）。通过多肽与mhc分子结合预测网站（netmhc-4.0），首先确定了中国人群hla亚型频率较高的hla-a*11:01可以亲和kras高频突变肽表位，其%rank值均小于2，如表1（多肽与mhc分子结合预测网站（netmhc-4.0）kras-g12d/c/v三种突变肽表位均可高效亲和hla-a*11:01基因型）中所示。已报道的可以特异性识别高频kras突变肽表位的tcr-α链和β链中cdr3信息，如表2所示。将hla-a*11：01分型且kras-g12v高频突变患者外周血进行单细胞测序，获得配对tcr-α链和β链信息，进一步将其cdr3区域替换可识别kras-g12v/d抗原肽的cdr3区域，最终获得对kras-g12v/d抗原肽具有高反应性的tcr-α链和β链信息。本发明中针对kras-g12v且hla-a*11:01的特异性tcr-α链的核苷酸序列包括seq id no.2至8的核苷酸片段。tcr-β链的核苷酸序列包括seq id no.10至16的核苷酸片段。
27.[0028][0029]
本发明的第二个目的是：以g4s作为linker，连接特异性识别kras突变肽的tcr-α链和β链胞外片段的长度设计和应用。
[0030]
为确定何种长度的linker用于嵌合型ntcr-t构建最为合适，采用结构预测网站robetta，进行2个，3个，4个和5个g4s连接的特异性识别kras突变肽表位的嵌合型ntcr的结构预测，如图2所示，分析何种linker长度最为合适用于连接kras-tcr-α链和β两条链的胞外区（cdj区）。为了确保嵌合型ntcr-t对肿瘤抗原表位肽的识别能力，采用已发表的复合物结构（pdb编号：3gh1）作为结构比对模板（图2a）。串联tcr-α和β链胞外区结构比对的结果显示（图2b）：3个，4个和5个g4s作为linker连接kras-tcr-α/β两条链的胞外区（cdj区）均可保证其形成正确的配对识别构象，然而2个g4s作为linker连接kras-tcr-α/β两条链的胞外区，由于连接太短，无法形成正确的配对识别构象。基于确保正确配对构象形成，且避免linker冗余导致蛋白不稳定，3-4个g4s可作为linker连接kras-tcr-α链和β两条链的嵌合型ntcr-t设计。
[0031]
本发明的第三个目的是：以cd28-hinge、cd8跨膜区作为胞外识别和胞内信号转导区的连接部分，以cd28、41bb及cd3ζ胞内区段融合作为胞内信号转导区的嵌合型ntcr-t结构设计和应用。
[0032]
3-4个g4s肽段连接kras-tcr-α链和β链胞外区段作为胞外识别区后，通过在胞外识别区（g4s肽段连接kras-tcr-α链和β链胞外区段）的羧基端融合cd28-hinge、cd8跨膜区和cd28、41bb及cd3ζ胞内区段，共同组成嵌合型ntcr-t的跨膜和胞内信号转导区。
[0033]
将全序列通过全基因合成和酶切连接的方式，构建于pcdh-cmv载体多克隆位点xbai和bmgbi之间，获得pcdh-cmv-kras-g12d-tcr-α-g4s-β-28bbz目的质粒。
[0034]
本发明的第四个目的是：嵌合型ntcr-t细胞制备及其在kras突变肿瘤中的应用。
[0035]
将pcdh-cmv-kras-g12d-tcr-α-g4s-β-28bbz目的质粒进行293t细胞慢病毒包装和浓缩，并通过lenti-pac
™
慢病毒滴度检测试剂盒测定病毒滴度，按照moi=100分别感染t细胞，获得嵌合型kras-ntcr-t细胞，并确定全长目的基因序列是否正常转录表达。随后，嵌合型kras-ntcr-t细胞与hla-a*11:01基因型且kras-g12d突变的胰腺癌肿瘤细胞共培养后，检测其细胞因子分泌情况，以确定嵌合型kras-ntcr-t细胞的抗肿瘤效果。
实施例1
[0036]
构建后的pcdh-cmv-kras-g12d-tcr-α-g4s-β-28bbz目的质粒进行293t细胞慢病毒包装和浓缩，并通过lenti-pac
™
慢病毒滴度检测试剂盒测定病毒滴度，按照moi=10和moi=100分别感染jurkat细胞和t细胞，并于感染后第三天取1x105细胞提取mrna，随后逆转录为cdna，并用常规pcr验证jurkat细胞和t细胞中全长ntcr-t的mrna水平。结果显示：jurkat细胞和t细胞中均表达了ntcr-t的全长mrna。
[0037]
目的基因全长验证引物：tcr-cmv-f：gtaggcgtgtacggtgggagtcr-wpre-r：agcagcgtatccacatagcg
实施例2
[0038]
嵌合型kras-ntcr-t细胞与hla-a*11:01基因型且kras-g12d突变的胰腺癌肿瘤细胞共培养后，细胞因子分泌情况显示：相较于nc-t孵育组，细胞因子il2，il4，il6，tnfα和ifnγ在嵌合型kras-ntcr-t细胞共孵育组均有显著上升，抑制性细胞因子il10呈现显著下降趋势，表明嵌合型kras-ntcr-t细胞可对hla-a*11:01基因型递呈kras-g12d突变肽表位复合物起特异性反应，体现了嵌合型kras-ntcr-t细胞的抗肿瘤效果。
[0039]
上面结合实施例对本发明的实例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出的各种变化，也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，其特征在于，g4s肽段连接kras-tcr的α链和β链胞外区段作为胞外识别区后，通过在胞外识别区的羧基端融合铰链区、跨膜区、胞内信号转导区组成新的嵌合型ntcr-t。2.根据权利要求1所述的用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，其特征在于，所述α链的cdr3核苷酸序列如seq id no.7所示。3.根据权利要求2所述的用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，其特征在于，所述β链的cdr3核苷酸序列如seq id no.15所示。4.根据权利要求3所述的用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，其特征在于，所述g4s肽段的数量为3至4个，核苷酸序列如seq id no.9所示。5.根据权利要求4所述的用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，其特征在于，所述铰链区的核苷酸序列如seq id no.17所示。6.根据权利要求5所述的用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，其特征在于，所述跨膜区的核苷酸序列如seq id no.18所示。7.根据权利要求6所述的用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，其特征在于，所述胞内信号转导区的cd28的核苷酸序列如seq id no.19所示。8.根据权利要求7所述的用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，其特征在于，所述胞内信号转导区的41bb的核苷酸序列如seq id no.20所示。9.根据权利要求8所述的用于靶向kras高频突变肿瘤的嵌合型ntcr-t构建方法，其特征在于，所述胞内信号转导区的cd3ζ包括如seq id no.21所示的核苷酸序列。

技术总结
本发明涉及一种用于靶向KRAS高频突变肿瘤的嵌合型nTCR-T构建方法，用高亲和识别KRAS高频突变MHCI表位的T细胞受体α和β链高变区（V）的CDR3片段，替换患者自身TCR相应区域的CDR3片段，构建KRAS高频突变肿瘤TCR的胞外识别片段；将改造后的α链V区和β链V区经3-4个G4S肽段串联，并在其羧基端融合铰链区、跨膜区、胞内信号转导区，组成新的嵌合型nTCR-T细胞治疗技术。本发明以KRAS高频突变或肿瘤特异性高频突变为“新抗原表位”代表，具有肿瘤特异强、免疫原性高、无异质性表达或丢失发生、可被蛋白酶体自然处理，并由HLA等位基因递呈等诸多优点。多优点。多优点。


技术研发人员：姚宏 李涛 李莉 葛春蕾 郭吉寅 承佳兴 姚小暄
受保护的技术使用者：昆明医科大学
技术研发日：2023.07.10
技术公布日：2023/8/13