一种通过检测ZNF671和ZMYND10基因甲基化诊断鼻咽癌的试剂盒的制作方法

一种通过检测znf671和zmynd10基因甲基化诊断鼻咽癌的试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子诊断技术领域，具体地，涉及一种通过检测znf671和zmynd10基因甲基化诊断鼻咽癌的试剂盒。


背景技术：

2.鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，npc）起源于鼻咽上皮细胞，一种比较常见的头颈部恶性肿瘤。早期鼻咽癌的发病部位隐匿，发病症状体征与其他良性疾病的难以鉴别，很容易出现误漏诊的现象，导致患者在确诊时已经发展至晚期，转移和复发的风险都比较高，临床治疗效果及预后都较差，患者的五年生存率仅为 30%-45%。鼻咽癌如早期发现，治愈率高达80～90%，所以“早预防、早发现、早治疗”是鼻咽癌的最好手段。目前鼻咽癌临床诊断方法主要有ebv血清学抗体检测、血浆ebv dna定量检测、影像学检查以及鼻咽镜下组织活检等。ebv血清学抗体检测存在特异性不足的缺点，在鼻咽癌筛查中阳性预测值较低。血浆中ebv dna的产生主要来源于肿瘤细胞凋亡或坏死之后的裂解释放，所以是片段化的，且早期肿瘤释放到血浆中的ebv dna含量较少，所以血浆ebv dna定量检测对于早期鼻咽癌的诊断的灵敏度比较低。影像学mri或者ct检查安全无创，但是价格比较昂贵，且存在一定的假阳性。鼻咽癌诊断的“金标准”为鼻咽镜下的组织病理活检，但是取材有创，严格依赖临床医生的临床经验。因此寻找新的无创、有效的分子标志物用于鼻咽癌的辅助诊断、疗效监测和预后评估十分必要。
3.dna甲基化是一种常见的表观修饰，它在不改变dna序列的情况下，对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起到重要的调控作用。近年来的大量研究表明，dna异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。研究表明，在鼻咽癌发生过程中，广泛基因启动子甲基化区域发生甲基化，它们的改变被认为是鼻咽癌发生过程中的重要的早期事件。由于鼻咽癌起源于鼻咽部位，因此对于鼻咽部位的高效、无创取材的肿瘤分子标志物的检测能更为直接反应病变部位的状况。因此，采用鼻咽刷样本类型的dna甲基化有望成为鼻咽癌的早期诊断、疗效监测和预后评估的有效肿瘤标志物。目前甲基化检测大多需要先采用传统的亚硫酸盐转化处理dna后再进行荧光pcr定量检测。传统的亚硫酸盐转化法对核酸的损伤较大，破坏了核酸的完整度，而且操作过程繁琐，耗时较长。如果转化不完全的话，可能导致检测出现假阳性。
4.甲基化限制性内切酶能够特异性识别酶切位点并进行酶切，由于5’甲基化胞嘧啶可以抑制某些限制性内切酶在其识别序列内酶切。在甲基化限制性内切酶作用下，非甲基化的靶标序列被酶切断裂，而甲基化的靶标序列保持完整，所以可以将甲基化dna和非甲基化dna进行区分。通过甲基化限制性内切酶，避免了使用亚硫酸氢盐转化，保持了核酸的完整程度，但酶切产物需要再进行回收纯化，耗时比较长容易造成污染且对核酸造成损失。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种通过检测znf671和zmynd10基因甲基化诊断鼻咽癌的试剂盒。
6.本发明的第一个目的是提供一种检测znf671和/或zmynd10基因甲基化的引物探针组合。
7.本发明的第二个目的是提供所述引物探针组合在制备检测诊断鼻咽癌试剂盒中的应用。
8.本发明的第三个目的是提供一种诊断鼻咽癌试剂盒。
9.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：一种检测znf671和/或zmynd10基因甲基化的引物探针组合，检测znf671基因的引物的核苷酸序列如seq id no：1和2所示，检测znf671基因的探针的核苷酸序列如seq id no：3所示；检测zmynd10基因的引物的核苷酸序列如seq id no：4和5所示，检测zmynd10基因的探针的核苷酸序列如seq id no：6所示；所述znf671基因在ncbi上的登录号为：nc_000019.10，所述zmynd10基因在ncbi上的登录号为：nc_000003.12。
10.在本发明中，所述引物探针组合中还含有检测内参基因actb的引物和探针，所述检测内参基因actb的引物的核苷酸序列如seq id no：7和8所示，检测内参基因actb的探针的核苷酸序列如seq id no：9所示。
11.在检测过程中，还需要在探针上标记荧光基团和淬灭基团。所述检测znf671基因的探针的5’端标记的荧光基团为vic，检测znf671基因的探针的3’端标记的荧光淬灭基团为bhq1；所述检测zmynd10基因的探针的5’端标记的荧光基团为fam，检测zmynd10基因的探针的3’端标记的荧光淬灭基团为mgb。
12.进一步地，所述检测内参基因actb的探针的5’端标记的荧光基团为cy-5，所述检测内参基因actb的探针的3’端标记的荧光淬灭基团为bhq2。
13.本发明还请求保护所述引物探针组合在制备检测诊断鼻咽癌试剂盒中的应用。
14.本发明根据上述引物探针组合，提供了一种诊断鼻咽癌试剂盒，所述试剂盒中含有所述的引物探针组合。
15.进一步地，所述试剂盒中还含有pcr检测试剂。
16.为了避免重亚硫酸盐转化处理的缺点，所述试剂盒还含有甲基化敏感性限制性内切酶，所述甲基化敏感性限制性内切酶含有hhai、bsh1236i和hpaii中的一种或几种。
17.优选地，所述甲基化敏感性限制性内切酶为hhai、bsh1236i和hpaii三种酶混合。
18.进一步地，hhai、bsh1236i和hpaii三种酶等体积混合。
19.进一步地，所述pcr检测试剂包括酶切扩增缓冲液、taq dna聚合酶和无核酸酶水，所述酶切扩增缓冲液含有tris-hcl、kcl、mgcl2、甘油、bsa、二甲基亚砜、tween 20、dntp和二硫苏糖醇中的一种或几种。
20.进一步地，所述试剂盒中还含有阳性质控品c666-1人鼻咽癌细胞株dna和阴性质控品np96人鼻咽上皮细胞株dna。
21.在使用所用试剂盒时，包括以下步骤：1、取待测者的鼻咽拭子样本，提取样本dna，即为dna模板。
22.2、pcr扩增与检测：配置pcr反应体系，所述体系由上述引物和探针组合、酶切扩增缓冲液、甲基化敏感性限制性内切酶、dna聚合酶、dna模板和h2o组成。
23.每条上述引物和探针的浓度可以为8～12 μm，甲基化敏感性限制性内切酶的浓度可以为3～8 u/μl，dna聚合酶的浓度可以为3～8 u/μl。
24.在pcr反应体系中，每条上述引物的体积可以为0.3～0.8 μl，每条上述探针的体积可以为0.1～0.5 μl，酶切扩增缓冲液可以由10～50 mmol/l tris-hcl、160～250 mmol/l kcl、20～50 mmol/l mgcl2、3～5%（w/v）甘油、1～5 mg/ml bsa、0.5～1.5%（v/v）二甲基亚砜、0.1%～0.4%（v/v）tween 20、0.3～1 mmol/l dntp和3～8 mmol/l二硫苏糖醇的水溶液组成。
25.甲基化敏感性限制性内切酶的体积可以为1～4 μl，dna聚合酶的体积可以为0.5～2 μl，dna模板的体积可以为3～8 μl，h2o的体积可以为5～15 μl。
26.在本发明具体实施例中，每条上述引物和探针的浓度为10μm，甲基化敏感性限制性内切酶的浓度为5u/μl，dna聚合酶的浓度为5u/μl。
27.在pcr反应体系中，每条上述引物的体积为0.6 μl，每条上述探针的体积为0.3 μl，酶切扩增缓冲液由40 mmol/l tris-hcl、200 mmol/l kcl、30 mmol/l mgcl2、4%（w/v）甘油、4 mg/ml bsa、1%（v/v）二甲基亚砜、0.2%（v/v）tween 20、0.5 mmol/l dntp和5mmol/l二硫苏糖醇的水溶液组成。
28.甲基化敏感性限制性内切酶的体积为3 μl，dna聚合酶的体积为1 μl，dna模板的体积为5 μl，h2o的体积为9 μl。
29.pcr扩增程序为：37℃，15 min，1个循环；95℃，5 min，1个循环；95℃，10 sec，60℃，30 sec，单次采集荧光，45个循环；38℃，30 sec，1个循环。
30.3、判定标准表示检测待测样品的结果有效的情况：检测阴性质控品的znf671和zmynd10基因的ct值》40或无扩增，且内参基因actb的ct值t≤35；且检测阳性质控品的znf671和zmynd10基因的ct值≤30，且内参基因actb的ct值t≤35。
31.表示检测待测样品的结果为阳性的情况：检测鼻咽拭子样本的znf671或zmynd10基因的ct≤40且扩增曲线为“s”型，且内参基因actb的ct值t≤35。
32.表示检测待测样品的结果为阴性的情况：检测鼻咽拭子样本的znf671和zmynd10基因的ct》40或无扩增，且内参基因actb的ct值t≤35。
33.若内参基因actb的ct值》35，表示实验无效，提示加入的dna量太少，需要重新提取dna后检测。
34.若判读结果为阴性，患鼻咽癌的风险较低，建议定期随访；若判读结果为阳性，患鼻咽癌的风险较高，建议镜检或组织活检确认。
35.进一步地，每条上述引物和探针的浓度可以为10 μm，甲基化敏感性限制性内切酶的浓度可以为5 u/μl，dna聚合酶的浓度可以为5 u/μl。
36.在pcr反应体系中，每条上述引物的体积可以为0.6 μl，每条上述探针的体积可以为0.3 μl，甲基化敏感性限制性内切酶的体积可以为3 μl，dna聚合酶的体积可以为1 μl，dna模板的体积可以为5 μl，h2o的体积为9 μl。
37.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明基于znf671和zmynd10基因的特定序列设计引物和探针，确定甲基化敏感性限制性内切酶的类型和酶切位点，实现在同一体系快速酶切和pcr扩增，无需进行亚硫酸盐处理，减少了dna的损伤，转化不完全等问题。
38.本发明构建的多重甲基化pcr反应体，实现对多靶标检测的灵敏度和准确性，适用于鼻咽癌的辅助诊断，有利于鼻咽癌的早诊早治，以无创安全的鼻咽拭子为待测样本进行检测，降低患者痛苦和检测费用。
附图说明
39.图1为本发明实施例1的试剂盒对临床确诊为鼻咽癌患者的鼻咽拭子样本进行甲基化检测的扩增曲线图。
40.图2为本发明实施例1的试剂盒对临床确诊为非鼻咽癌患者的鼻咽拭子样本进行甲基化检测的扩增曲线图。
具体实施方式
41.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
42.实施例1 一种诊断鼻咽癌的试剂盒一、组成1、znf671（基因登录号：nc_000019.10）、zmynd10（基因登录号：nc_000003.12）和actb基因的引物探针组合，如表1所示。
43.其中znf671-p1探针5’端标记的荧光基团为vic，3’端标记的荧光淬灭基团为bhq1；zmynd10-p1探针5’端标记的荧光基团为fam，3’端标记的荧光淬灭基团为mgb；actb-p1探针5’端标记的荧光基团为cy-5，3’端标记的荧光淬灭基团为bhq2。
44.表1 引物探针组合
45.表1中，以znf671基因中核苷酸序列如seq id no：10所示的序列设计上下游引物和探针；以zmynd10基因中核苷酸序列如seq id no：11所示的序列设计上下游引物和探针；以actb基因中核苷酸序列如seq id no：12所示的序列设计上下游引物和探针。
46.2、pcr反应液：（1）酶切扩增缓冲液：由40 mmol/l tris-hcl、200 mmol/l kcl、30 mmol/l mgcl2、4%（w/v）甘油、4 mg/ml bsa、1%（v/v）二甲基亚砜（dmso）、0.2%（v/v）tween 20、0.5 mmol/l dntp和5 mmol/l二硫苏糖醇的水溶液组成。
47.（2）taq dna聚合酶。
48.（3）甲基化敏感限制性内切酶mix：hhai、bsh1236i和hpaii等体积混合。
49.（4）无核酸酶水。
50.上述试剂可购置于takala公司。
51.3、阳性质控品：c666-1人鼻咽癌细胞株dna；阴性质控品：np96人鼻咽上皮细胞株dna。
52.二、使用方法1、取待测者的鼻咽拭子样本，用凯杰生物科技有限公司的提取试剂盒qiagen qiaamp dna blood mini kit（货号51106），进行样本dna的提取。
53.2、pcr扩增与检测（1）按照下列表2配制20 μl的pcr反应体系，以样本dna作为dna模板进行检测，以阳性质控品、阴性质控品替换dna模板，作为对照。
54.表2 pcr反应体系
55.（2）将pcr反应体系分装于pcr八联管中，置于abi 7500荧光pcr仪中进行反应。仪器荧光通道设置如表3所示，扩增程序设定如表4所示。
56.表3 荧光通道设置
57.表4 pcr扩增程序
58.三、判定标准如下表5所示，若判读结果为阴性，患鼻咽癌的风险较低，建议定期随访；若判读结果为阳性，患鼻咽癌的风险较高，建议镜检或组织活检确认。
59.表5 判定标准
60.实施例2 实施例1试剂盒检测鼻咽拭子样本一、实验方法用实施例1的试剂盒，检测60例鼻咽癌患者和80例非鼻咽癌患者的鼻咽拭子样本。
61.二、实验结果结果如表6所示，实施例1的试剂盒灵敏度和特异性分别为95%（57/60）和93.75%（75/80）。如图1所示，为本发明实施例1的试剂盒对临床确诊为鼻咽癌患者的鼻咽拭子样本进行甲基化检测的扩增曲线图。如图2所示，为本发明实施例1的试剂盒对临床确诊为非鼻咽癌患者的鼻咽拭子样本进行甲基化检测的扩增曲线图。灵敏度（%）=阳性检出数/阳性病例总数，特异性（%）=阴性检出数/阴性病例总数。
62.表6 实施例1试剂盒检测鼻咽拭子样本结果
63.实施例3 不同甲基化敏感性限制性内切酶的检测效果一、实验方法甲基化敏感性限制性内切酶中，hhai、bsh1236i、hpaii分别识别gcg/c，cg/cg，c/cgg序列，其中，斜线“/”表示切割位点。
64.本实施例通过使用甲基化敏感性限制性内切酶的种类，确定切割位点。
65.设置实施例1试剂盒中，甲基化限制性内切酶mix为hhai、bsh1236i、hpaii、hhai与bsh1236i等体积混合、hhai与hpaii等体积混合、bsh1236i与hpaii等体积混合，及hhai、bsh1236i和hpaii等体积混合，以灭菌水为对照，检测阴性样本，再按照实施例1的方法进行实验。
66.二、实验结果检测结果如表7所示，酶组别1～8无法完全将阴性样本的未甲基化序列完全酶切，可能导致假阳性结果；当hhai、bsh1236i、hpaii三种甲基化限制性酶组合使用时，阴性样本可以被完全酶切。因此，甲基化限制性内切酶mix应该为hhai、bsh1236i和hpaii三种甲基化限制性酶组合。
67.表7 不同甲基化敏感性限制性内切酶的阴性样本检测结果
68.实施例4 不同引物探针序列的检测效果一、实验方法如表8所示，以znf671基因中核苷酸序列如seq id no：10所示的序列设计对比组1和2中的上下游引物和探针；以zmynd10基因中核苷酸序列如seq id no：11所示的序列设计
对比组1和2中的上下游引物和探针。
69.其中，探针znf671-p2和探针znf671-p3的荧光基团修饰与实施例1中的探针znf671-p1相同，探针zmynd10-p2和探针zmynd10-p3的荧光基团修饰与实施例1中的探针zmynd10-p1相同。
70.其他试剂和检测参数与实施例1相同，按照实施例1的方法，检测10例鼻咽癌患者和10例非鼻咽癌患者的鼻咽拭子样本，确定检测效果最优的引物探针组合。
71.表8 针对znf671和zmynd10基因特定片段设计不同引物探针序列
72.二、实验结果如表9所示，实施例1的引物探针组合的灵敏度和特异性分别为90%和100%，对比组1的引物探针组合的灵敏度和特异性分别为70%和70%，对比组2的引物探针组合的灵敏度和特异性分别为50%和60%。
73.本发明实施例1的引物探针组合的灵敏度明显高于其他两个对比组。灵敏度（%）=阳性检出数/阳性病例总数，特异性（%）=阴性检出数/阴性病例总数。
74.表9 针对znf671和zmynd10基因设计不同引物探针序列检测结果
75.实施例5 不同的znf671基因靶标片段的检测效果一、实验方法如表10所示，以znf671基因中核苷酸序列如seq id no：25所示的序列设计对比组3和4中的上下游引物和探针；以zmynd10基因中核苷酸序列如seq id no：26所示的序列设计对比组3和4中的上下游引物和探针。
76.其中，探针znf671-p4和探针znf671-p5的荧光基团修饰与实施例1中的探针znf671-p1相同，探针zmynd10-p4和探针zmynd10-p5的荧光基团修饰与实施例1中的探针zmynd10-p1相同。
77.其他试剂和检测参数与实施例1相同，按照实施例1的方法，检测10例鼻咽癌患者和10例非鼻咽癌患者的鼻咽拭子样本，确定检测效果最优的引物探针组合。
78.表10 针对znf671和zmynd10基因不同靶标片段设计不同引物探针序列
79.二、实验结果如表11所示，实施例1的引物探针组合的灵敏度和特异性分别为90%和100%，对比组3的引物探针组合的灵敏度和特异性分别为60%和40%，对比组4的引物探针组合的灵敏度和特异性分别为60%和60%。
80.本发明实施例1的引物探针组合的灵敏度明显高于其他两个对比组。灵敏度（%）=阳性检出数/阳性病例总数，特异性（%）=阴性检出数/阴性病例总数。
81.表11 针对znf671和zmynd10基因不同靶标片段检测结果
82.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出
其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种检测znf671和/或zmynd10基因甲基化的引物探针组合，其特征在于，检测znf671基因的引物的核苷酸序列如seq id no：1和2所示，检测znf671基因的探针的核苷酸序列如seq id no：3所示；检测zmynd10基因的引物的核苷酸序列如seq id no：4和5所示，检测zmynd10基因的探针的核苷酸序列如seq id no：6所示；所述znf671基因在ncbi上的登录号为：nc_000019.10，所述zmynd10基因在ncbi上的登录号为：nc_000003.12。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合中还含有检测内参基因actb的引物和探针，所述检测内参基因actb的引物的核苷酸序列如seq id no：7和8所示，检测内参基因actb的探针的核苷酸序列如seq id no：9所示。3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述检测znf671基因的探针的5’端标记的荧光基团为vic，检测znf671基因的探针的3’端标记的荧光淬灭基团为bhq1；所述检测zmynd10基因的探针的5’端标记的荧光基团为fam，检测zmynd10基因的探针的3’端标记的荧光淬灭基团为mgb。4.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述检测内参基因actb的探针的5’端标记的荧光基团为cy-5，所述检测内参基因actb的探针的3’端标记的荧光淬灭基团为bhq2。5.权利要求1～4任一所述引物探针组合在制备检测诊断鼻咽癌试剂盒中的应用。6.一种诊断鼻咽癌试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～4任一所述的引物探针组合。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有pcr检测试剂。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有甲基化敏感性限制性内切酶，所述甲基化敏感性限制性内切酶含有hhai、bsh1236i和hpaii中的一种或几种。9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr检测试剂包括酶切扩增缓冲液、taq dna聚合酶和无核酸酶水，所述酶切扩增缓冲液含有tris-hcl、kcl、mgcl2、甘油、bsa、二甲基亚砜、tween 20、dntp和二硫苏糖醇中的一种或几种。10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阳性质控品c666-1人鼻咽癌细胞株dna和阴性质控品np96人鼻咽上皮细胞株dna。

技术总结
本发明公开了一种通过检测ZNF671和ZMYND10基因甲基化诊断鼻咽癌的试剂盒。本发明公开了一种检测ZNF671和/或ZMYND10基因甲基化的引物探针组合，基于ZNF671和ZMYND10基因的特定序列设计，确定甲基化敏感性限制性内切酶的类型和酶切位点，实现在同一体系快速酶切和PCR扩增，无需进行亚硫酸盐处理，减少了DNA的损伤，转化不完全等问题。本发明构建的多重甲基化PCR反应体，实现对多靶标检测的灵敏度和准确性，适用于鼻咽癌的辅助诊断，有利于鼻咽癌的早诊早治，以无创安全的鼻咽拭子为待测样本进行检测，降低患者痛苦和检测费用。降低患者痛苦和检测费用。降低患者痛苦和检测费用。


技术研发人员：李菲 葛毅媛 黄玄贺 郭奕轩 韩芝斌 许泽仰 胡晓 谢龙旭
受保护的技术使用者：潮州凯普生物化学有限公司 广东凯普生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/8/13