检测Chr22:q13区域拷贝数变异的核酸产品及其应用的制作方法

检测chr22:q13区域拷贝数变异的核酸产品及其应用
技术领域
1.本技术涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种检测chr22:q13区域拷贝数变异的核酸产品及其应用。


背景技术：

2.chr22:q13缺失综合征，是一种常染色体显性遗传疾病，通常是由于人类22号染色体q末端(长臂)缺失引起的遗传疾病。在chr22:q13区域的异常变异，通常都发生在chr22:q13.3区域，所以其又叫chr22:q13.3缺失综合征。chr22:q13缺失综合征的特征变化很大，涉及身体的许多部位。其特征性体征和症状包括发育迟缓，中度至深度智力障碍，肌张力降低(张力减退)以及言语缺失或延迟。
3.目前对于染色体微缺失微重复的遗传检测技术主要有：荧光原位杂交技术(fish)、染色体微阵列芯片技术(cma)、实时荧光pcr技术、多重连接依赖探针扩增技术(mlpa)、高通量测序技术(ngs)等。但是对于胚胎植入前的微缺失微重复检测目前没有明确的检测方案。
4.根据欧洲人类生殖与胚胎协会(eshre)2020年版的最新指南中提出：胚胎植入前遗传性检测(preimplantation genetic testing，pgt)是指对来源于卵母细胞(极体)或者胚胎(卵裂球期或囊胚期)的dna进行hla分型或者检测遗传物质是否异常，将无疾病胚胎植入子宫妊娠，并出生正常子代的技术。根据检测目的不同，pgt技术可分为三类，包括胚胎植入前非整倍体检测(preimplantation genetic testing foraneuploidy，pgt-a)，胚胎植入前单基因病检测(preimplantation genetic testing for monogenic，pgt-m)，胚胎植入前染色体结构重排检测(pgt-sr)。
5.染色体非整倍体、单基因病和拷贝数变异(copy number variation，cnv)是导致胚胎异常的主要因素；然而，目前的pgt检测方法一般只能检测3mb～5mb以上的cnv，对于检测3mb以内的cnv存在一定的局限性。目前，对于具有已知cnv综合征的夫妇，亟需一种能在植入前对胚胎cnv进行高效准确检出的相关技术和产品。


技术实现要素：

6.基于此，本技术提供了一种检测胚胎植入前chr22:q13微缺失微重复的核酸产品及其应用。
7.根据本技术第一方面，提供了一种用于检测chr22:q13区域拷贝数变异的核酸产品，所述核酸产品包括如下引物对中的一对或多对：seq id no.1～2、seq id no.3～4、seq id no.5～6、seq id no.7～8、seq id no.9～10、seq id no.11～12、seq id no.13～14、seq id no.15～16、seq id no.17～18、seq id no.19～20、seq id no.21～22、seq id no.23～24、seq id no.25～26、seq id no.27～28、seq id no.29～30、seq id no.31～32、seq id no.33～34、seq id no.35～36、seq id no.37～38、seq id no.39～40、seq id no.41～42、seq id no.43～44、seq id no.45～46、seq id no.47～48、seq id no.49～
50、seq id no.51～52、seq id no.53～54、seq id no.55～56、seq id no.57～58、seq id no.59～60、seq id no.61～62、seq id no.63～64、seq id no.65～66、seq id no.67～68、seq id no.69～70、seq id no.71～72、seq id no.73～74、seq id no.75～76、seq id no.77～78、seq id no.79～80、seq id no.81～82、seq id no.83～84、seq id no.85～86、seq id no.87～88、seq id no.89～90、seq id no.91～92、seq id no.93～94、seq id no.95～96、seq id no.97～98、seq id no.99～100、seq id no.101～102、seq id no.103～104、seq id no.105～106、seq id no.107～108、seq id no.109～110、seq id no.111～112、seq id no.113～114、seq id no.115～116、seq id no.117～118、seq id no.119～120、seq id no.121～122、seq id no.123～124、seq id no.125～126、seq id no.127～128、seq id no.129～130、seq id no.131～132、seq id no.133～134、seq id no.135～136、seq id no.137～138、seq id no.139～140、seq id no.141～142、seq id no.143～144、seq id no.145～146、seq id no.147～148、seq id no.149～150、seq id no.151～152、seq id no.153～154、seq id no.155～156、seq id no.157～158、seq id no.159～160、seq id no.161～162、seq id no.163～164、seq id no.165～166、seq id no.167～168、seq id no.169～170、seq id no.171～172、seq id no.173～174、seq id no.175～176、seq id no.177～178、seq id no.179～180、seq id no.181～182、seq id no.183～184、seq id no.185～186、seq id no.187～188、seq id no.189～190、seq id no.191～192、seq id no.193～194、seq id no.195～196、seq id no.197～198、seq id no.199～200、seq id no.201～202、seq id no.203～204、seq id no.205～206、seq id no.207～208、seq id no.209～210、seq id no.211～212、seq id no.213～214、seq id no.215～216、seq id no.217～218、seq id no.219～220、seq id no.221～222、seq id no.223～224、seq id no.225～226、seq id no.227～228、seq id no.229～230、seq id no.231～232、seq id no.233～234和seq id no.235～236。
8.在其中一个实施例中，所述核酸产品包括seq id no.1～seq id no.236所示的引物对。
9.根据本技术的第二方面，提供了上述的核酸产品在制备22q13缺失综合征检测试剂盒中的应用。
10.根据本技术的第三方面，提供了一种用于检测22q13缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述的核酸产品。
11.在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括pcr反应试剂。
12.在其中一个实施例中，所述pcr反应试剂包括pcr缓冲液、dna聚合酶、镁离子和dntps中的一种或多种。
13.在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括dna提取试剂。
14.根据本技术的第四方面，一种基于非诊断目的的检测chr22:q13区域拷贝数变异的方法，包括以下步骤：
15.以待测样本的dna为模板，使用上述的核酸产品或上述的试剂盒进行pcr扩增，根据所得扩增结果获取所述待测样本chr22:q13及其上下游的snp位点的序列信息；
16.对所述序列信息进行分析，根据所得分析结果确定所述待测样本在chr22:q13是否存在微缺失和/或微重复。
17.在其中一个实施例中，获取序列信息的方法包括高通量测序法。
18.在其中一个实施例中，所述待测样本的dna为外周血基因组dna、精液dna、口腔粘膜细胞dna或细胞全基因组扩增产物。
19.与传统技术相比，本技术具有如下有益效果：
20.使用本技术的核酸产品对chr22:q13微缺失微重复区域内部及其上下游的snp位点进行多重pcr，然后对pcr扩增产物进行高通量测序，结合家系信息构建突变等位基因的单体型，在胚胎植入前判断胚胎基因型，最终确定子代的22q13综合征检测结果；同时，本技术的核酸产品能够同时检测118个snp位点，检测出小于1mb的cnv。
21.此外，本技术的检测方法能够同时检测多个样本，且具有成本低、通用性强、准确性高等优点。
具体实施方式
22.为使本技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本技术。但是本技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本技术内涵的情况下做类似改进，因此本技术不受下面公开的具体实施例的限制。
23.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。除非另有特别说明，本技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
24.术语
25.除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
26.本技术中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
27.本技术中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
28.本技术中“读段(reads)”是指测序获得的序列片段；“单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)”是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性；“单体型(haplotype)”是指位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型；“测序深度”是指pcr扩增产物被测序的次数。
29.本技术在chr22:q13及其上下游筛选得到如下118个snp位点：chr22:37195630、chr22:37195773、chr22:37202706、chr22:37206341、chr22:37221852、chr22:37221860、chr22:37226208、chr22:37228277、chr22:37343000、chr22:37347079、chr22:37348393、chr22:37377436、chr22:37438728、chr22:37531436、chr22:37532090、chr22:37535328、chr22:37554839、chr22:37570784、chr22:37570845、chr22:37636949、chr22:37637653、chr22:37711078、chr22:37723780、chr22:37746307、chr22:37776376、chr22:37795172、chr22:37831094、chr22:37856275、chr22:37857279、chr22:37960725、chr22:37970426、chr22:37970462、chr22:37983412、chr22:37985584、chr22:37987140、chr22:37996158、
no.175～176、seq id no.177～178、seq id no.179～180、seq id no.181～182、seq id no.183～184、seq id no.185～186、seq id no.187～188、seq id no.189～190、seq id no.191～192、seq id no.193～194、seq id no.195～196、seq id no.197～198、seq id no.199～200、seq id no.201～202、seq id no.203～204、seq id no.205～206、seq id no.207～208、seq id no.209～210、seq id no.211～212、seq id no.213～214、seq id no.215～216、seq id no.217～218、seq id no.219～220、seq id no.221～222、seq id no.223～224、seq id no.225～226、seq id no.227～228、seq id no.229～230、seq id no.231～232、seq id no.233～234和seq id no.235～236。
31.本技术实施例的核酸产品包括上述引物对中的1、2、3、4、5、
……
110、111、112、113、114、115、116、117、118对。
32.可以理解的是，通过检测染色体拷贝数变异，以了解染色体是否存在微缺失和/或微重复。检测chr22:q13拷贝数变异的情况，能够辅助确认植入前的胚胎是否携带chr22:q13综合征。
33.在一些具体示例中，上述引物对具有相近的退火温度，且pcr产物片段大小都在100bp～200bp范围内。
34.在其中一些实施方式中，上述的核酸产品包括seq id no.1～seq id no.236所示的引物对，引物信息如表1所示。
35.表1snp位点及引物序列表
36.37.38.39.[0040][0041]
本技术的另一些实施方式提供了一种上述核酸产品在制备22q13缺失综合征检测试剂盒中的应用。
[0042]
本技术的另一些实施方式还提供了一种包括上述核酸产品的试剂盒。
[0043]
在一些具体示例中，试剂盒中还包括pcr反应试剂。
[0044]
在一些具体示例中，pcr反应试剂包括pcr缓冲液、dna聚合酶、镁离子和dntps中的一种或多种。
[0045]
在一些具体示例中，试剂盒中还包括dna提取试剂。
[0046]
可以理解的是，在其他一些具体示例中，上述试剂盒可以不包括pcr反应试剂和dna提取试剂中的任意一些试剂，不包括的试剂可以合理从外部获得。
[0047]
使用本技术的试剂盒检测22q13缺失综合征，能够同时检测多个snp位点、多个样本的序列信息，且检测结果精确性高。
[0048]
本技术的另一些实施方式还提供了一种基于非诊断目的的检测chr22:q13区域拷贝数变异的方法，其特征在于，包括步骤s10和步骤s20：
[0049]
步骤s10：以待测样本的dna为模板，使用上述的核酸产品或试剂盒进行pcr扩增，根据所得扩增结果获取待测样本chr22:q13及其上下游的snp位点的序列信息。
[0050]
步骤s20：对序列信息进行分析，根据所得分析结果确定待测样本在chr22:q13是否存在微缺失和/或微重复。
[0051]
在一些具体示例中，步骤s20中，获取序列信息的方法包括高通量测序法。可以理解的是，获取序列信息的方法不限于此，也可以采用现有的其他获取序列信息的方法。可选地，基因组参考序列可来自公共数据库，如人类基因组序列可以是ncbi或者ucsc数据库中的人类基因组参考序列hg19、hg38等。
[0052]
在一些具体示例中，步骤s20还包括：将序列信息与亲代双方的dna序列进行比对，分析所述胚胎的单体型。
[0053]
在一些具体示例中，步骤s20还包括：将所述序列信息与人类基因组参考序列进行比对，分析snp覆盖倍数和基因型。
[0054]
在一些具体示例中，待测样本的dna包括外周血基因组dna、精液dna、口腔粘膜细胞dna或细胞全基因组扩增产物。
[0055]
可以理解的是，该方法的检测对象是未植入子宫的未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎或者来自已经死亡的胚胎等，不是以有生命的人体或者动物体为对象，其检测结果也不涉及其亲代双方的疾病诊断结果，因此不属于疾病的诊断和治疗方法。
[0056]
上述检测chr22:q13区域拷贝数变异的方法，具有通用性强、准确性高、快速高效等优点；通过检测chr22:q13区域的snp位点信息，在胚胎植入前明确染色体区域小于1mb的微缺失和/或微重复，进一步分析胚胎的基因型；为胚胎植入前的遗传检测提供了新的思路。
[0057]
下面将结合具体实施例和对比例对本技术作进一步说明，但不应将其理解为对本技术保护范围的限制。
[0058]
实施例1、snp位点的筛选与引物设计
[0059]
(1)snp位点的筛选：针对chr22:q13微缺失微重复区域及上下游，从千人基因组计划数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)中选取高频snp位点；选取最小等位基因频率均大于0.2的高频snp位点；去除多聚核苷酸(polyn)和位点上下游50bp序列中gc含量》70％的snp位点；去除上下游50bp序列比对到人类基因组hg19有多个位置的snp位点(即去除同源性高的snp位点)；优先选择基因内及基因(或突变位点)上下游1mb以内的snp位点，若1mb以内的snp数量少，可适当扩大范围，如上下游2mb。
[0060]
按照上述方法筛选到118个chr22:q13微缺失/微重复区域内及上下游的snp位点。
[0061]
(2)引物设计：针对步骤(1)中筛选到的118个snp位点，分别设计特异性引物(在线平台https://www.ampliseq.com/)，引物序列如seq id no.1～seq id no.236所示这些引物具有相近的退火温度，且pcr产物的片段大小都在100bp～200bp范围内。
[0062]
实施例2
[0063]
男方先天性聋哑，左眼为蓝色眼珠。cnv检测结果提示：22号染色体的q13.1区域发生0.51mb的缺失(seq[grch37/hg19]22q13.1(38020001-38530000)
×
1)。该区域涉及蛋白编码基因19个，其中omim收录的致病基因3个(pla2g6基因，sox10基因和triobp基因)，包含1个单倍剂量不足基因(sox10基因)。该cnv为致病性变异。该夫妇申请针对上述致病突变进行胚胎植入前遗传学检测(pgt)，生育健康后代。经pgt助孕，获得4枚胚胎，胚胎发育至囊胚期进行滋养层细胞活检，活检细胞经全基因组扩增后，进一步确定胚胎单体型4枚胚胎中，1枚为正常，3枚携带22q13.1区域缺失突变。该对夫妇移植了一枚正常胚胎，孕16周行产前超声诊断和染色体拷贝数变异(cnv)检测，b超提示胎儿发育正常，cnv检测提示胎儿染色体拷贝数正常，与pgt结果一致，后妊娠成功，生育一健康小孩。
[0064]
(1)多重pcr扩增：将实施例1中合成的118对引物混合到一个pcr反应管中，对样本进行118重反应，扩增受检样本chr22:q13微缺失/微重复区域内及上下游的snp位点。
[0065]
(2)建库和测序：按照illumina标准建库流程对活检细胞全基因组扩增产物进行建库，用miseq进行测序。当待测的dna分子来自多个受试样品时，每个样品可以被加上不同的标签序列(barcode)用以区分，从而实现同时对多个样品进行测序。
[0066]
(3)测序分析：通过bwa(burrow-wheeler-aligner)进行序列比对，将读段与参考基因组序列比对，得到读段在参考基因组上的位置。
[0067]
(4)数据分析：利用trimmomatic软件对illumina测序仪产生的原始数据去除接头序列，用bwa软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析单体型snp覆盖倍数和基因型；检测结果如表2所示。
[0068]
表2检测结果汇总
[0069]
编号姓名单体型致病基因检测(pgt-m)k16849女方m0/m1正常v5228男方f0/f1致病v5229女儿m1/f1正常p2451-gt1gt1m0/f0致病p2451-gt4gt4m0/f0致病p2451-gt5gt5m1/f0致病p2451-gt8gt8m1/f1正常
[0070]
注：m0、m1表示女方正常染色体；f0表示男方风险染色体，f1表示男方正常染色体。
[0071]
质控结果：平均测序深度均在100
×
以上，30
×
覆盖度均在70％，100
×
覆盖度均在50％，质控合格。
[0072]
有效snp位点统计如表3所示，可见男女方chr22:q13两侧1m以内分别有2个以上杂合snp位点，符合欧洲人类生殖与胚胎协会(eshre)“对于以扩增为基础的pgt实践指南”(2020年版)的要求。
[0073]
表3目标基因snp位点统计
[0074][0075]
胚胎snp单体型如表4所示，其中，f0表示男方风险染色体，f1表示男方正常染色体；m0表示女方正常染色体，m1表示女方正常染色体。其中，1～118号位点均位于致病位点内部；37～49号位点位于chr22:q13微缺失微重复区域内部。
[0076]
表4snp单体型
[0077]
[0078]
[0079][0080]
注：“/”表示该位点未检测到。
[0081]
上述结果表明，基于高通量测序技术，使用本技术的核酸产品能够检测样本中chr22:q13区域及上下游的多个snp位点，通过分析比对进一步确定胚胎是否为chr22:q13综合征致病基因的携带者。
[0082]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0083]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来
说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种用于检测chr22:q13区域拷贝数变异的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括如下引物对中的一对或多对：seq id no.1～2、seq id no.3～4、seq id no.5～6、seq id no.7～8、seq id no.9～10、seq id no.11～12、seq id no.13～14、seq id no.15～16、seq id no.17～18、seq id no.19～20、seq id no.21～22、seq id no.23～24、seq id no.25～26、seq id no.27～28、seq id no.29～30、seq id no.31～32、seq id no.33～34、seq id no.35～36、seq id no.37～38、seq id no.39～40、seq id no.41～42、seq id no.43～44、seq id no.45～46、seq id no.47～48、seq id no.49～50、seq id no.51～52、seq id no.53～54、seq id no.55～56、seq id no.57～58、seq id no.59～60、seq id no.61～62、seq id no.63～64、seq id no.65～66、seq id no.67～68、seq id no.69～70、seq id no.71～72、seq id no.73～74、seq id no.75～76、seq id no.77～78、seq id no.79～80、seq id no.81～82、seq id no.83～84、seq id no.85～86、seq id no.87～88、seq id no.89～90、seq id no.91～92、seq id no.93～94、seq id no.95～96、seq id no.97～98、seq id no.99～100、seq id no.101～102、seq id no.103～104、seq id no.105～106、seq id no.107～108、seq id no.109～110、seq id no.111～112、seq id no.113～114、seq id no.115～116、seq id no.117～118、seq id no.119～120、seq id no.121～122、seq id no.123～124、seq id no.125～126、seq id no.127～128、seq id no.129～130、seq id no.131～132、seq id no.133～134、seq id no.135～136、seq id no.137～138、seq id no.139～140、seq id no.141～142、seq id no.143～144、seq id no.145～146、seq id no.147～148、seq id no.149～150、seq id no.151～152、seq id no.153～154、seq id no.155～156、seq id no.157～158、seq id no.159～160、seq id no.161～162、seq id no.163～164、seq id no.165～166、seq id no.167～168、seq id no.169～170、seq id no.171～172、seq id no.173～174、seq id no.175～176、seq id no.177～178、seq id no.179～180、seq id no.181～182、seq id no.183～184、seq id no.185～186、seq id no.187～188、seq id no.189～190、seq id no.191～192、seq id no.193～194、seq id no.195～196、seq id no.197～198、seq id no.199～200、seq id no.201～202、seq id no.203～204、seq id no.205～206、seq id no.207～208、seq id no.209～210、seq id no.211～212、seq id no.213～214、seq id no.215～216、seq id no.217～218、seq id no.219～220、seq id no.221～222、seq id no.223～224、seq id no.225～226、seq id no.227～228、seq id no.229～230、seq id no.231～232、seq id no.233～234和seq id no.235～236。2.根据权利要求1所述的用于检测chr22:q13区域拷贝数变异的核酸产品，其特征在于，所述核酸产品包括seq id no.1～seq id no.236所示的引物对。3.权利要求1或2所述的核酸产品在制备22q13缺失综合征检测试剂盒中的应用。4.一种用于检测22q13缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～2任一项所述的核酸产品。5.根据权利要求4所述的用于检测22q13缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应试剂。6.根据权利要求5所述的用于检测22q13缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应试剂包括pcr缓冲液、dna聚合酶、镁离子和dntps中的一种或多种。
7.根据权利要求4～6任一项所述的用于检测22q13缺失综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dna提取试剂。8.一种基于非诊断目的的检测chr22:q13区域拷贝数变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样本的dna为模板，使用权利要求1～2任一项所述的核酸产品或权利要求4～7任一项所述的试剂盒进行pcr扩增，根据所得扩增结果获取所述待测样本chr22:q13及其上下游的snp位点的序列信息；对所述序列信息进行分析，根据所得分析结果确定所述待测样本在chr22:q13是否存在微缺失和/或微重复。9.根据权利要求8所述的检测chr22:q13区域拷贝数变异的方法，其特征在于，获取序列信息的方法包括高通量测序法。10.根据权利要求8～9任一项所述的检测chr22:q13区域拷贝数变异的方法，其特征在于，所述待测样本的dna为外周血基因组dna、精液dna、口腔粘膜细胞dna或细胞全基因组扩增产物。

技术总结
本申请提供了一种检测Chr22:q13区域拷贝数变异的核酸产品及其应用，所述核酸产品选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.236中的至少一对。使用上述核酸产品进行多重PCR，能够在胚胎植入前同时检测Chr22:q13区域及其上下游的多个SNP位点，从而确定胚胎的基因型，并辅助确定胚胎是否具有Chr22:q13综合征。胎是否具有Chr22:q13综合征。


技术研发人员：戴婧 杜娟 胡晓 林戈 何文斌 张毅 万振兴
受保护的技术使用者：湖南光琇高新生命科技有限公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/13