一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法

1.本发明属于病虫害监测技术领域，涉及一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法。


背景技术：

2.小麦白粉病是由禾布氏白粉菌小麦专化型blumeriagraminisf. sp.tritici引起的气传多循环病害，是中国小麦生产上的主要病害之一，制约着中国小麦的高产和稳产。
3.长期以来，中国小麦白粉病的监测方法大量依赖传统的人工调查方法，随着智慧农业技术日新月异的发展，遥感监测技术、病菌孢子捕捉技术、图像识别技术、人工智能技术等新技术能够对该病害的实际发病情况实现更高效、便捷的监测。然而小麦白粉病菌侵染小麦叶片后，在侵染早期以及冬季低温等不利环境条件下时，小麦往往处于潜伏侵染状态而不表现发病症状，且受侵染的叶片常常与正常叶片无视觉上差异。因此，传统人工方法调查或遥感等新监测技术就无法或很难准确获取小麦白粉病菌实际侵染情况，容易造成漏判，进而无法达到全面、准确监测病害的目的。
4.目前，能够实现小麦白粉病发病情况监测的技术已有多种，但能够实现白粉菌潜伏侵染菌源量定量检测和监测的技术亟缺。real-time pcr技术是目前能够对这种潜伏侵染的小麦白粉菌菌源量进行精确检测的主要技术，但该技术需要专业人员采样后在实验室内进行操作，且耗时耗力，难以应用到实时的农田病害快速检测。
5.因此，更快速、高效、便捷的实现小麦白粉病菌潜伏侵染量检测的检测技术手段，在小麦白粉病及时准确监测中具有重要的应用潜力和价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，以能够通过叶绿素荧光成像技术结合人工神经网络模型的方法，快速、准确、无损、操作简便的用于田间小麦白粉病显症前（侵染早期或者因低温等不适条件未显示明显症状）潜伏侵染菌源量的定量检测。
7.为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，所述的定量方法包括如下步骤：（1）对受小麦白粉菌侵染后但尚未表现病症的小麦叶片进行叶绿素荧光成像检测；（2）提取叶绿素荧光检测参数；（3）通过随机森林算法筛选得到最适的可用于检测白粉菌潜伏侵染菌源量的叶绿素荧光参数；（4）构建基于最适叶绿素荧光参数的小麦白粉菌潜伏侵染量的人工神经网络模型。
8.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方
法，其中步骤（1）中，所述的叶绿素荧光成像检测为利用叶绿素荧光成像系统imaging-pam进行检测。
9.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，其中步骤（1）中，进行叶绿素荧光成像检测时，参试小麦叶片在开始检测之前，需在无光条件下的植物测量室内暗适应15-25 min；将小麦叶片固定好后，叶绿素荧光成像检测步骤为：先打开测量光，测定暗适应下小麦叶片的最小荧光fo；再打开饱和脉冲光，测量得到小麦叶片的最大荧光fm；随后打开光化光，所测小麦叶片进行光合作用，打开饱和脉冲光得到光适应后的最大荧光fm’。
10.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，其中步骤（2）中，利用imagingwin提取14个叶绿素荧光检测参数，分别为叶片的psii最大光化学量子产量fv/fm、基础荧光fo、暗适应后的最大荧光fm、光下最大荧光fm’、荧光f、光下最小荧光fo’、psii实际光合效率y(ii)、调节性能量耗散的量子产额y（npq）、非调节性能量耗散的量子产额y（no）、非光化学淬灭npq/4、非光化学淬灭系数qn、光化学淬灭系数qp、光化学淬灭系数ql、相对电子传递速率etr。
11.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，其中步骤（3）中，基于随机森林算法评估的预测因子权重，得到两个最适叶绿素荧光参数，分别为最大光化学量子产量fv/fm和光化学淬灭系数ql。
12.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，其中步骤（4）中，所述的人工神经网络共有4层，包括一个输入层（最大光化学量子产量fv/fm和光化学淬灭系数ql）、两个隐含层（采用tanh激活函数，solver为“adam”）和一个输出层（小麦白粉病菌潜伏侵染量）。
13.在一种优选的实施方案中，本发明提供一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，其中利用筛选得到的最适叶绿素荧光参数和机器学习方法定量预测小麦白粉病菌的潜伏侵染量。
14.本发明的有益效果在于，利用本发明的小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，能够通过叶绿素荧光成像技术结合人工神经网络模型的方法，快速、准确、无损、操作简便的用于田间小麦白粉病显症前（侵染早期或者因低温等不适条件未显示明显症状）潜伏侵染菌源量的定量检测。
15.本发明利用叶绿素荧光检测技术，在imagingwin软件中获得了14个主要叶绿素荧光检测参数，通过随机森林方法筛选得到最适的可用于小麦白粉病菌潜伏侵染量定量检测的叶绿素荧光参数fv/fm和ql；在此基础上，通过机器学习方法构建了基于最适叶绿素荧光参数的小麦白粉菌潜伏侵染量的人工神经网络模型。
16.本发明将叶绿素荧光检测结合机器学习定量法，是一种简单、快速、无损和准确性高的定量方法，可以适用于田间小麦白粉病显症前（侵染早期或者因低温等不适条件未显示明显症状）潜伏侵染菌源量的快速定量检测，解决了白粉病菌处于潜伏侵染阶段难以被有效监测的技术难题，为此病害的准确监测和预测提供了技术支撑。
17.本发明还可为其他病原菌的田间早期快速检测提供参考。
附图说明
18.图1为示例性的本发明的小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法的流程图。
具体实施方式
[0019] 以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
[0020]
实施例1本实施例的示例性的小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法的流程如图1所示，其中使用的叶绿素荧光成像系统（imaging-pam，德国walz公司）主要包括：主控单元 imag-cg、mini-探头（蓝光版）imag-min/b、ccd检测器、镜头、叶夹和手柄等。
[0021]
mini-探头的led光源分为四组，每组分别由三个带有平行光学校正的超强发光二极管组成。每组led光源前面有一个长波截止滤光片，以去除红光对于叶绿素荧光的干扰。所有led光源在7 cm的范围内形成一个匀质的光场，目的是更好地提供测定所需的测量光、光化光（驱动光合作用）和饱和脉冲光（暂时抑制光合作用）。此外，还有另外四组led光源成对排列，每一对均包含一个红光（660 nm）和一个远红光（780 nm）led，通过提供一种调制脉冲光来测定样品的吸光系数。
[0022]
标准mini-探头镜头与样品间的距离为7 cm，位于led光源的正上方，此距离可以保证获得24
×
32 mm的荧光图像。
[0023]
步骤一：准备小麦离体叶段苗将
‘
众麦2号’小麦品种种植在用玻璃罩罩起的塑料盆内（防止污染），待小麦一叶完全展开时，在无菌条件下将叶片剪成长约4 cm的叶段，整齐摆放入10 cm
×
10 cm方形培养皿中的水琼脂培养基上，每皿对应一个小麦白粉菌孢子悬浮液浓度，每皿设置3个重复，每重复放置5片叶段苗，每皿共15片叶段。
[0024]
步骤二：收集小麦白粉菌并配制成0、4、8、12 mg/ml的小麦白粉菌孢子悬浮液将刚收取并称重为0、30、60和90 mg的小麦白粉菌孢子粉分别置于盛有7.5 ml电子氟化液的喷壶中，涡旋振荡15 s，配置成0、4、8、12 mg/ml的小麦白粉菌孢子悬浮液，混匀后对小麦离体叶段进行喷雾接种，其中0 mg/ml作为不接菌对照组。
[0025]
步骤三：用小麦白粉菌孢子悬浮液按浓度梯度由低到高对小麦离体叶段苗进行接菌用小麦白粉菌孢子悬浮液在无菌操作台内按浓度梯度由低到高（0（对照）、4、8、12 mg/ml）对小麦离体叶段苗进行接菌，每皿喷施1.5 ml孢子悬浮液，每个接菌浓度设置3个重复，接菌后将小麦离体叶段苗置于（18
±
1）℃光照培养箱内培养。
[0026]
步骤四：于接菌后的第2 d、3 d、4 d、5 d利用叶绿素成像仪（imaging-pam）对接种的小麦离体叶段苗进行叶绿素荧光成像检测开始检测之前，参试材料需在无光条件下的植物测量室内暗适应20 min。将接菌后的5段小麦离体叶段苗（一个浓度的一个重复）放置到成像区域，用仪器自带的夹子固定叶片。在叶绿素荧光成像系统（imaging-pam）操作界面上添加5个矩形aoi（area of interest），将图像分割成5个叶段。然后设置测量光（meas. light）的强度（int.）和增益（gain），使 aoi区域的荧光值在0.1附近，光化光（act. light）的强度为204 umol
·
m-2
·
s-1
。选择窗口上部kinetics选项卡，选择induction curve，点击窗口右侧的start按钮，仪器
开始测定荧光诱导动力学曲线（持续约5 min）。测量结束后将文件保存为pim文件格式。
[0027]
步骤五：利用imagingwin软件提取14个主要叶绿素荧光检测参数利用imagingwin分析软件对实施例1获得的相应的叶绿素荧光成像检测图像进行分析，通过勾选report中的所有aoi和荧光参数可以导出每个叶段的暗适应下最大光化学量子产量（fv/fm）、基础荧光（fo）、暗适应后的最大荧光（fm）、光下最大荧光（fm’）、荧光（f）、光下最小荧光（fo’）、psii实际光合效率y（ii）、调节性能量耗散的量子产额y（npq）、非调节性能量耗散的量子产额y（no）、非光化学淬灭（npq/4）、非光化学淬灭系数（qn）、光化学淬灭系数（qp）、光化学淬灭系数（ql）、相对电子传递速率（etr）等14个参数。
[0028]
步骤六：对叶绿素荧光成像检测后的小麦离体叶段苗内潜伏侵染的白粉病菌量进行real-time pcr定量检测，检测得到的白粉菌dna量作为小麦白粉菌的潜伏侵染量，作为y值，用于后续的人工神经网络模型建立。
[0029]
利用ctab法立即对叶绿素荧光成像检测后的小麦叶段苗进行dna提取，利用小麦白粉菌特异性引物bgt-f/bgt-r进行real-time pcr扩增，根据标准曲线计算得到小麦白粉菌的潜伏侵染量（参见：zheng y m, luo y, zhou y l, zeng x w, duan x y, cao x r, song y l, wang b t, 2013. real-time pcrquantification of latent infection of wheat powdery mildew in the field. european journal of plant pathology, 136(3): 565-575.）。
[0030]
步骤七：通过随机森林方法对叶绿素荧光参数进行筛选，得到最适的可用于小麦白粉病菌潜伏侵染量检测的叶绿素荧光参数通过随机森林排序方法计算，将14个叶绿素荧光参数作为自变量，潜伏侵染量为因变量，利用随机森林算法中的准确率降低法来计算14个叶绿素荧光参数对潜伏侵染量贡献，由此得到接菌后第2 d、3 d、4 d、5 d预测因子的重要性，仅展示排名前五的预测因子，结果如下：第2 d：fv/fm（0.175）、fo（0.112）、ql（0.093）、fo’（0.077）、etr（0.069）；第3 d：fv/fm（0.234）、ql（0.104）、fm（0.062）、y（ⅱ）（0.060）、y（npq）（0.060）；第4 d：ql（0.149）、fv/fm（0.127）、qp（0.101）、fo’（0.072）、f（0.071）；第5 d：ql（0.144）、y（no）（0.128）、qp（0.082）、npq/4（0.077）、f（0.074）。由此筛选得到可用于小麦白粉病菌潜伏侵染量检测的最适叶绿素荧光参数：psii最大光化学量子产量fv/fm和光化学淬灭系数ql。
[0031]
步骤八：利用上述筛选出的叶绿素荧光参数fv/fm和ql，建立小麦白粉菌潜伏侵染量的人工神经网络模型，可用于小麦白粉菌潜伏侵染菌源量的定量检测，具体方法为：将所有数据按训练集和测试集分为9：1，建立步骤：示例性的全连接神经网络共有4层，包括一个输入层（最大光化学量子产量fv/fm和光化学淬灭系数ql）、两个隐含层（采用(50,50)，tanh激活函数，solver为“adam”，max_iter=5000）和一个输出层（小麦白粉病菌潜伏侵染量）。采用的软件是python3.9、pycharm 2019.2.5、pandas 1.3.0、sklearn 0.0.post5，训练后的模型对于接菌后第2 d、3 d、4 d、5 d的侵染量的r2分别达到1.00、0.99、0.99、0.97。

技术特征：
1.一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，其特征在于，包括对受小麦白粉菌侵染后但尚未表现病症的小麦叶片进行叶绿素荧光成像检测，提取叶绿素荧光检测参数，通过随机森林算法筛选得到最适的用于检测白粉菌潜伏侵染菌源量的叶绿素荧光参数，构建基于最适叶绿素荧光参数的小麦白粉菌潜伏侵染量的人工神经网络模型。2.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，利用筛选得到的最适叶绿素荧光参数与机器学习方法结合定量预测小麦白粉病菌的潜伏侵染量。3.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，利用叶绿素荧光成像系统进行叶绿素荧光成像检测，参试小麦叶片在开始检测之前，需在无光条件下的植物测量室内暗适应15-25 min；将小麦叶片固定好后，叶绿素荧光成像检测步骤为：先打开测量光，测定暗适应下小麦叶片的最小荧光；再打开饱和脉冲光测量得到小麦叶片的最大荧光；随后打开光化光，所测小麦叶片进行光合作用，打开饱和脉冲光得到光适应后的最大荧光。4.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，利用imagingwin提取14个叶绿素荧光检测参数，分别为叶片的psii最大光化学量子产量、基础荧光、暗适应后的最大荧光、光下最大荧光、荧光、光下最小荧光、psii实际光合效率、调节性能量耗散的量子产额、非调节性能量耗散的量子产额、非光化学淬灭、非光化学淬灭系数、光化学淬灭系数、光化学淬灭系数以及相对电子传递速率。5.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于：基于随机森林算法评估的叶绿素荧光检测参数权重，得到两个最适叶绿素荧光参数，分别为最大光化学量子产量和光化学淬灭系数。6.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述的人工神经网络共有4层，包括一个输入层、两个隐含层和一个输出层。

技术总结
本发明属于病虫害监测技术领域，涉及一种小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法。所述的定量方法包括如下步骤：（1）对受小麦白粉菌侵染后但尚未表现病症的小麦叶片进行叶绿素荧光成像检测；（2）提取叶绿素荧光检测参数；（3）通过随机森林算法筛选得到最适的可用于检测白粉菌潜伏侵染菌源量的叶绿素荧光参数；（4）构建基于最适叶绿素荧光参数的小麦白粉菌潜伏侵染量的人工神经网络模型。利用本发明的小麦白粉病菌潜伏侵染量的定量方法，能够通过叶绿素荧光成像技术结合人工神经网络模型的方法，快速、准确、无损、操作简便的用于田间小麦白粉病显症前（侵染早期或者因低温等不适条件未显示明显症状）潜伏侵染菌源量的定量检测。示明显症状）潜伏侵染菌源量的定量检测。示明显症状）潜伏侵染菌源量的定量检测。


技术研发人员：刘伟 马明慧 聂晓 王奥霖 范洁茹 周益林
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/8/13