一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及一种免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法及其应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)是一种进行性神经退行性疾病，是最常见的痴呆症类型，以β-淀粉样蛋白(aβ)斑块形成、细胞内tau蛋白聚集、神经元和突触丢失等病理表现为特征。根据其患病程度，可以分为3个阶段，正常阶段(normal control，nc)，轻度认知障碍阶段(mild cognitive impatient，mci)，阿尔兹海默症阶段(alzheimer’s disease，ad)。
3.20世纪初由alzheimer首次发现这一种神经退行性疾病，主要表现为后天获得性的认知能力(包括记忆力、观察力、想象力、计算能力等)恶化，日常生活能力降低，导致不能独立地生活、学习、工作。其中记忆力减退是阿尔茨海默病最早、最主要的认知能力下降的表现。mci阶段是ad阶段的早期状态，此阶段的患者极大可能转为ad阶段患者。随着人口老龄化的进展，ad发病率逐年增加，给社会带来巨大的经济负担。所以在mci阶段对患者进行早期诊断，延缓此病的发展，从而减少对家庭和社会的压力是十分有意义的。
4.目前，对ad的诊断仍存在困难，生物标志物对于准确和早期识别ad至关重要，也是有效治疗该病的先决条件。目前临床上阿尔兹海默症的诊断方法主要是认知能力测试、神经影像学检查。神经心理量表测验是对ad患者进行认知领域的评估，主要有记忆功能，言语功能，定向力，应用能力，注意力，知觉和执行功能七个领域。影像学检查是诊断ad的重要手段，包括ct、mri和pet。pet是一种比较新的影像方法，包括fdg-pet和淀粉样蛋白-pet，前者是脑代谢的有效生物标记物，反映突触活性，而后者是反映脑皮层中淀粉样蛋白沉积的生物标记物。fdg-pet和淀粉样蛋白-pet是早期诊断ad的重要生物标志物，利用上述方法可协助医师进行临床诊断，但成本较高，用时较长，难以在症状不明显人群、低收入人群和不发达地区普及。近些年来生物标记物为人们所关注，生物标志物可以建立早期诊断、评估风险、评估疾病阶段以及监测进展和治疗反应，这对于阿尔兹海默症治疗有重要意义。tau蛋白有超过40个磷酸化位点，su
á
rez-calvet m等(2020)比较了p-tau217、p-tau181、p-tau231三种tau蛋白与ad的相关性，发现p-tau181在mci阶段有显著升高。p-tau217、p-tau181、p-tau231是反映ad患者的重要指标。由神经元内高磷酸化tau组成的神经纤维缠结是阿尔茨海默病(ad)的标志性病理特征之一。测量脑脊液(csf)中苏氨酸181、217、231磷酸化的tau(p-tau181，p-tau217，p-tau231)的免疫测定法已被开发出来，作为神经纤维缠结的生物标志物，以支持ad痴呆症的临床诊断几年中，一些研究表明，血浆p-tau181、p-tau217和p-tau231是临床ad谱系中淀粉样蛋白和tau病理学的指标，可以将ad痴呆与其他神经退行性疾病区分开来。血浆p-tau217在ad早期阶段作为脑萎缩纵向变化的标志物更为有效。众多研究表明血液ad生物标志物这一方便的检测手段来检测ad患者病情进展和评估
治疗效果。然而，由于血液磷酸化tau含量低，nc时期甚至低至几十飞克(fg)，mci阶段只有1-2皮克(pg)，在ad阶段的含量也不过是十几到几十个pg，目前，对这些低丰度蛋白进行精确和有效检测的需求还得不到满足，需要开发出更为敏感的免疫检测方法。


技术实现要素：

5.为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种更为敏感、操作简单、稳定性好、结果清晰、易于判断保存、检测成本低的用于检测低丰度阿尔兹海默症信号级联放大的荧光标记检测物质的制备及其应用。
6.本发明采取的技术方案如下：
7.一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其包括以下步骤：
8.(1)sa-pamam树状大分子的制备：将表面活性基团为羧基修饰的g1.0代的pamam树状大分子与链霉亲和素进行偶联，将pamam用n-羟基琥珀酰亚胺液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液在酸性环境中活化，加入链霉亲和素，避光混合孵育，得到sa-pamam树状大分子；
9.(2)sa-pamam-sh树状大分子的制备：以步骤(1)获得的sa-pamam树状大分子为中心，将sa-pamam树状大分子和表面活性基团为巯基修饰的pamam-peg-sh树状大分子混合后，加入乙二胺的甲醇溶液进行酞胺化反应，生成0.5代的sa-pamam-sh树状大分子产物；之后加入丙烯酸甲酯的甲醇溶液进行加成反应，生成1.0代的sa-pamam-sh树状大分子产物；交替重复进行上述两个反应步骤，得到代数依次增加的sa-pamam-sh树状大分子产物；
10.(3)sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子的制备：用n-马来酰亚胺在酸性环境中活化步骤(2)获得的sa-pamam-sh树状大分子，偶联藻红蛋白pe即可得到sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子染料。
11.上述的一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其所述pamam树状大分子的分子量为2230。
12.上述的一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其所述pamam-peg-sh树状大分子的分子量为2000。
13.上述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其所述sa-pamam树状大分子的制备包括：取1ml浓度为1mmol/l的pamam溶液，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复3次；加入900μl mes缓冲液(ph5.0)，称取nhs和edc分别加入纯水配制成50mg/ml的nhs和10mg/ml的edc的溶液；在pamam溶液中加入10μl的nhs和edc溶液，充分混匀后，室温避光振荡孵育20min，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次；加入900μl1
×
pbs缓冲液重悬，并加入100μl的sa溶液，混匀后室温避光振荡孵育2h，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，加入1ml甲醇溶液重悬后静置存放。
14.上述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其所述sa-pamam-sh树状大分子的制备包括：取1ml pamam-peg-sh溶液，与所述步骤(1)中的sa-pamam溶液混合，按照sa-pamam树状大分子与乙二胺的甲醇溶液1:8的比例加
入16ml乙二胺的甲醇溶液，塞上塞子磁力搅拌混匀，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g0.5代sa-pamam-sh产物；取1ml g0.5代sa-pamam-sh树状大分子，按照sa-pamam-sh树状大分子与丙烯酸甲酯的甲醇溶液1:8的比例加入8ml丙烯酸甲酯的甲醇溶液，塞上塞子磁力搅拌，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g1.0代sa-pamam-sh树状大分子；交替重复进行上述反应步骤，得到g2.0代sa-pamam-sh树状大分子。
15.上述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其所述sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子的制备包括：
16.用pe荧光染料标记g2.0代sa-pamam-sh树状大分子，取1ml的sa-pamam-sh树状大分子溶液，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复3次；
17.加入900μl mes缓冲液：称取一定量的n-马来酰亚胺，加入mes缓冲液配制成10mg/ml的n-马来酰亚胺溶液，在sa-pamam-sh溶液中加入50μl的n-马来酰亚胺溶液，混匀后室温避光振荡孵育20min，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次；
18.加入900ml的mes缓冲液重悬后，加入100μl的pe荧光染料，室温避光振荡孵育30min，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，加入1ml 1
×
pbs重悬后避光静置。
19.上述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其所述1
×
pbs缓冲液为10mmol/l磷酸缓冲液，ph7.4；所述mes缓冲液为0.05mol/l的mes缓冲液，ph6.8。
20.上述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其所述的丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，丙烯酸甲酯和甲醇溶液的混合比例为1:1。
21.上述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其所述乙二胺的甲醇溶液中，乙二胺和甲醇溶液的混合比例为1:1。
22.一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的应用，其所述的荧光树状大分子用于检测神经标志物，包括阿尔兹海默症，肿瘤标志物，fpsa低丰度生物标志物。。
23.有益效果：
24.本发明制备的sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子中心有核，内部有空腔，具有大量支化单元。体积、形状、功能基团以及分子量都可以在分子水平加以控制。高度支化，具有规整，精致的空间结构，高代数树状大分子呈球形，纳米级尺寸，表面结合了大量pe荧光染料，可以大幅提高蛋白检测的荧光信号强度。具有良好的溶解性，粘度很低。
25.本发明检测信号级联放大的荧光检测物质适合于所有流式检测试剂盒，具有操作简单、稳定性好、结果清晰、易于判断保存、检测成本低的优点。同时，该方法还可以被进一步延伸到大量的低丰度标志物样品的免疫检测中；作为一种通用检测方法，还将适于多种产品种类的检测。因此本发明具有广阔的应用前景。
附图说明
26.图1为pamam树状大分子合成流程图。
27.图2为pamam树状大分子合成示意图。
28.图3为sa-pamam-sh树状分子pe标记示意图。
29.图4为不同代别的荧光物质检测神经标志物抗原的浓度趋势。
30.图5为不同比例的pe结合荧光物质检测神经标志物抗原的浓度趋势。
具体实施方式
31.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，基于本发明中的实施例，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
32.实施例1
33.参照图1-3，本实施例提供一种荧光检测体系，包括如下成分：
34.(1)反应缓冲液(t-ab)：20mmol/l tris缓冲液，ph7.4。
35.(2)10
×
洗液(10
×
wb)：含0.5％ tween 20(吐温-20)的100mmol/l磷酸缓冲液，ph6.4。
36.(3)偶联微珠悬液(cap-beads)：分别将p-tau181、p-tau217、p-tau231单克隆抗体以共价交联方式结合到三种不同的荧光编码微珠上，将三种偶联微珠等量组合后稀释成浓度为100bds/μl的偶联微珠悬液。
37.(4)生物素标记检测分子(detection)：用生物素标记的tau单抗，再将生物素标记抗体稀释成规定浓度的生物素标记检测分子。
38.(5)终止检测液(stop buffer)：含0.102％(v/v)proclin的20mmol/l磷酸缓冲液，ph7.4。
39.本发明公开一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法：
40.①
sa-pamam树状大分子的制备，取1ml浓度为1mmol/l的pamam溶液，pamam树状大分子的分子量为2230。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复3次。1
×
pbs缓冲液为10mmol/l磷酸缓冲液，ph7.4。加入900μl mes缓冲液，mes缓冲液为0.05mol/l的mes缓冲液，ph5.0。称取nhs和edc，分别用纯化水配制成50mg/ml的nhs和10mg/ml的edc溶液。在pamam溶液中分别加入10μl的nhs和edc溶液，混匀后室温避光振荡孵育20min。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 磷酸缓冲液，ph6.0重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次。加入900μl磷酸缓冲液(ph6.0)ph6.0重悬，并加入100μl的sa溶液，混匀后室温避光振荡孵育2h。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，加入1ml甲醇溶液重悬后避光静置。
41.②
sa-pamam-sh树状大分子的制备，取1ml pamam-peg-sh溶液，pamam-peg-sh树状大分子的分子量为2000，与(1)中的sa-pamam溶液混合，加入三颈瓶中，按照sa-pamam树状大分子与乙二胺的甲醇溶液1:8的比例用滴液漏斗加入16ml乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的甲醇溶液中乙二胺和甲醇溶液的混合比例为1:1，塞上塞子磁力搅拌，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g0.5代产物。取1ml g0.5代产物加入三颈瓶中，按照树状大分子与丙烯酸甲酯的甲醇溶液1:8的比例用滴液漏斗加入8ml丙烯酸甲酯的甲醇溶液，
丙烯酸甲酯的甲醇溶液中丙烯酸甲酯和甲醇溶液的混合比例为1:1，塞上塞子磁力搅拌，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g1.0代产物。交替重复进行上述两个反应步骤，得到g2.0代产物。
42.③
sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子的制备方法，用pe荧光染料标记g2.0代sa-pamam-sh树状大分子。取1ml的sa-pamam-sh树状大分子溶液，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复洗涤3次。
43.加入900μl mes缓冲液。称取1mg的n-马来酰亚胺，加入100μlmes缓冲液配制成10mg/ml的n-马来酰亚胺溶液。在sa-pamam-sh溶液中加入50μl的n-马来酰亚胺溶液，混匀后室温避光振荡孵育20min。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次。加入900ml的mes缓冲液重悬后，加入100μl的pe荧光染料，室温避光振荡孵育30min。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，加入1ml 1
×
pbs重悬后避光静置。
44.实施例2
45.本实施例提供一种不同代别的sa-pamam-sh树状大分子与pe荧光染料结合的sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子的制备方法：
46.(1)sa-pamam树状大分子的制备，取1ml浓度为1mmol/l的pamam溶液，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复3次。1
×
pbs缓冲液为10mmol/l磷酸缓冲液，ph7.4。加入900μl mes缓冲液，mes缓冲液为0.05mol/l的mes缓冲液，ph5.0。称取一定量nhs和edc，分别用纯水配制成50mg/ml的nhs和10mg/ml的edc的溶液。在pamam溶液中加入10μl的nhs和edc溶液，混匀后，室温振荡孵育20min。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次。加入900μl1
×
pbs缓冲液重悬，并加入100μl的sa溶液，颠倒混匀后，室温振荡孵育2h。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，加入1ml甲醇溶液重悬后静置存放。
47.(2)sa-pamam-sh树状大分子的制备，取1ml pamam-peg-sh溶液，与(1)中的sa-pamam溶液混合，加入三颈瓶中，按照树状大分子与乙二胺的甲醇溶液1:8的比例用滴液漏斗加入16ml乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的甲醇溶液中乙二胺和甲醇溶液的混合比例为1:1，塞上塞子磁力搅拌，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g0.5代产物。取1ml g0.5代产物加入三颈瓶中，按照树状大分子与丙烯酸甲酯的甲醇溶液1:8的比例用滴液漏斗加入8ml丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的甲醇溶液中丙烯酸甲酯和甲醇溶液的混合比例为1:1，塞上塞子磁力搅拌，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g1.0代产物。交替重复进行上述两个反应步骤，得到代数依次增加的sa-pamam-sh树状大分子产物g0.5-g5.0。
48.(3)sa-pamam-poly(pe)树状大分子荧光染料的制备方法，其特征在于：用pe荧光染料标记g2.0代sa-pamam-sh树状大分子。取1ml的sa-pamam-sh树状大分子溶液，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复3次。
49.加入900μl mes缓冲液。称取1mg的n-马来酰亚胺，加入100μlmes缓冲液配制成10mg/ml的n-马来酰亚胺溶液。在sa-pamam-sh溶液中加入50μl的n-马来酰亚胺溶液，颠倒
混匀后，室温避光振荡孵育20min。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次。
50.加入900ml的mes缓冲液重悬后，加入100μl的pe荧光染料，室温避光振荡孵育30min。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，加入1ml 1
×
pbs重悬后避光静置。
51.实施例3
52.本实施例提供一种同一代别的sa-pamam-sh树状大分子与不同添加量的pe荧光染料结合的sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子的制备方法：
53.(1)sa-pamam树状大分子的制备，取1ml浓度为1mmol/l的pamam溶液，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复3次。1
×
pbs缓冲液为10mmol/l磷酸缓冲液，ph7.4。加入900μl mes缓冲液，mes缓冲液为0.05mol/l的mes缓冲液，ph6.8。称取一定量的nhs和edc，分别用纯水配制成50mg/ml的nhs和10mg/ml的edc的溶液。在pamam溶液中加入10μl的nhs和edc溶液，混匀后室温振荡孵育20min。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次。加入900μl1
×
pbs缓冲液重悬，并加入100μl的sa溶液，颠倒混匀后，室温避光振荡孵育2h。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，加入1ml甲醇溶液重悬后静置存放。
54.(2)sa-pamam-sh树状大分子的制备，取1ml pamam-peg-sh溶液，与(1)中的sa-pamam溶液混合，加入三颈瓶中，按照树状大分子与乙二胺的甲醇溶液1:8的比例用滴液漏斗加入16ml乙二胺的甲醇溶液，乙二胺的甲醇溶液中乙二胺和甲醇溶液的混合比例为1:1，塞上塞子磁力搅拌，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g0.5代产物。取1ml g0.5代产物加入三颈瓶中，按照树状大分子与丙烯酸甲酯的甲醇溶液1:8的比例用滴液漏斗加入8ml丙烯酸甲酯的甲醇溶液，丙烯酸甲酯的甲醇溶液中丙烯酸甲酯和甲醇溶液的混合比例为1:1，塞上塞子磁力搅拌混匀，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g1.0代产物。交替重复进行上述两个反应步骤，得到g2.0代产物。
55.(3)sa-pamam-poly(pe)树状大分子荧光染料的制备方法，其特征在于：用pe荧光染料标记g2.0代别的sa-pamam-sh树状大分子。取1ml的sa-pamam-sh树状大分子溶液，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复3次。
56.加入900μl mes缓冲液。称取1mg的n-马来酰亚胺，加入100μlmes缓冲液配制成10mg/ml的n-马来酰亚胺溶液。在sa-pamam-sh溶液中加入50μl的n-马来酰亚胺溶液，颠倒混匀后，室温避光振荡孵育20min。12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次。
57.按照表1混合sa-pamam-sh树状大分子和pe荧光染料，室温避光振荡孵育30min。12000rpm离心20min，吸去上清，每管加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，每管加入0.1ml 1
×
pbs重悬后避光静置存放。
58.表1.sa-pamam-sh与pe荧光染料的添加比例
59.[0060][0061]
实验例1
[0062]
(1)实验目的：用于检测阿尔兹海默症血液低丰度标志物。测试实施例1中所述的荧光检测系统与sa-pe检测系统的差别。
[0063]
(2)实验设计：从徐州市医科大学附属医院收集阿尔兹海默症血浆样本(每个指标20例)，用实施例1中所述的荧光检测系统(实验组)与sa-pe检测系统(对照组)同时检测，对比检测浓度值。
[0064]
(3)实验过程：
[0065]
用纯化水复溶抗原cal1和神经标志物抗原稀释液，室温静置10分钟，混合均匀后备用。用神经标志物抗原稀释液梯度稀释神经标志物抗原。
[0066]
取96孔板，分别向每孔中加入25μl反应缓冲液(t-ab)和标记检测抗体(detection)，分别向每孔中加入25μl旋涡充分混匀的偶联微珠悬液，分别向每孔中加入25μl样本，充分混匀。37℃恒温震荡反应1.5小时(振荡速度：700rpm)。
[0067]
直接加入150μl 1
×
洗液，磁分离2-3分钟，倒掉液体(此过程96孔板一直置于磁力架上，倒扣于低尘吸水纸上，吸去残液)，再加入200μl 1
×
洗液，磁分离2-3分钟，倒掉洗液，用低尘吸水纸吸去残液，并从磁力架上取下96孔板。
[0068]
向实验组每孔中加入50μl sa-pamam-poly(pe)树状大分子荧光染料；向对照组每孔中加入50μl sa-pe(1.25μg/ml)，贴封口膜，混匀贴封口膜，混匀。37℃恒温震荡反应0.5小时，(振荡速度：700rpm)
[0069]
直接加入150μl 1
×
洗液,磁分离2-3分钟，倒掉液体(此过程96孔板一直置于磁力架上)，用低尘纸吸去残液，再加入200μl 1
×
洗液，磁分离2-3分钟，倒掉洗液，用低尘纸吸去残液，并从磁力架上取下96孔板。
[0070]
加入120μl终止检测液，在振荡器上700rpm振荡。于多功能流式点阵仪luminex system 200上读取结果，上机操作请详阅仪器说明书。
[0071]
(4)实验结果：两种荧光检测系统检测阿尔兹海默症低值样本的结果见表2。
[0072]
表2.两种荧光检测系统检测阿尔兹海默症低值样本三次检测结果的均值对比(单位：pg/ml)
[0073][0074][0075]
(5)实验结论：sa-pamam-poly(pe)荧光检测系统检测阿尔兹海默症低值样本，相比sa-pe荧光检测系统检测，灵敏度更高，低值稳定性更好(cv值更低)，能够检测出各项指标既定的参考范围和低于最低检测线的样本浓度。
[0076]
实验2
[0077]
(1)实验目的：测试实施例2中所述的不同代别的sa-pamam-sh树状大分子与pe荧光染料结合的最适代别的sa-pamam-poly(pe)树状大分子荧光染料。
[0078]
(2)实验设计：用实施例2中所述的不同代别g0.5-g5.0的荧光物质，设置为实验组1-10检测神经标志物抗原，对比检测浓度值。
[0079]
(3)实验过程：用纯化水复溶抗原cal1，室温静置10分钟，混合均匀后备用。用神经标志物抗原稀释液梯度稀释神经标志物抗原。
[0080]
取96孔板，分别向每孔中加入25μl反应缓冲液(tmab)和标记检测抗体(detection)，分别向每孔中加入25μl旋涡充分混匀的偶联微珠悬液，分别向每孔中加入25μl样本，充分混匀。37℃恒温震荡反应1.5小时(振荡速度：700rpm)。
[0081]
直接加入150μl 1
×
洗液，磁分离2-3分钟，倒掉液体(此过程96孔板一直置于磁力架上，倒扣于低尘吸水纸上，吸去残液)，再加入200μl 1
×
洗液，磁分离2-3分钟，倒掉洗液，用低尘吸水纸吸去残液，并从磁力架上取下96孔板。
[0082]
向实验组1-10每孔中加入50μl sa-pamam-poly(pe)树状大分子荧光染料；贴封口膜，混匀贴封口膜，混匀。37℃恒温震荡反应0.5小时，(振荡速度：700rpm)
[0083]
直接加入150μl 1
×
洗液,磁分离2-3分钟，倒掉液体(此过程96孔板一直置于磁力架上)，用低尘纸吸去残液，再加入200μl 1
×
洗液，磁分离2-3分钟，倒掉洗液，用低尘纸吸去残液，并从磁力架上取下96孔板。
[0084]
加入120μl终止检测液，在振荡器上700rpm振荡。于多功能流式点阵仪luminex system 200上读取结果，上机操作请详阅仪器说明书。
[0085]
(4)实验结果：不同代别g0.5-g5.0的荧光物质检测神经标志物抗原的结果见表3。
[0086]
(5)实验结论：参照图4，g3.0-4.0代的荧光物质检测神经标志物抗原效果最佳。
[0087]
表3.不同代别的荧光物质检测神经标志物抗原的结果(浓度pg/ml，信号值：mfi)
[0088][0089]
实验3
[0090]
(1)实验目的：测试实施例3中所述的不同比例的pe荧光染料结合sa-pamam-sh树状大分子荧光染料的效果。
[0091]
(2)实验设计：用实施例3中所述的不同比例的pe荧光染料结合sa-pamam-sh树状大分子荧光染料，设置为实验组1-10检测神经标志物抗原，对比检测浓度值。
[0092]
(3)实验过程：用纯化水复溶冻干抗原，室温静置10分钟，混合均匀后备用。用神经标志物校准品稀释液梯度稀释神经标志物抗原。
[0093]
取96孔板，分别向每孔中加入25μl反应缓冲液(tmab)和标记检测抗体(detection)，分别向每孔中加入25μl旋涡充分混匀的偶联微珠悬液，分别向每孔中加入25μl样本，充分混匀。37℃恒温震荡反应1.5小时(振荡速度：700rpm)。
[0094]
直接加入150μl 1
×
洗液，磁分离2-3分钟，倒掉液体(此过程96孔板一直置于磁力架上，倒扣于低尘吸水纸上，吸去残液)，再加入200μl 1
×
洗液，磁分离2-3分钟，倒掉洗液，用低尘吸水纸吸去残液，并从磁力架上取下96孔板。
[0095]
向实验组1-10每孔中加入50μl不同浓度pe结合的sa-pamam-poly(pe)树状大分子荧光染料；贴封口膜，混匀贴封口膜，混匀。37℃恒温震荡反应0.5小时，(振荡速度：700rpm)
[0096]
直接加入150μl 1
×
洗液,磁分离2-3分钟，倒掉液体(此过程96孔板一直置于磁力架上)，用低尘纸吸去残液，再加入200μl 1
×
洗液，磁分离2-3分钟，倒掉洗液，用低尘纸吸
去残液，并从磁力架上取下96孔板。
[0097]
加入120μl终止检测液，在振荡器上700rpm振荡。于多功能流式点阵仪luminex system 200上读取结果，上机操作请详阅仪器说明书。
[0098]
(4)实验结果：不同浓度pe结合的sa-pamam-poly(pe)树状大分子荧光染料检测神经标志物抗原的结果见表4。
[0099]
表4.不同比例的pe结合荧光物质检测神经标志物抗原的结果(浓度pg/ml，信号值：mfi)
[0100][0101][0102]
(5)实验结论：参照图5，实施例3中所述的pe与sa-pamam-sh的添加比例结合效果最佳。

技术特征：
1.一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其特征包括以下步骤：(1)sa-pamam树状大分子的制备：将表面活性基团为羧基修饰的g1.0代的pamam树状大分子与sa进行偶联，将pamam用n-羟基琥珀酰亚胺nhs液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc液在酸性环境中活化，加入sa溶液中，混合孵育，得到sa-pamam树状大分子；(2)sa-pamam-sh树状大分子的制备：以步骤(1)获得的sa-pamam树状大分子为中心，和表面活性基团为巯基修饰的pamam-peg-sh树状大分子混合后，加入乙二胺的甲醇溶液进行酞胺化反应，生成0.5代的sa-pamam-sh树状大分子产物；之后加入丙烯酸甲酯的甲醇溶液进行加成反应，生成1.0代的sa-pamam-sh树状大分子产物；交替重复进行上述两个反应步骤，得到代数依次增加的sa-pamam-sh树状大分子产物；(3)sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子的制备：用n-马来酰亚胺在酸性环境中活化步骤(2)获得的sa-pamam-sh树状大分子，偶联藻红蛋白即可得到sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子染料。2.根据权利要求1所述的一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其特征在于：所述pamam树状大分子的分子量为2230。3.根据权利要求1所述的一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其特征在于：所述pamam-peg-sh树状大分子的分子量为2000。4.根据权利要求1所述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其特征在于：所述sa-pamam树状大分子的制备包括：取1ml浓度为1mmol/l的pamam溶液，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复3次；加入900μl mes缓冲液，称取nhs和edc分别纯水配制成50mg/ml的nhs和10mg/ml的edc的溶液；在pamam溶液中分别加入10μl的nhs和edc溶液，充分混匀后，室温避光振荡孵育20min，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次；加入900μl 1
×
pbs缓冲液重悬，并加入100μl的sa溶液，颠倒混匀后，室温避光振荡孵育2h，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，加入1ml甲醇溶液重悬后避光静置。5.根据权利要求1所述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其特征在于：所述sa-pamam-sh树状大分子的制备包括：取1ml pamam-peg-sh溶液，与所述步骤(1)中的sa-pamam溶液混合，按照sa-pamam树状大分子与乙二胺的甲醇溶液1:8的比例加入16ml乙二胺的甲醇溶液，塞上塞子磁力搅拌混匀，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g0.5代sa-pamam-sh产物；取1ml g0.5代sa-pamam-sh树状大分子，按照sa-pamam-sh树状大分子与丙烯酸甲酯的甲醇溶液1:8的比例加入8ml丙烯酸甲酯的甲醇溶液，塞上塞子磁力搅拌混匀，水浴孵育2h，将反应产物进行离心洗涤，自然吹干，得到g1.0代sa-pamam-sh树状大分子；交替重复进行上述反应步骤，得到g2.0代sa-pamam-sh树状大分子。6.根据权利要求1所述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其特征在于：所述sa-pamam-poly(pe)荧光树状大分子的制备包括：
用pe荧光染料标记g2.0代sa-pamam-sh树状大分子，取1ml的sa-pamam-sh树状大分子溶液，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复3次；加入900μl mes缓冲液：称取一定量的n-马来酰亚胺，加入mes缓冲液配制成10mg/ml的n-马来酰亚胺溶液，在sa-pamam-sh溶液中加入50μl的n-马来酰亚胺溶液，混匀后室温避光振荡孵育20min，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，重复2次；加入900ml的mes缓冲液重悬后，加入100μl的pe荧光染料，室温避光振荡孵育30min，12000rpm离心20min，吸去上清，再加入1ml 1
×
pbs缓冲液重悬后，12000rpm离心20min，吸去上清，加入1ml 1
×
pbs重悬后避光静置。7.根据权利要求4或6所述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其特征在于：所述1
×
pbs缓冲液为10mmol/l磷酸缓冲液，ph值为7.4；所述mes缓冲液为0.05mol/l的mes缓冲液，ph值为6.8。8.根据权利要求5所述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其特征在于：所述的丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，丙烯酸甲酯和甲醇溶液的混合比例为1:1。9.根据权利要求5所述一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法，其特征在于：所述乙二胺的甲醇溶液中，乙二胺和甲醇溶液的混合比例为1:1。10.根据权利要求1-6任意一项所述的一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的应用，其特征在于：所述的荧光树状大分子用于检测神经标志物，包括阿尔兹海默症，肿瘤标志物，fpsa低丰度生物标志物。

技术总结
本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及一种用于免疫检测低丰度生物标志物信号级联放大的荧光树状大分子的制备方法及其应用，包括利用PAMAM的羧基基团与链霉亲和素(SA)偶联，制成SA-PAMAM复合物，再与表面活性基团为巯基修饰的PAMAM-PEG-SH发生酞胺化反应，生成SA-PAMAM-SH树状大分子。利用SA-PAMAM-SH的巯基基团偶联多个藻红蛋白(PE)。本发明以级联放大的方式放大被测物上结合的生物素标记的捕获分子的信号值，利用亲和素-生物素系统的高度稳定性，以及PE标记的SA-PAMAM可以广谱地应用在亲和素-生物素系统，显著提高了检测的敏感度，特别是满足了血液磷酸化Tau蛋白p-Tau-181、p-Tau-217、p-Tau-231和神经丝轻链蛋白(NFL)等低丰度阿尔兹海默症(AD)标志物有效检测的需求，使AD早期诊断成为可能。使AD早期诊断成为可能。


技术研发人员：陶文静 秦杨 黄晨
受保护的技术使用者：南昌谱迪生物科技有限公司 江苏谱迪生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/13