判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法与流程

1.本发明属于检测技术领域，具体涉及一种判别烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法。


背景技术：

2.研究表明烟碱可以保护神经，改善人体中枢神经系统退变疾病症状，对部分炎症也有一定疗效。如：烟碱对阿尔茨海默病(alzheimer disease，ad)、帕金森综合症(parkinson disease，pd)、妥瑞氏综合症(tourette syndrome)、精神分裂症、癫病、溃疡型结肠炎都具有积极影响。另外，烟碱还可改善记忆、提高学习力和注意力。
3.油水分配系数是指当化合物在油相和水相溶解并达到平衡时，其在油相的浓度和在水相的浓度之比p，通常以常用对数lgp表示。通过体外试验求得的某化合物油水分配系数则称为该化合物的表观油水分配系数lgp
app
。
4.药物在生物体内的溶解、吸收、分布、转运与药物的油水分配系数有关。由于药物吸收需要其具备适宜的脂溶性和水溶性；适当的脂溶性，有利于药物的扩散并透过生物膜；而水溶性有利于药物在体液内转运，达到作用部位与受体结合，从而产生药物效应；因而，药物需要具有适当的油水分配系数，以便能透过生物膜脂质双分子层。研究表明，过低的油水分配系数(lgp《-2)，药物不能穿过脂质膜；相反，过高的油水分配系数(lgp》3)，药物因为脂溶性强而很难从细胞另一侧的膜释放出来，进入附近的血管或淋巴管，所以吸收更加困难。药物的最佳油水分配系数为-1《lgp《2。
5.体外测定药物油水分配系数，是为了模拟生物体内药物在水相和生物相之间的分配情况。许多有机溶剂曾被用来模拟生物相，如氯仿、橄榄油和正辛醇等。鉴于正辛醇的结构和理化性质更近似生物相，目前多以正辛醇作为有机相(油相)以模拟生物相。
6.目前，药物表观油水分配系数的测定研究大多停留在对所研究药物的饱和溶液进行油水分配试验层面，一般不涉及药物浓度对药物表观油水分配系数的影响研究。
7.众所周知，油水分配系数的原理为：在恒温、恒压和一定的ph条件下，当溶质在任何一相中的浓度不超过0.01mo l/l时，其在两种纯溶剂中的分配遵循能斯特(nernst)定律。即在一定温度和压力下，如果一种物质溶解在两个同时存在的互不混溶的液体中，达到平衡后，若溶质在两液体中分子形态相同，则该物质在两相中的浓度比等于常数。
8.如果将能斯特(nernst)定律中“若溶质在两液体中分子形态相同”这个限制条件换种说法，可表述为能斯特(nernst)定律不适用于溶质在溶剂中发生缔合、离解或发生反应的情况。
9.对烟碱而言，一方面因其与水互溶，无法获取饱和溶液；另一方面，因烟碱结构中四氢化吡咯环所含氮原子上的孤对电子容易和水分子形成氢键或者发生缔合。因此，烟碱油水分配可能不遵循能斯特(nernst)定律，那么探究烟碱表观油水分配系数是否会受烟碱初始浓度的影响就成为了解烟碱吸收和生物利用度的关键所在，也成为烟草行业亟待解决的问题。
10.目前为止，在国内外未见关于采用方差分析判别比较烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数影响是否显著的公开报道。


技术实现要素：

11.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，以烟碱初始浓度为试验因子，烟碱表观油水分配系数为试验指标，采用对照试验设计及摇瓶法进行烟碱分配试验。超高效液相色谱(uplc)法测定得到的烟碱表观油水分配系数，采用单因素方差分析，建立了“判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法”，从而保证判别、推断的可靠性及科学性；为传统烟草制品及新型烟草制品的研究及开发提供数据支撑和理论指导。
12.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
13.判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法，包括如下步骤：
14.步骤
①
，试验指标选择：选择烟碱表观油水分配系数作为试验指标；
15.步骤
②
，试验因子及其水平确定：试验因子为烟碱初始浓度，其水平分别为低浓度和高浓度，两水平；
16.步骤
③
，试验方案编制：在步骤
②
选择的试验因子及水平的基础上，选用对照试验设计编制试验方案，每个水平重复11次试验；
17.步骤
④
，样品制备：以正辛醇为油相，碱性磷酸盐缓冲溶液为水相，按步骤
③
编制的试验方案采用摇瓶法进行油水分配试验，以制备各试验对应的油相样品和水相样品；
18.步骤
⑤
，试验数据收集：采用超高效液相色谱(uplc)法就步骤
④
各分配试验制备的油相和水相样品中烟碱含量进行检测和计算，结果通过求比值、求常用对数得到各试验对应的步骤
①
所选择试验指标数据，即各试验对应的烟碱表观油水分配系数；
19.步骤
⑥
，对试验数据进行正态分布检验：对步骤
⑤
收集到的试验数据进行正态分布检验；
20.步骤
⑦
，对试验数据进行方差齐性检验：对步骤
⑤
收集到的试验数据进行方差齐性检验；
21.步骤
⑧
，对试验数据进行单因素方差分析：对步骤
⑤
收集到的试验数据进行单因素方差分析；
22.步骤
⑨
，根据检验结果判别烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数的影响是否显著。
23.进一步，优选的是，所述的用作水相的碱性磷酸盐缓冲溶液ph值为7.40。
24.进一步，优选的是，所述的油水分配试验之正辛醇与缓冲溶液的体积比为2.2ml/2.2ml。
25.进一步，优选的是，所述的油水分配试验之平衡温度为(37
±
1)℃。
26.进一步，优选的是，所述的油水分配试验之平衡时间为30mi n。
27.本发明与现有技术相比，其有益效果为：
28.a.根据单因素方差分析结果判别烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的差异是否显著，能够保证判别、推断的可靠性及科学性。
29.b.为判别烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数的影响是否显著提供了一种科学可行的系统方法。
30.c.为传统烟草制品及新型烟草制品主体骨架烟碱剂量设计、工艺设计及质量控制提供数据支撑和理论指导，经济效益显著。
具体实施方式
31.以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
32.实施例
33.为探索了解烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数的影响程度，选用ph7.40的磷酸盐缓冲溶液为水相，正辛醇为油相，烟碱初始浓度为试验因子，其水平分别为低浓度14.92mg/ml和高浓度90.51mg/ml，两水平，并采用摇瓶法平行进行多次分配试验，然后采用超高效液相色谱(uplc)法就各试验对应的油相和水相样品中烟碱含量进行检测和计算，结果通过求比值、求常用对数得到各试验对应的烟碱表观油水分配系数；试验数据采用单因素方差分析，建立了“判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法”。
34.超高效液相色谱(uplc)条件：
35.进样量：10μl；流速：0.4ml/mi n；柱温：30℃；进样器温度：20℃；检测波长：259nm；流动相a：10mmo l/l的甲酸铵水溶液；流动相b：甲醇；梯度洗脱条件：0～2.0mi n，流动相a的占比为90％vo l；2.0～4.0mi n，流动相a的占比为90％vo l～60％vo l；4.0～6.0mi n，流动相a的占比为60％vo l～10％vo l；6.0～8.0mi n，流动相a的占比为10％vo l～90％vo l。
36.烟碱储备液的配制：
37.准确称取烟碱标准品100mg于100ml棕色容量瓶中，用去离子水稀释定容至刻度，摇匀，得到浓度为1mg/ml的烟碱储备液。溶液于0℃～4℃条件下避光保存。
38.烟碱标准工作溶液的配制：
39.分别移取0.020ml、0.550ml、1.100ml、1.650ml、2.200ml浓度为1mg/ml烟碱储备液(详见3.1)于5个不同的10ml棕色容量瓶中，依次加入去离子水稀释定容至刻度，摇匀，得到5个不同浓度的烟碱标准工作溶液：2.0mg/l、55.0mg/l、110.0mg/l、165.0mg/l、220.0mg/l。各溶液于0℃～4℃条件下避光保存。
40.初始浓度为14.92mg/ml的烟碱溶液的配制：
41.准确称取0.1492g烟碱，置于10ml棕色容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀，得到浓度为14.92mg/ml的烟碱溶液，以供油水分配使用。于0℃～4℃条件下避光保存，有效期3个月。
42.初始浓度为90.51mg/ml的烟碱溶液的配制：
43.准确称取0.9051g烟碱，置于10ml棕色容量瓶中，用去离子水定容至刻度，摇匀，得到浓度为90.51mg/ml的烟碱溶液，以供油水分配使用。于0℃～4℃条件下避光保存，有效期3个月。
44.碱性缓冲溶液的配制：
45.取磷酸二氢钾3.400g，加0.1mo l/l氢氧化钠溶液197.5ml，加水定容至500ml，摇
匀，用0.1mo l/l氢氧化钠水溶液或磷酸调节ph至7.40。
46.试验指标选择：
47.选择烟碱表观油水分配系数作为试验指标。
48.试验因子及其水平确定：
49.试验因子为烟碱初始浓度，其水平分别为低浓度和高浓度，两水平。
50.试验因子及其水平确定：
51.试验因子为烟碱初始浓度，其水平分别为低浓度14.92mg/ml和高浓度90.51mg/ml，两水平。
52.试验方案编制：
53.在选择的试验因子及水平的基础上，选用对照试验设计编制试验方案(表1)，其中正辛醇与缓冲溶液的体积比为2.2ml/2.2ml；平衡温度为(37
±
1)℃；平衡时间为30mi n；每个水平重复11次试验，同时每个水平制备1个空白样品，空白样品与试验样品的区别是空白样品中不加烟碱。
54.表1对照试验方案a[0055][0056]
注：a.每个水平重复11次试验。
[0057]
样品制备：
[0058]
以正辛醇为油相，碱性磷酸盐缓冲溶液为水相，按编制的试验方案(表1)采用摇瓶法进行油水分配试验(每个水平重复11次试验)，以制备各试验对应的油相样品和水相样品。
[0059]
样品制备程序包括：正辛醇和缓冲溶液预饱和处理、烟碱油水分配试验、油相样品和水相样品的分离制备。
[0060]
正辛醇和缓冲溶液预饱和处理：
[0061]
试验前，正辛醇和缓冲溶液需预饱和处理。于1个250ml储液瓶中加入ph为7.40的磷酸盐缓冲溶液及正辛醇各30ml，并置于可控温的振荡器中于平衡温度(37
±
1)℃下振荡24h。之后，静置，分液，分别得到平衡温度下缓冲溶液饱和的正辛醇(油相溶剂)及正辛醇饱和的缓冲溶液(水相溶剂)，备用。
[0062]
烟碱油水分配试验：
[0063]
取22支5ml连盖离心管，按11支1组，分成2组。按照试验方案(表1)，分别将已平衡至(37
±
1)℃的缓冲溶液饱和的正辛醇(油相溶剂)及正辛醇饱和的缓冲溶液(水相溶剂)按2.2ml/2.2ml进行等体积配比，往其中一组离心管分别加入6μl浓度为14.92mg/ml的烟碱溶液，另一组离心管分别加入6μl浓度为90.51mg/ml的烟碱溶液。置于(37
±
1)℃的恒温振荡器中振荡30mi n。同时每组制备1个空白样品，空白样品与试验样品的区别是空白样品中不加烟碱。
[0064]
油相样品和水相样品的分离制备：
[0065]
上述烟碱油水分配试验结束后，静置，并采用注射器分别吸取1ml左右的上层油相和下层水相于2ml连盖离心管中离心，得到供检测的油相样品和水相样品。在吸取下层水相时，为尽可能避免水相样品中含有痕量的正辛醇，取样时先让注射器充满空气，当通过正辛醇层时，轻轻地排出空气，待针头部分探入水相时，抽取1ml左右的水溶液，然后快速抽出注射器并拆去针头，再将注射器中的水相转移至2ml连盖离心管中离心，得到供检测的水相样品。
[0066]
试验数据收集：
[0067]
按编制的试验方案(表1)，采用超高效液相色谱(uplc)法就各分配试验制备的油相样品和水相样品中烟碱含量进行测定。结果通过求比值、求常用对数得到各试验对应的试验指标数据，即各试验对应的烟碱表观油水分配系数。
[0068]
标准工作曲线的制作、检出限及定量限：
[0069]
取烟碱标准工作溶液在超高效液相色谱(uplc)条件下进样分析，得到烟碱峰面积，用烟碱浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归以绘制烟碱标准工作曲线，其相关系数的平方r2＝0.9962。根据信噪比为3(s/n＝3)所对应烟碱浓度确定方法的检出限(lod)；根据信噪比为10(s/n＝10)所对应的烟碱浓度确定方法的定量限(loq)。烟碱的线性回归方程、相关系数的平方(r2)、线性范围、检出限和定量限见表2。
[0070]
表2超高效液相色谱法测定烟碱的线性回归方程、检出限及定量限
[0071][0072]
试验样品中烟碱含量的测定：
[0073]
采用超高效液相色谱(uplc)法，对各试验对应的油相样品和水相样品中烟碱含量进行测定。
[0074]
采用式1计算所述待测样品中烟碱含量：
[0075]c样品
＝(c-c0)x∫
……………
式1
[0076]
式1中，
[0077]c样品
表示待测样品中烟碱含量(浓度)，单位为mg/l；
[0078]
c表示由标准工作曲线得出的待测样品中烟碱含量(浓度)，单位为mg/l；
[0079]
c0表示由标准工作曲线得出的空白样品中烟碱含量(浓度)，单位为mg/l；
[0080]
∫表示稀释因子；若待测试样中烟碱浓度未超出烟碱标准工作溶液最大浓度，则稀释因子取1；若待测试样中烟碱浓度超出烟碱标准工作溶液最大浓度，则应将待测试样用对应油相溶剂或水相溶剂稀释后再测定，若稀释至2倍，则∫取2，以此类推；本实施例无稀释，∫取1。
[0081]
以两次平行测量结果的算术平均值为最终测定结果，精确至0.01mg/l。两次平行测量结果的相对平均偏差应小于10％。
[0082]
将所测油相样品中烟碱浓度记为c
油
，水相样品中烟碱浓度记为c
水
。
[0083]
烟碱表观油水分配系数(lgp
app
)的计算:
[0084]
各试验对应的检测结果通过求比值、求常用对数(见式2)得到各试验对应的烟碱表观油水分配系数(lgp
app
)。各水平11次油水分配试验对应的油相烟碱浓度测定值、水相烟碱浓度测定值、p
app
、lgp
app
及其相对标准偏差(rsd,％)见表3。将烟碱初始浓度为14.92mg/ml(水平1)对应的11次油水分配试验之lgp
app
数据作为样本1；将烟碱初始浓度为90.51mg/ml(水平2)对应的11次油水分配试验之lgp
app
数据作为样本2；各样本均值见表3。
[0085]
lgp
app
＝lg(c
油
/c
水
)
……………
式2
[0086]
式2中，lgp
app
为烟碱表观油水分配系数的常用对数，c
油
为分配平衡后各油相样品中烟碱浓度mg/l；c
水
为分配平衡后各水相样品中烟碱浓度mg/l。
[0087]
表3超高效液相色谱(uplc)法测定试验指标结果
[0088]
[0089][0090]
因表3中烟碱初始浓度为14.92mg/ml所对应lgp
app
均值为0.15，烟碱初始浓度为90.51mg/ml所对应lgp
app
均值为0.30，直观分析表明：烟碱初始浓度越高，烟碱表观油水分配系数lgp
app
越大。
[0091]
对试验数据进行正态分布检验:
[0092]
为了将烟碱初始浓度变化引起的试验结果间的差异与误差引起的试验结果间的差异区分开来，需对收集到的样本1和样本2对应lgp
app
数据(表3)进行单因素方差分析。方差分析之前要进行正态分布检验，检验结果见表4。
[0093]
表4正态性检验结果
[0094][0095]
注：b.采用lilliefors检验(kolmogorov-smirnov检验修正版)进行显著性检验；
[0096]
c.*，真实显著性下限。
[0097]
表4中，由于显著性概率sig.大于0.05(sig.》5％)，故试验指标数据呈正态分布。
[0098]
对试验数据进行方差齐性检验:
[0099]
为了将烟碱初始浓度变化引起的试验结果间的差异与误差引起的试验结果间的差异区分开来，需对收集到的样本1和样本2对应lgp
app
数据(表3)进行单因素方差分析。方差分析之前要进行方差齐性检验。方差齐性检验结果见表5。
[0100]
表5方差齐性检验结果表
[0101][0102]
注：d.在方差齐性检验结果中，若sig.≥0.05，判别方差齐；若sig.《0.05，判别方差不齐。
[0103]
表5中，由于显著性概率sig.大于0.05(si g.》5％)，故样本1和样本2方差齐(方差一致)。
[0104]
对试验数据进行单因素方差分析:
[0105]
因样本1数据和样本2数据服从正态分布且方差一致(即方差齐)，所以能够通过单因素方差分析，判别比较不同烟碱初始浓度下测得的烟碱表观油水分配系数之间是否有显著差异。单因素方差分析结果见表6。
[0106]
表6单因素方差分析结果
[0107][0108]
表6中，显著性概率sig.小于0.05(si g.《5％)，能够判定：烟碱初始浓度为高、低不同水平下测得的烟碱表观油水分配系数之间有显著差异。
[0109]
根据检验结果判别烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数的影响是否显著:
[0110]
根据上述正态分布检验、方差齐性检验、单因素方差分析结果及lgp
app
两个样本均值比较结果(表3)，能够判定：烟碱初始浓度为高、低不同水平下测得的烟碱表观油水分配系数之间有显著差异，且烟碱初始浓度越高，烟碱表观油水分配系数lgp
app
越大。
[0111]
结果应用
[0112]
因药物的油水分配系数被定义为药物在正辛醇和水之间的分配系数的对数，通常被用作表征药物亲脂性的参数。药物的亲脂性是药物的一种重要理化性质，它与药物在生物体内的药代动力学过程(包括吸收、分布、代谢、排泄和毒理学，甚至和血脑屏障渗透性及药物的清除等)都有重要的关系。所以药物在生物体内的溶解、吸收、分布、转运与药物的油水分配系数有关。研究表明，适合人体吸收的药物表观油水分配系数lgp
app
在-1～2范围内较为理想。本发明研究表明：烟碱初始浓度为高、低不同水平下测得的烟碱表观油水分配系数之间有显著差异，且烟碱初始浓度越高，烟碱表观油水分配系数lgp
app
越大。
[0113]
在对传统烟草制品(如：中式卷烟、混合型卷烟、雪茄烟等)进行研究及开发时，尤其在对新型烟草制品(如：电子烟、电加热不燃烧卷烟、袋装口含型无烟气烟草制品、烟碱含片、烟碱硬质糖、烟碱口胶剂、烟碱吸入剂、烟碱喷鼻剂、烟碱贴剂等)进行主体骨架烟碱剂量设计、工艺设计及质量控制时，烟碱初始浓度越高，烟碱表观油水分配系数lgp
app
越大，越有利于改善烟碱吸收和提高其生物利用度。
[0114]
以上内容，显示并描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的内容只用于说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤
①
，试验指标选择：选择烟碱表观油水分配系数作为试验指标；步骤
②
，试验因子及其水平确定：试验因子为烟碱初始浓度，其水平分别为低浓度和高浓度，两水平；步骤
③
，试验方案编制：在步骤
②
选择的试验因子及水平的基础上，选用对照试验设计编制试验方案，每个水平重复11次试验；步骤
④
，样品制备：以正辛醇为油相，碱性磷酸盐缓冲溶液为水相，按步骤
③
编制的试验方案采用摇瓶法进行油水分配试验，以制备各试验对应的油相样品和水相样品；步骤
⑤
，试验数据收集：采用超高效液相色谱法就步骤
④
各分配试验制备的油相和水相样品中烟碱含量进行检测和计算，结果通过求比值、求常用对数得到各试验对应的步骤
①
所选择试验指标数据，即各试验对应的烟碱表观油水分配系数；步骤
⑥
，对试验数据进行正态分布检验：对步骤
⑤
收集到的试验数据进行正态分布检验；步骤
⑦
，对试验数据进行方差齐性检验：对步骤
⑤
收集到的试验数据进行方差齐性检验；步骤
⑧
，对试验数据进行单因素方差分析：对步骤
⑤
收集到的试验数据进行单因素方差分析；步骤
⑨
，根据检验结果判别烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数的影响是否显著。2.根据权利要求1所述的判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法，其特征在于，所述的烟碱初始浓度两水平所对应的低浓度为14.92mg/ml，高浓度为90.51mg/ml。3.根据权利要求1所述的判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法，其特征在于，所述的用作水相的碱性磷酸盐缓冲溶液ph值为7.40。4.根据权利要求1所述的判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法，其特征在于，所述的油水分配试验之正辛醇与缓冲溶液的体积比为2.2ml/2.2ml。5.根据权利要求1所述的判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法，其特征在于，所述的油水分配试验之平衡温度为37
±
1℃。6.根据权利要求1所述的判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法，其特征在于，所述的油水分配试验之平衡时间为30min。

技术总结
本发明涉及判别烟碱浓度对烟碱表观油水分配系数影响程度的方法。以正辛醇为油相，碱性磷酸盐缓冲溶液为水相；以烟碱初始浓度为试验因子，烟碱表观油水分配系数为试验指标，采用对照试验设计及摇瓶法进行烟碱分配试验。超高效液相色谱法测定得到的烟碱表观油水分配系数，采用单因素方差分析，以判别比较烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数的影响程度。结果表明，烟碱初始浓度对烟碱表观油水分配系数有显著影响。本方法在应用过程中具备以下优点：能够保证判别、推断的可靠性及科学性；为传统烟草制品及新型烟草制品主体骨架烟碱剂量设计、工艺设计及质量控制提供数据支撑和理论指导。指导。


技术研发人员：魏玉玲 李超 范多青 王璐 冯欣 陈建华 张承明 叶灵 刘巍 秦云华 郭丽娟 王晋 张静 杨艳萍 毕玉波 刘欣 曾婉俐 高文军
受保护的技术使用者：云南中烟工业有限责任公司
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/8/13