一种人工自噬靶向嵌合体及其制备方法和应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种人工自噬靶向嵌合体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.机体对蛋白合成和降解的精准调控是维持细胞和生物体正常生命活动的关键。当机体发生蛋白的过度表达或激活时，各种疾病随之而来。目前已知有三千多种蛋白质与疾病有关，包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和心血管疾病等。有选择性地抑制或降解致病蛋白，将有助于实现疾病治疗。抑制致病蛋白的蛋白活性调节剂是传统药物开发的主流，主要包括小分子抑制剂和抗体药物。它们的作用机制是通过与靶蛋白的活性位点特异性结合，阻止底物进入催化/活性位点，从而起到抑制蛋白活性的作用。作为医药领域的重要组成部分，它们已经被成功运用于肿瘤、自身免疫性疾病以及感染性疾病等的治疗。但是，小分子药物和抗体药物的开发仍面临着不少瓶颈。一方面，小分子抑制剂和抗体与靶蛋白之间这种基于“占位驱动”的药理学范式通常需要在较高浓度下才能有效发挥作用，进一步增加了药物靶点突变的风险，最终导致耐药性的产生。另一方面，大部分致病蛋白(80％～85％)缺乏明确的结合口袋，使得小分子或抗体药物难以结合到靶蛋白上发挥作用。因此，亟需新技术来解决小分子或抗体药物面临的挑战。
3.近年来，利用细胞内天然存在的蛋白降解系统(泛素化-蛋白酶体系统和溶酶体降解途径)消耗或减少致病蛋白的靶向蛋白降解技术(ppd)迅速发展起来。它能够将e3连接酶募集到靶蛋白附近并泛素化标记靶蛋白，直接在蛋白质水平特异、高效降解疾病相关蛋白，从而达到疾病治疗的效果。不同于小分子和抗体药物的占位驱动模式，事件驱动模式的蛋白水解靶向嵌合体(protac)不需要与靶蛋白长时间结合就可以发挥作用，活性和选择性更高，可以实现在更低剂量下发挥作用。其中，自噬靶向嵌合体(autac)技术是基于机体清除a群链霉菌(gas)的自噬机制设计的一种protac，它主要由3部分组成，分别是靶向蛋白的配体、连接子和降解标签鸟嘌呤衍生物(gd)。该技术的原理是通过降解标签模拟s-鸟苷酸化修饰，诱导靶蛋白(poi)的k63多聚泛素化标记，进而招募自噬体通过溶酶体途径降解。基于以上背景，将降解标签鸟嘌呤衍生物与靶蛋白结合部分连接，就能实现对特定蛋白的降解，避免了由于点位突变产生的耐药性。虽大有进步，但autac技术仍存在不少问题。autac过大的分子量使得它面临着生物利用度低、药代动力学差以及脱靶效应等问题，进而导致降解效率有限。
4.纳米药物递送系统的开发为克服此类药物制剂所面临的困境提供了新思路。脂质体、聚合物纳米粒和无机纳米粒等载体递药系统不仅可以增强治疗药物的生物稳定性和生物利用度，还可以显著降低药物对身体的毒性。尽管载体递药系统具有诸多优势，但是依然存在载药量低，稳定性差和药物在非瘤部位的突释等问题。同时，纳米载体占比过高且解聚后在体内的代谢、降解和排泄机制不明确，在治疗的过程可能对人体的多个系统也存在短期和长期毒性。另外，载体合成工艺复杂，批次间差异大等，都极大的限制了载体递药系统
的临床转化。
5.鉴于以上所述现有技术的缺点，制备方法简单、载药量高且生物活性良好的无载体纳米递送系统应运而生。无载体纳米递送系统是指前药、纯药物(例如单药或多药)或两亲性药物-药物偶联物等通过药物本身的疏水相互作用、静电相互作用或氢键等非共价力直接自组装形成。
6.但并未见有将鸟嘌呤类物质与核苷类药物结合制备无载体纳米粒的报道。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种人工自噬靶向嵌合体及其制备方法和应用，本发明基于autac技术，设计并合成了鸟嘌呤衍生物分子，将其与核苷类抗肿瘤药物通过碱基互补配对结合制得无载体纳米粒，实现了对靶蛋白的降解，避免了由于点位突变产生的耐药性。
8.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种人工自噬靶向嵌合体的制备方法，包括以下步骤：
9.分别将鸟嘌呤衍生物和核苷类抗肿瘤药物溶解在有机溶剂中，将两种溶液混匀，超声处理，然后滴加到去离子水中进行自组装，形成无载体纳米粒即人工自噬靶向嵌合体。
10.进一步地，鸟嘌呤衍生物结构式如下：
[0011][0012]
进一步地，鸟嘌呤衍生物通过以下方法制得：
[0013][0014]
(
ⅰ
)将化合物1(6-氯鸟嘌呤)溶于溶剂中，然后加入4-氟苄醇和碱，在室温下反应制得化合物2；
[0015]
(
ⅱ
)化合物2在盐酸回流条件下制得化合物3；
[0016]
(
ⅲ
)化合物3、n-溴代琥珀酰亚胺和冰醋酸，在室温条件下反应制得化合物4；
[0017]
(
ⅳ
)化合物4、n-乙酰-l-半胱氨酸和碱溶于溶剂中，在85-95℃条件下反应制得化合物5；
[0018]
(
ⅴ
)将化合物5、hatu、dipea和nlg8189溶于溶剂中，在室温条件下反应制得化合物6；
[0019]
(
ⅵ
)化合物6溶于溶剂中，然后加入水合氢氧化锂，室温反应制得鸟嘌呤衍生物。
[0020]
进一步地，步骤(
ⅰ
)中化合物1、4-氟苄醇和碱的摩尔比为1:1-2:1-2；室温下反应12-18h。
[0021]
进一步地，步骤(
ⅰ
)中溶剂为dmf，碱为碳酸钾、碳酸钠等。
[0022]
进一步地，步骤(
ⅱ
)中回流2-3h。
[0023]
进一步地，步骤(
ⅲ
)中化合物3和n-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.5-2；在室温下反应20-24h。
[0024]
进一步地，步骤(
ⅳ
)中化合物4、n-乙酰-l-半胱氨酸和碱的摩尔比为1:3-5:12-15；85-95℃条件下反应4-6h。
[0025]
进一步地，步骤(
ⅳ
)中溶剂为n,n-二甲基甲酰胺等，碱为碳酸钾、碳酸钠等。
[0026]
进一步地，步骤(
ⅴ
)中化合物5、hatu、dipea和nlg8189的摩尔比为1:1-2:1.5-2.5:2-4；在室温条件下反应1-3h。
[0027]
进一步地，步骤(
ⅴ
)中溶剂为dmf等。
[0028]
进一步地，核苷类抗肿瘤药物为甲氨蝶呤(mtx)、阿糖胞苷、去氧氟尿苷或地西他滨等。
[0029]
进一步地，鸟嘌呤衍生物分子溶解在有机溶剂中，得到浓度为8-12mg/ml的鸟嘌呤衍生物溶液。
[0030]
进一步地，核苷类抗肿瘤药物溶解在有机溶剂中，得到浓度为8-12mg/ml的核苷类抗肿瘤药物溶液。
[0031]
上述鸟嘌呤衍生物溶液和核苷类抗肿瘤药物溶液混合时按照核苷酸之间的碱基互补配对1:1比例关系来进行混合。
[0032]
进一步地，超声处理之前向体系中加入碱溶液继续混匀后再超声处理。
[0033]
进一步地，碱溶液为naoh溶液，浓度为3-6mg/ml。
[0034]
进一步地，超声处理时间为10-20min。
[0035]
进一步地，还包括：自组装反应后进行透析去除有机溶液。
[0036]
上述制得的人工自噬靶向嵌合体在制备降解致病蛋白药物中的应用。
[0037]
进一步地，上述制得的人工自噬靶向嵌合体在制备治疗和/或预防与免疫检查点蛋白吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)或程序性死亡配体(pd-l1)等有关的疾病药物中的应用。
[0038]
本发明具有以下有益效果：
[0039]
本发明以免疫检查点蛋白ido为例，设计了能特异性降解ido蛋白的autac分子；以核苷类抗肿瘤药物甲氨蝶呤(mtx)为例，利用碱基配对作用与autac分子的鸟嘌呤部分自组装形成无载体纳米粒。本发明设计并合成的autac分子能特异性降解ido蛋白，碱基互补配对作用形成的无载体纳米粒既增加了鸟嘌呤衍生物对生物膜的通透性，又有效降解了肿瘤的ido蛋白，激活效应t细胞和自然杀伤性t细胞的功能，又增加化疗药物mtx在肿瘤部位的浓度，减少其在正常组织中的分布，进而降低毒副作用，最终实现化疗与免疫的联合作用。本发明提供的碱基互补配对作用介导的无载体纳米粒的制备方法具有制备工艺简单、快速和普适性的优势，可克服纳米载体合成工艺复杂以及潜在毒性等挑战。
[0040]
本发明提供的无载体纳米粒由autac分子gn和核苷类抗肿瘤药物mtx组成，gn是一种鸟嘌呤衍生物，通过降解标签模拟s-鸟苷酸化修饰，诱导ido蛋白的k63多聚泛素化标记，进而招募自噬体通过溶酶体途径降解；mtx是一种叶酸类似物，通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍肿瘤细胞的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。
[0041]
autac分子中鸟嘌呤降解标签可以与核苷类药物通过碱基配对相互作用、相互识别并自组装成具有纳米结构的人工自噬靶向嵌合体。这种碱基配对自组装体系不仅具有传统载体递药系统的优势，还消除了载体对机体的潜在毒性，同时克服了现有autac分子降解靶蛋白面临的生物利用度低、脱靶效应等瓶颈问题，极大促进了autac技术降解疾病相关蛋白领域的发展。
[0042]
本发明中鸟嘌呤衍生物和核苷类抗肿瘤药物碱基配对1:1自组装形成的无载体纳米粒具有制备简单、载药量高、稳定性好等优势。该纳米粒既可利用抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞的同时激活机体免疫，又可特异性降解胞内的免疫检查点蛋白增强机体免疫应答能力，实现免疫联合治疗。
附图说明
[0043]
图1为实施例1中gn的核磁数据结果。
[0044]
图2为不同浓度gn降解4t1细胞中ido酶的western blot结果图。
[0045]
图3为不同浓度gn降解4t1细胞中ido酶的流式细胞术结果图。
[0046]
图4为不同浓度gn降解4t1细胞中ido酶的高效液相色谱分析
[0047]
图5为gm纳米粒的粒径结果图。
[0048]
图6为gm纳米粒的透射电镜图。
[0049]
图7为gm纳米粒在pbs和hepes溶液中粒径随时间的变化图。
[0050]
图8为gm纳米粒的自组装机制探究结果图。
[0051]
图9为gm纳米粒的离体荧光成像图。
[0052]
图10为gm纳米粒的离体荧光半定量图。
具体实施方式
[0053]
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0054]
实施例1：gn的合成及表征
[0055]
gn为一种鸟嘌呤衍生物，其结构通式如下：
[0056][0057]
gn具体合成过程如下：
[0058][0059]
(
ⅰ
)将化合物1 6-氯鸟嘌呤(8.5g,50mmol)溶于85ml n,n-二甲基甲酰胺溶液中，再向该混合溶液中加入1-溴甲基-4-氟苯(9.45g,50mmol)和碳酸钾(6.9g,50mmol)，在室温下搅拌15h。反应完全后，在减压条件下将n,n-二甲基甲酰胺溶剂蒸干，再将蒸干后的残余物通过柱层析技术进行纯化得到白色固体产物6-氯-9-(4-氟苄基)-9h-嘌呤-2-胺(化合物2,9.4g,收率68％)；
[0060]
(
ⅱ
)将化合物2(115mg，0.4mmol)与3ml盐酸(3mol/l)混合回流2h。反应完全后，将反应溶液冷却至室温后，加入约9ml的氢氧化钠水溶液(1mol/l)中和至中性，减压过滤收集所析出的白色固体，用少量水洗滤饼后，放入60℃的真空干燥箱中干燥得到白色固体产物化合物3(108mg,收率100％)；
[0061]
(
ⅲ
)将化合物3(108mg，0.4mmol)与4.2ml醋酸混合，加入n-溴代丁二酰亚胺(106.8mg，0.6mmol)，在室温下搅拌22h。反应完全后，向反应液中加入冰水，出现黄色浑浊，减压过滤收集析出的固体，依次用少量的水和甲醇洗涤滤饼，然后将洗涤后的滤饼放入真空干燥箱中干燥得到白色固体产物化合物4(55mg,收率40％)；
[0062]
(
ⅳ
)将化合物4(45mg，0.13mmol)和n-乙酰-l-半胱氨酸(85mg，0.52mmol)、碳酸钾(233mg，1.69mmol)混合，加入3ml n,n-二甲基甲酰胺，在90℃下加热搅拌5h。反应完全后，加10ml水稀释，滴加盐酸(6mol/l)调至ph＝5～6，减压过滤收集析出的固体，依次用少量水和甲醇洗涤滤饼。将洗涤后的滤饼放入真空干燥箱中进行干燥，得到黄色固体产物化合物5(20mg，收率36％)；
[0063]
(
ⅴ
)将化合物5(50mg,0.12mmol)与nlg8189(28mg,0.12mmol)、hatu(68mg,0.18mmol)和dipea(47mg,0.36mmol)溶于4ml dmf中，室温下搅拌2h.反应完全后，加水稀
释，用dcm/meoh(10/1)萃取两次，合并萃取液，浓缩至干，得到的残余物用柱层析纯化得到化合物6(46mg，灰白色固体，收率60％)；
[0064]
(
ⅵ
)将化合物6(40mg,0.063mmol)溶于乙醇水溶液(4ml/1ml)中，然后加入水合水合氢氧化锂，(14mg，0.32mmol)，室温反应1h。反应完全后，用盐酸(1mol/l)溶液调ph＝5～6，然后浓缩至干，残余物用柱层析纯化得到鸟嘌呤衍生物(16mg，灰白色固体，收率40％)。
[0065]
gn的核磁数据如图1所示，说明成功合成了gn。
[0066]
实施例2：gn降解4t1细胞中ido蛋白的能力
[0067]
采用western blot法考察4t1细胞经不同浓度的gn处理后，细胞中ido蛋白表达的情况。以1.5
×
105个/孔的密度将4t1细胞接种于6孔板中，培养36h。接着采用含有ifn-γ(100ng/ml)的rpmi-1640完全培养基培养配置不同浓度的gn溶液(10nm～10μm)，并设置阴性对照组(不含ifn-γ)和阳性对照组(只含ifn-γ不含药物gn)。孵育24h后，收集细胞并提取4t1细胞的总蛋白，进行western blot分析。实验结果如图2所示，gn表现出降低4t1细胞中ido蛋白的表达能力，且具有浓度依赖性。
[0068]
采用流式细胞术考察4t1细胞经不同浓度的gn处理后，细胞中ido蛋白表达的情况。以7
×
104个/孔的密度将4t1细胞接种于12孔板中，培养36h。接着采用含又ifn-γ(100ng/ml)的rpmi-1640完全培养基培养配置不同浓度的gn溶液(10nm～10μm)，并设置阴性对照组(不含ifn-γ)和阳性对照组(只含ifn-γ不含药物gn)，另外，还设置了ido抑制剂nlg8189作为对照组。孵育24h后，收集细胞并用apc荧光分子偶联的ido抗体对细胞进行染色，并采用流式细胞仪分析。实验结果如图3所示，gn表现出降低4t1细胞中ido蛋白的表达，且具有浓度依赖性，而nlg8189降低ido表达的效果不如gn。
[0069]
采用高效液相色谱法考察4t1细胞经不同浓度的gn处理后，细胞中ido蛋白的功能。ido蛋白可以催化色氨酸(t细胞发挥功能的必需氨基酸)转化为犬尿氨酸，一方面消耗色氨酸抑制t细胞发挥功能，另一方面犬尿氨酸的堆积也触发treg细胞的增值，抑制机体的免疫应答。通过高效液相分析细胞培养上清中色氨酸和犬尿氨酸的含量比值可以表征ido蛋白的功能。收集细胞培养上清，过滤后进样进行检测。高效液相色谱法的条件为：乙腈：15mm乙酸钠溶液(0.02％乙酸)＝8:92，柱温为25℃，流速为1ml/min，分别在280nm和360nm检测色氨酸和犬尿氨酸。实验结果如图4所示，gn抑制4t1细胞中ido的功能，且具有浓度依赖性，而nlg8189抑制ido表达的效果不如gn。
[0070]
实施例3：人工自噬靶向嵌合体的制备
[0071]
gn是一种鸟嘌呤衍生物，通过降解标签模拟s-鸟苷酸化修饰，诱导ido蛋白的k63多聚泛素化标记，进而招募自噬体通过溶酶体途径降解；mtx是一种叶酸类似物，也是一种抗肿瘤药物，本发明人工自噬靶向嵌合体是将gn和核苷类抗肿瘤药物mtx以碱基互补配对的方式结合形成即gn和mtx通过核苷酸之间的碱基互补配对1:1结合，具体过程如下：
[0072]
将gn溶解在dmso中，使得gn溶液的浓度为10mg/ml；
[0073]
将mtx溶解在dmso中，使得mtx溶液的浓度为10mg/ml；
[0074]
将240μl的gn溶液和176μl的mtx溶液混合于384μl dmso中，总体积为800μl，漩涡混匀，因弱碱性的条件使得碱基的质子化程度更低，碱基之间的氢键会更容易形成且更加稳定，因此，需要向体系中继续加入4mg/ml的naoh溶液25μl，漩涡混合1min后，超声处理15min，于30℃500rpm搅拌条件下，将该混合溶液缓慢滴加到2ml去离子水中，继续恒温搅拌
1h，gn和mtx自发形成均匀的纳米粒，在去离子水中透析(1kd)去除有机溶剂后，即得到两种药物自组装形成的碱基配对无载体纳米粒即人工自噬靶向嵌合体gm。
[0075]
对上述所得gm进行如下检测：
[0076]
一、gm纳米粒的粒径、电位以及形貌表征
[0077]
通过动态光散射法(dls)测量实施例3制备得到的gm纳米粒粒径和电位，其中分散介质是水。纳米粒的形貌使用场发射透射电子显微镜(tem)进行观察。
[0078]
如图5所示，dt纳米粒的有效粒径为54.12
±
4.04nm，电位为1.38
±
0.56。如图6所述，tem的结果表明gm纳米粒具有均一的球形结构。
[0079]
二、gm纳米粒的载药量和包封率
[0080]
将实施例3制备的gm纳米粒平均分为2份，一份进行透析纯化，一份未经过透析。使用冻干机冻干后用少量dmso进行复溶，利用高效液相色谱定量体系中的gn和mtx。高效液相色谱法的色谱条件为：流动相为0.1％甲酸：乙腈＝1:1，检测波长为254nm，进样量为20μl。
[0081]
根据公式计算gm纳米粒中两种药物的包封率和载药量：
[0082]
gn包封率(％)＝(gn纯化后质量)/(gn纯化前质量)
×
100％
[0083]
mtx包封率(％)＝(mtx纯化后质量)/(mtx纯化前质量)
×
100％
[0084]
gn载药量(％)＝(gn纯化后质量)/(gn纯化后质量+mtx纯化后质量)
×
100％
[0085]
mtx载药量(％)＝(mtx纯化后质量)/(gn纯化后质量+mtx纯化后质量)
×
100％
[0086]
gm纳米粒中两种药物的包封率和载药量结果见表1：
[0087]
表1gm纳米粒中两种药物的包封率和载药量结果
[0088][0089]
如表1所示，gn的包封率为75.25％，mtx的包封率为80.83％；gn的载药量为35.23％，mtx的包封率为64.77％。两种药物累积载药量达到了100％，表明该自组装无载体纳米粒具有高载药量的技术特点。
[0090]
三、gm纳米粒的稳定性试验
[0091]
将实施例3制备的gm纳米粒加入到含不同的介质的溶剂中(pbs，hepes)，在37℃的摇床中孵育48h，并且在预定的时间点(0，0.5，2，4，8，12，24，36，48h)通过动态光散射法测定其粒径变化。
[0092]
结果如图7所示，gm纳米粒在pbs和hepes溶液中的粒径在24h几乎没有显著变化，pdi也无明显波动，较为稳定，表明gm纳米粒具有较好的稳定性。
[0093]
四、gm纳米粒的自组装机制试验
[0094]
为探究gm纳米粒的自组装机制，采用十二烷基硫酸钠(sds)、尿素(urea)和nacl破坏分子间作用力后，通过动态光散射法测定其粒径变化。其中，sds可以破坏分子中亲水疏水作用力，尿素可以竞争性的破坏分子间氢键，nacl可以破坏分子间的静电作用。
[0095]
向实施例3制备的gm纳米粒中加入等体积对应浓度(0mm，20mm，40mm，60mm，80mm，100mm)的sds，尿素和nacl，在37℃的摇床中孵育24h之后测定粒径变化。结果如图8所示，当加入nacl时，纳米粒的粒径变大，并随着nacl浓度的增加粒径显著增加。同样地，urea加入
时，纳米粒的粒径也随着urea浓度的增加而增加。但当sds加入时，gm纳米粒无明显的粒径变化。以上结果均表明静电作用力和氢键作用力驱动了gm纳米粒的自组装。
[0096]
五、gm纳米粒的体内靶向评价
[0097]
取体重约20
±
2g的balb/c小鼠，刮毛后在第三乳腺垫注射4t1细胞，以建立荷乳腺癌的小鼠模型。待其生长到300mm2左右后，尾静脉注射近红光探针cy5标记的gm纳米粒，以游离的cy5为对照组。12h后处死老鼠，取出各脏器、肿瘤组织，活体成像观察离体器官的荧光分布。离体脏器的荧光分布如图9所示，半定量结果如图10所示，纳米粒在肿瘤中的荧光强度均高于游离荧光分子组，以上结果均表明纳米粒具有良好的肿瘤靶向性。
[0098]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种人工自噬靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分别将鸟嘌呤衍生物和核苷类抗肿瘤药物溶解在有机溶剂中，将两种溶液混匀，超声处理，然后滴加到去离子水中进行自组装，形成无载体纳米粒即人工自噬靶向嵌合体。2.根据权利要求1所述的人工自噬靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，鸟嘌呤衍生物结构式如下：3.根据权利要求2所述的人工自噬靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，鸟嘌呤衍生物通过以下方法制得：
将化合物1溶于溶剂中，然后加入4-氟苄醇和碱性催化剂，在室温下反应制得化合物2；化合物2在盐酸回流条件下制得化合物3；化合物3、n-溴代琥珀酰亚胺和冰醋酸，在室温条件下反应制得化合物4；化合物4、n-乙酰-l-半胱氨酸和碱溶于溶剂中，在85-95℃条件下反应制得化合物5；将化合物5、hatu、dipea和nlg8189溶于溶剂中，在室温条件下反应制得化合物6；化合物6溶于溶剂中，然后加入水合氢氧化锂，室温反应制得鸟嘌呤衍生物。4.根据权利要求1所述的人工自噬靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，核苷类抗肿瘤药物为甲氨蝶呤、阿糖胞苷、去氧氟尿苷或地西他滨。5.根据权利要求1-4任一项所述的人工自噬靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，鸟嘌呤衍生物分子溶解在有机溶剂中，得到浓度为8-12mg/ml的鸟嘌呤衍生物溶液；核苷类抗肿瘤药物溶解在有机溶剂中，得到浓度为8-12mg/ml的核苷类抗肿瘤药物溶液。6.根据权利要求1所述的人工自噬靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，还包括向体系中加入碱溶液继续混匀后再超声处理。7.根据权利要求1或6所述的人工自噬靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，碱溶液为naoh溶液，浓度为3-6mg/ml，超声处理时间为10-20min。8.根据权利要求1所述的人工自噬靶向嵌合体的制备方法，其特征在于，还包括：自组装反应后进行透析去除有机溶液。9.采用权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的人工自噬靶向嵌合体。10.权利要求8所述的人工自噬靶向嵌合体在制备降解致病蛋白药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种人工自噬靶向嵌合体及其制备方法和应用，该人工自噬靶向嵌合体制备方法包括以下步骤：分别将鸟嘌呤衍生物分子和核苷类抗肿瘤药物溶解在有机溶剂中，将两种溶液混匀，超声处理，然后滴加到去离子水中进行自组装，形成无载体纳米粒即人工自噬靶向嵌合体。本发明中鸟嘌呤衍生物和核苷类抗肿瘤药物碱基配对1:1自组装形成的无载体纳米粒，具有制备简单、载药量高、稳定性好等优势。该纳米粒既可利用抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞的同时激活机体免疫，又可特异性降解胞内的免疫检查点蛋白增强机体免疫应答能力，实现免疫联合治疗。实现免疫联合治疗。实现免疫联合治疗。


技术研发人员：曹俊 王雅臻 高会乐 何斌
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/13