用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及探针和应用

1.本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及探针和应用。


背景技术：

2.鸭支原体(mycoplasmaanatis，ma)感染又称鸭传染性窦炎，是由鸭支原体造成的呼吸道传染病，鸭支原体主要侵害鸭呼吸道，也被称为“慢呼”，同时也会感染鸭生殖道，影响生产性能，感染转归慢，不同日龄鸭均易感，支原体阳性鸭群免疫力通常较低，易混合感染其他病原，协同致病，给养鸭业造成较大的经济损失。
3.关于鸭支原体国际上的报道较少。一般来说，物种边界的ani阈值95％，而鸭支原体基因组与其他物种的ani值低于74％，提示它是一个全新的物种。
4.鸭支原体发病越来越普遍，对生产影响巨大，但是检测方法更新较慢，专利“一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒”(专利号：zl201911192095.0)已公布了鸭支原体普通pcr(以下简称cpcr)检测方法，填补了支原体检测空白，应用价值极大。但在实际应用中，现有常规检测方法灵敏度不够高、出现漏检的情况，探针法荧光定量检测方法可以提高检测灵敏度，检测结果更准确。
5.目前ma实验室检测方法主要包括支原体分离、培养、鉴定等。ma属于难分离培养的一类微生物，分离操作繁琐，实验条件严苛，很难在条件一般的实验室开展。普通pcr因为非特异性扩增而产生假阳性结果，而且灵敏度不高还会出现漏检的缺点，因此应用探针法荧光定量是更优选择，将为鸭支原体的检测提供更加特异和灵敏的检测方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及其探针，以及在鸭支原体检测上的应用，以解决现有鸭支原体检测灵敏度和特异性不够，有错检漏检的问题。
7.根据本发明的第一个方面，提供了一种用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及其探针，其中，该引物对的序列如seq id no:4和seq id no:5所示，该探针序列如seq id no:6所示。由此，采用该引物对及其探针对鸭支原体进行探针法荧光定量检测时，其检测的特异性和灵敏度更加高，比现有技术中普通pcr检测灵敏度高15.59％(n＝539)。可以有效克服现有技术中普通pcr检测假阳性率高及漏检率高的问题，使检测结果更加准确。
8.根据本发明的第二个方面，提供了一种用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及其探针在鸭支原体检测上的应用，其中，该引物对的序列如seq id no:4和seq id no:5所示，该探针序列如seq id no:6所示。
9.根据本发明的第三个方面，提供了一种用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及其探针在制备鸭支原体检测制品中的应用，其中，该引物对的序列如seq id no:4和seq id no:5所示，该探针序列如seq id no:6所示。
10.根据本发明的第四个方面，提供了一种用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及其探针在制备鸭支原体检测或诊断试剂盒中的应用，其中，该引物对的序列如seq id no:4和seq id no:5所示，该探针序列如seq idno:6所示。
11.根据本发明的第五个方面，提供了一种用于鸭支原体检测的试剂盒，该试剂盒包括用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及其探针，其中，该引物对的序列如seq id no:4和seq id no:5所示，该探针序列如seq idno:6所示。由此，该试剂盒相较于现有技术，具有更高的灵敏度和特异性，检测效果更好。
12.在某些实施方式中，该试剂盒用于检测的样品包括鸭的组织病料样品或鼻咽喉拭子样品或精液或泄殖腔拭子样品。
13.根据本发明的第六个方面，提供了一种鸭支原体检测的方法，该方法包括如下步骤：
14.1)待检测样品的总基因组dna获取；
15.2)采用用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及其探针进行探针法荧光定量检测，其中，该引物对的序列如seq id no:4和seq id no:5所示，该探针序列如seq id no:6所示；
16.3)检测结果中ct值小于或等于35.04时，判定为阳性。
17.由此，采用该检测方法，可以大大提高鸭支原体检测效率及检测效果。
18.在某些实施方式中，步骤2)中探针法荧光定量检测的标准曲线为y＝45.294-3.418x。
19.根据本发明的第七个方面，提供了一种鸭支原体检测的方法在鸭支原体检测中的应用。
20.根据本发明的第八个方面，提供了一种鸭支原体检测的方法在鸭场疾病防控中的应用。
21.本发明的有益效果：采用本发明的引物对及其探针对鸭支原体进行探针法荧光定量检测时，其检测的特异性和灵敏度更加高，比现有技术中普通pcr检测灵敏度高15.59％(n＝539)。可以有效克服现有技术中普通pcr检测假阳性率高及漏检率高的问题，使检测结果更加准确。而采用该引物对及其探针制备的鸭支原体检测制品(如试剂盒等)也相较于现有技术的普通pcr检测方法，有更高的灵敏度和特异性，检测效果更好。
附图说明
22.图1为引物组合2的特异性检测结果，其中a-e表示不同的支原体核酸模板，分别为：滑液囊支原体、鸡毒支原体、猪肺炎支原体、牛支原体、鸭支原体；f-h为空白；
23.图2为采用引物组合2进行qpcr检测时的标准曲线；
24.图3为采用引物组合2进行qpcr检测与普通pcr检测的灵敏度对比结果，其中a表示普通pcr检测(cpcr)的阳性率，b表示qpcr检测的阳性率，c表示cpcr与qpcr均为阳性的阳性率。
具体实施方式
25.下面结合附图对发明作进一步详细的说明。
26.一、材料和方法
27.引物和探针是基于鸭支原体前期比较基因组学研究，发明人已经在文献(zhou q,mai k,yang d,liu j,yan z,luo c,tan y,cao s,zhou q,chen l,chen f.comparative genomic analysis of mycoplasma anatis strains.genes genomics.2021nov；43(11):1327-1337.)中公开了鸭支原体的毒株基因组序列信息，通过已经公布的16株鸭支原体的序列，序列信息如表1所示(表1中“genbank accession”为对应毒株的ncbi登录号)，突破传统的16srna引物序列，创新的在整个鸭支原体全基因组着手分析其特异性，设计引物对与探针，初步设计了10对引物，具体信息如表2。
28.表1 16种鸭支原体菌株在ncbi上的具体信息
[0029][0030][0031]
表2设计的10对引物组合信息表
[0032][0033]
[0034]
二、引物的初步筛选
[0035]
使用abi7500快速实时pcr系统(applied biosystems)进行绝对定量测定(探针法荧光定量pcr检测，以下也简称qpcr检测)。10μl反应体系包含5μl avant fast probe pcr mix(广州avanti生物科技有限公司)、0.05μl qn rox、0.2μl上下游引物、0.1μl探针、2.45μl rnase-free water(takara，中国)和2μldna模板。循环条件为：95℃5min，然后在95℃15s，60℃30s，循环40次。无rnase的水作为阴性对照，使用天根细菌dna试剂盒(tiangen)提取ma单克隆培养液(109ccu/ml)总基因组dna作为阳性对照。对上述引物探针组(表2)进行初步筛选，结果如表3所示：其中1和3组合未出现扩增曲线，舍去；4、9和10组合出现非特异性扩增，舍去；初步筛选剩下2、5、6、7、8引物组合，共5个引物组合。
[0036]
表3设计的10对引物组合初步筛选结果
[0037][0038]
备注:表中数字表示qpcr检测的ct值；undetermined表示“未检测出”。
[0039]
三、灵敏度比较筛选
[0040]
将ma单克隆培养液(109ccu/ml)倍比稀释后，使用天根细菌dna试剂盒(tiangen)提取不同稀释倍数的样品总基因组dna作为模版，比较不同引物探针组的灵敏性，结果如表4所示：引物组合2灵敏度最高，最低可以检测到10ccu/ml，遂选定组合2为检测鸭支原体的引物探针组，进行进一步试验筛选。如表2中公布的该引物组合2的上游引物为(seq idno:4)：cggtaggaaaataccgaaagaga；下游引物为(seq id no:5)：gtgcaacaacacgttctcgg；引物探针为(seq id no:6)：tccaattcatcaaagacctgaggaagc。
[0041]
表4初步筛选出来的5对组合引物灵敏度比较结果
[0042][0043]
备注:表中数字表示qpcr检测的ct值；undetermined表示“未检测出”。
[0044]
四、引物组合2的特异性试验
[0045]
使用不同的支原体(鸭支原体、滑液囊支原体、鸡毒支原体、猪肺炎支原体、牛支原体)核酸作为模板进行扩增，使用鸭支原体、滑液囊支原体、鸡毒支原体、猪肺炎支原体、牛支原体的核酸进行qpcr特异性检测，qpcr检测的引物采用组合2。扩增曲线如图1所示，图1中a-e表示不同的支原体核酸模板，分别为：滑液囊支原体、鸡毒支原体、猪肺炎支原体、牛支原体、鸭支原体；f-h为空白；结果表明只有e中鸭支原体(ma)能扩增，其他都不能扩增，这表明采用引物组合2的taqman-qpcr检测是特异性的。
[0046]
五、引物组合2的标准曲线建立
[0047]
选择上游和下游引物序列来扩增320bp的ma基因片段，引物如下：上游引物，5'-cgggtaggaaaataccgaaagaga-3'(seq id no:31)；下游引物，5'-gtgcaacaacacgttctcgg-3'(seq id no:32)。使用试剂盒(gelextractionkit,omegabio-tek)从琼脂糖凝胶中纯化pcr产物，并将其克隆到质粒载体(pmdtm19-t，takara)中。该质粒即可作为ma阳性对照。
[0048]
将质粒倍比稀释后的ct值相对于质粒拷贝的对数作出该方法的标准曲线。然后应用线性回归分析来计算r2和斜率值。假设100％的效率，如果dna模板在每个循环中加倍，则pcr效率计算为e＝10(-1/斜率)-1，其中e是pcr效率。根据qpcr中质粒生成的标准曲线，它的反应效率为e＝96.157％(r2＝0.999)，y＝45.294-3.418x，其中y表示ct值，x表示标准品拷贝数，检测出灵敏度为36个拷贝(如图2标准曲线)。以103为阳性标准，当ct值小于或等于35.04时，判定为阳性；而当ct值大于35.04时，判定为阴性。
[0049]
六、引物组合2的灵敏度及有效性验证
[0050]
6.1、与普通pcr(cpcr)检测方法比较试验
[0051]
使用天根细菌dna试剂盒(tiangen)提取待检测鸭群中泄殖腔拭子样本的总基因组dna，使用专利“一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒”(专利号：zl201911192095.0)公布的普通pcr(cpcr)和本次筛选的引物组合2及建立的qpcr方法同时对539份样品进行检测，结果如图3所示，图3中flock1-4表示不同的群，a表示普通pcr(cpcr)检出的阳性率，b表示qpcr检出的阳性率，c表示采用cpcr及qpcr两次都检出阳性的阳性率。结果表明：在第1群中，普通pcr方法的阳性率为0.00％，qpcr方法检出的阳性率为6.99％，cpcr及qpcr两次都检出阳性的阳性率为0.00％；在第2群中，普通pcr方法和qpcr方法检出的阳性率均为
0.00％，cpcr及qpcr两次都检出阳性的阳性率为0.00％；在第3群中，普通pcr方法的阳性率是10.76％，qpcr法检出的阳性率为23.42％，cpcr及qpcr两次都检出阳性的阳性率为10.13％；在第4群中，普通pcr方法的阳性率是14.21％，qpcr法检出的阳性率为42.63％，cpcr及qpcr两次都检出阳性的阳性率为14.21％；总体情况，普通pcr方法的阳性率是8.16％，qpcr法检出的阳性率为23.75％，cpcr及qpcr两次都检出阳性的阳性率为7.98％。综上所述，qpcr灵敏度比普通pcr方法高15.59％(n＝539)。
[0052]
而且，图3中结果也证明了普通pcr有一定的假阳性率，在第3群及总体数据中，cpcr及qpcr两次都检出阳性的阳性率低于cpcr的阳性率就可以得出普通pcr(cpcr)检出结果中有一定的假阳性率(因为只在cpcr检出了阳性，而在qpcr未检出阳性，说明cpcr检出结果中有一定的假阳性率)。而图3中qpcr法检出的阳性率均高于普通pcr(cpcr)检出的阳性率，说明普通pcr(cpcr)会有一定的漏检率。所以采用引物组合2的qpcr检测方法的灵敏度要高于现有技术的普通pcr(cpcr)检测方法，在用于鸭支原体检测时，效果更加准确和灵敏。
[0053]
6.2采用引物组合2的qpcr检测方法的应用
[0054]
从广东(n＝130)、安徽(n＝31)、浙江(n＝53)、福建(n＝40)和江苏(n＝16)的270个种鸭群中，每群随机采集四只鸭子，共采集了1080个泄殖腔拭子样本，使用天根细菌dna试剂盒(tiangen)提取总基因组dna。其中393只种鸭ma阳性，阳性率为36.39％。其中，广东地区阳性率为43.46％；安徽地区阳性率为45.97％；浙江地区阳性率为1.42％；福建地区的阳性率为40.63％；江苏地区的阳性率为65.63％。样本来源按性别和日龄(育雏期，0-4周；育成期，5-29周；产蛋期，30周以上)进行分类，具体样本信息如表5所示。
[0055]
表5采用引物组合2的qpcr方法在ma检测上的应用
[0056]
[0057][0058]
以上结果表明，采用引物组合2作为qpcr检测的引物，对鸭群体进行检测时，可以高效的检测出鸭支原体情况，且相较于现有技术中普通pcr(cpcr)的特异性和灵敏度更高，检出效果更好，应用前景更好。
[0059]
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

技术特征：
1.用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及其探针，其中，所述引物对的序列如seq id no:4和seq id no:5所示，所述探针序列如seq idno:6所示。2.权利要求1中所述的引物对及其探针在鸭支原体检测上的应用。3.权利要求1中所述的引物对及其探针在制备鸭支原体检测制品中的应用。4.权利要求1中所述的引物对及其探针在制备鸭支原体检测或诊断试剂盒中的应用。5.一种用于鸭支原体检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如权利要求1中所述的引物对及其探针。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测的样品包括鸭的组织病料样品或鼻咽喉拭子样品或精液或泄殖腔拭子样品。7.一种鸭支原体检测的方法，其中，所述方法包括如下步骤：1)待检测样品的总基因组dna获取；2)采用权利要求1中所述的引物对及其探针进行探针法荧光定量检测；3)检测结果中ct值小于或等于35.04时，判定为阳性。8.根据权利要求7中所述的方法，其中，所述步骤2)中探针法荧光定量检测的标准曲线为y＝45.294-3.418x。9.权利要求7或8中所述的方法在鸭支原体检测中的应用。10.权利要求7或8中所述的方法在鸭场疾病防控中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于鸭支原体探针法荧光定量检测的引物对及其探针，该引物对的序列如SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示，该探针序列如SEQ ID No:6所示。采用上述引物对及其探针对鸭支原体进行探针法荧光定量检测时，其检测的特异性和灵敏度更加高，比现有技术中普通PCR检测灵敏度高15.59％(n＝539)。由此，可以有效克服现有技术中普通PCR检测假阳性率高及漏检率高的问题，使检测结果更加准确。而采用该引物对及其探针制备的鸭支原体检测制品(如试剂盒等)相较于现有技术的普通PCR检测制品，有更高的灵敏度和特异性，检测效果更好。检测效果更好。检测效果更好。


技术研发人员：周祺 何旭东 朱蒲朵 魏晓娜 余水兰 严专强 麦凯杰 蔺文成 周庆丰 陈峰
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.06.28
技术公布日：2023/8/13