一种鉴定鸭星状病毒的引物和探针组合及其应用

1.本发明属于动物病毒核酸扩增生物技术领域，具体涉及一种鉴定鸭星状病毒的引物和探针组合及其应用。


背景技术：

2.鸭星状病毒(duck astrovirus，dastv)能够通过水平和垂直传播两种途径感染鸭，且具有跨种感染鸡、鹅、野生鸟类以及人的潜在风险。由于dastv-2缺乏合适的体外培养体系，在病毒分离培养和病毒核酸扩增等方面还有众多亟待解决的技术难点，这对dastv-2分子生物学特性的科学研究以及鸭星状病毒的防疫检疫带来巨大障碍。
3.现有dastv-2核酸扩增方法主要有pcr和q-pcr等，尽管pcr技术在核酸扩增技术领域长期占据垄断地位，但常规pcr扩增对引物序列、反应温度、实验设备等都有很高的要求。一方面在设计扩增引物时，要求核苷酸gc含量不能过高、tm值贴近72℃、引物3'端要绕开密码子的第3位、引物3'端不可以挑选a、引物不能引发dna聚合反应、以及引物与引物之间应避免形成二聚体等；另一方面常规pcr扩增需要精密仪器，实验时间长，且常规pcr扩增产物的鉴定还依赖于琼脂糖凝胶电泳，其灵敏度不高。上述因素导致常规pcr方法在核酸扩增与鉴定中存在诸多的应用限制。
4.重组酶聚合酶扩增(recombinase ploymerase amplication，rpa)是一种新型恒温核酸扩增技术，与pcr相比，rpa扩增对对引物序列容错率高，不需要变温反应，且操作简便，反应快速，无需精密仪器，是一种可以替代pcr的核酸扩增技术。rpa与横向流动试纸(lateral flow dipstick，lfd)结合的rpa-lfd技术，可实现核酸的快速扩增与产物的可视化鉴定，这为病毒核酸快速扩增及鉴定提供了一种新的途径。
5.在rpa-lfd技术中，设计针对靶标基因的引物和匹配探针是实现高效扩增和精准鉴定的关键因素。不同引物、探针组合具有不同的扩增效率，探针碱基错配也会影响扩增效率，甚至出现假阳性结果。遗憾的是，目前仍没有一款专用的软件可供用户来设计rpa-lfd反应所需的引物和探针，而是需要研究人员进行探索和验证。并且当前也未见有关于利用rpa-lfd扩增与鉴定dastv-2核酸的相关技术报道。
6.基于以上原因，亟需设计针对dastv-2基因序列且适用于rpa-lfd扩增与鉴定的、实验设备要求低、灵敏特异的专用引物和匹配探针，实现dastv-2核酸快速扩增和可视化鉴定。


技术实现要素：

7.为解决现有技术中无适用于rpa-lfd扩增与鉴定的、实验设备要求低、灵敏特异的专用引物和匹配探针，实现dastv-2核酸快速扩增和可视化鉴定的问题，本发明基于rpa-lfd技术原理，通过设计针对dastv-2基因序列且适用于rpa-lfd核酸扩增与鉴定的、灵敏特异的专用引物和匹配探针，提供了一种鉴定鸭星状病毒的引物和探针组合及其应用，建立了该专用引物和匹配匹配探针的应用方法，实现了dastv-2核酸的现场快速扩增和可视化
鉴定。
8.具体采用如下技术方案：
9.本发明提供了一种鉴定鸭星状病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合是根据鸭星状病毒的核酸所设计，包括引物和匹配探针，所述引物包括上游引物rpa-d-f1和下游引物rpa-d-r1，所述上游引物rpa-d-f1和下游引物rpa-d-r1的序列长度均为30～34bp；
10.所述下游引物rpa-d-r1的5'端修饰生物素基团；
11.所述匹配探针的5'端修饰一个抗原标记，5'端和3'末端的中部位置标记一个四氢呋喃，3'末端修饰一个封闭基团。
12.优选地，所述抗原标记为6-羧基荧光素fam、异硫氰酸荧光素fitc其中的一种。
13.优选地，所述封闭基团为胺基、磷酸基团、c3-spacer其中的一种。
14.优选地，所述上游引物rpa-d-f1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物rpa-d-r1的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述匹配探针的序列如seq id no.3所示。
15.本发明还提供了上述的引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定鸭星状病毒核酸中的应用。
16.优选地，所述鸭星状病毒为dastv-2。
17.优选地，所述上游引物rpa-d-f1、所述下游引物rpa-d-r1和所述匹配探针的适用终浓度均为1～10述探针的适，最佳浓度均为5佳浓度均为。
18.优选地，利用所述引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定dastv-2的过程中，使用到的dastv-2质粒标准品的核酸模板的拷贝数≥3粒标准1拷贝/贝标。
19.优选地，利用所述引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定dastv-2的过程中，所述引物和探针组合扩增与鉴定的靶序列为dastv-2基因组中orf2基因cds区序列。
20.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
21.本发明提供一种灵敏度高和特异性强的针对dastv-2基因序列且适用于rpa-lfd技术的核酸扩增与鉴定的专用引物和匹配探针，并建立了该专用引物和匹配探针的应用方法。利用该专用引物和匹配探针扩增与鉴定dastv-2核酸时不需要专门的精密设备，只需借助恒温水浴或金属浴即可完成实验，因此更适合于野外和现场条件下鸭星状病毒核酸的快速扩增与可视化鉴定应用。
22.与现有技术相比，本发明提供的基于rpa-lfd扩增与鉴定dastv-2核酸和引物与探针组合及应用方法具有如下优点：
23.(1)本发明解决了现有技术在dastv-2核酸扩增与鉴定中对引物序列容错率低、灵敏度低等问题。本发明设计和优化了针对dastv-2基因序列的rpa扩增引物和匹配探针，结合rpa-lfd技术克服了以上缺点。该rpa扩增引物和匹配探针特异性强、扩增效率高、无假阳性和假阴性；特别是能够扩增与鉴定含量较低的dastv-2核酸样品。本发明对实现微量dastv-2核酸的快速扩增与鉴定具有重要意义，具有较大应用前景。
24.(2)本发明解决了现有技术在dastv-2核酸扩增与鉴定中需要专门精密仪器、耗时长、以及扩增产物依赖琼脂糖凝胶电泳鉴定等问题。本发明提供的引物和匹配探针结合rpa-lfd技术，只需在37～39℃的温水中反应8min～15min便可完成dastv-2核酸的rpa扩增；将扩增产物在胶体金试纸上进行lfd鉴定，通过肉眼观察便可鉴定扩增结果，能够实现dastv-2核酸的现场快速扩增与肉眼可视化鉴定，不需要专门精密仪器、操作简便、实验时
间短。本发明提供的引物与探针组合及应用方法非常适用于dastv-2核酸样品大批量的快速扩增和可视化鉴定，在dastv-2分子生物学特性的科学研究以及鸭星状病毒的防疫检疫中具有非常广阔的市场前景和巨大的经济社会效益，适于大范围推广应用。
附图说明
25.图1为本发明引物和匹配探针扩增与鉴定dastv-2核酸的琼脂糖凝胶电泳结果，其中图中m为dnamarker；p为rpa试剂通用阳性对照；n为阴性对照；1为引物rpa-d-f1、rpa-d-r1的扩增产物；
26.图2为本发明引物和匹配探针扩增与鉴定dastv-2核酸的胶体金试纸鉴定结果，其中图中1为阴性对照；2为rpa试剂通用阳性对照；3为上游引物rpa-d-f1、下游引物rpa-d-r1及匹配探针鉴定结果；4为上游引物rpa-d-f2、下游引物rpa-d-r2及匹配探针鉴定结果；5为上游引物rpa-d-f3、下游引物rpa-d-r3及匹配探针鉴定结果；
27.图3为本发明引物和匹配探针反应浓度优化结果，其中图中1为阴性对照；2为20μμ/μl引物和探针；3为10μμ/μl引物和探针；4为5μμ/μl引物和探针；5为1μμ/μl引物和探针；
28.图4为本发明引物和匹配探针扩增与鉴定dastv-2核酸时的敏感性分析结果，其中图中1～7分别为3
×
106～3
×
100拷贝/μl标准质粒；
29.图5为常规pcr扩增dastv-2核酸时的敏感性分析结果，其中图中m为dna marker；p为阳性对照；n为阴性对照；1为3
×
104拷贝/μl标准质粒；2为3
×
103拷贝/μl标准质粒；3为3
×
102拷贝/μl标准质粒；
30.图6为本发明引物和匹配探针扩增与鉴定dastv-2核酸的时特异性分析结果，1为rpa试剂通用阳性对照；2为阴性对照；3为dastv-2；4为dhv；5为gastv；6为ducv；7为dpv。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.下面实施例中所用的需要说明的材料如下：
33.rpa扩增基础试剂、胶体金试纸均为安普未来(常州)生物科技有限公司产品。
34.病毒rna提取试剂为上海迈跟生物科技公司产品。
35.常规pcr检测试剂、逆转录试剂、tris-hcl酚试剂均为上海碧云天生物科技有限公司产品。
36.恒温金属浴为上海恒一公司产品。
37.pcr仪为杭州博日公司产品。
38.dastv-2标准质粒是根据ncbi官网收录的dastv-2的orf2基因cds区序列，委托生工生物工程(上海)股份有限公司通过化学合成法制备而成，所制备的dastv-2标准质粒拷贝数为3
×
109拷贝/μl。
39.鸭肝炎病毒(dhv)、鹅星状病毒(gastv)、鸭圆环病毒(ducv)、鸭瘟病毒(dpv)均由本实验室保存。收集了30份鸭的肝脏组织样本，-80℃保存备用。
40.实施例1
41.1、引物和匹配探针的设计与合成
42.根据rpa-lfd技术原理，以dastv-2的orf2基因cds区序列为靶序列，设计适用于rpa-lfd扩增与鉴定dastv-2核酸的专用引物与匹配探针。
43.如表1所示，按照要求最终设计出3对引物与匹配探针。
44.表1dastv-2核酸rpa扩增引物与匹配探针
[0045][0046]
所设计的引物具备如下特征：上游引物和下游引物序列长度均为30～34bp，gc含量为40％～50％，单核苷酸重复的最大长度为3，使用该引物所扩增的产物长度为150～250bp；为实现lfd鉴定，下游引物5'端修饰了生物素基团。
[0047]
所设计的匹配探针具有如下特征：匹配探针序列的长度均为49bp，匹配探针5'端修饰一个6-羧基荧光素fam作为抗原标记；在5'端和3'末端的中部位置标记一个四氢呋喃(thf)作为核酸内切酶的识别位点；3'末端修饰一个c3-spacer作为封闭基团。
[0048]
设计的所有引物和探针的普通化学合成均委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0049]
2、引物和匹配探针实验
[0050]
以拷贝数为3
×
106拷贝/μl的dastv-2标准质粒为核酸模板，按照rpa扩增试剂盒说明书进行扩增，rpa扩增反应体系见表2；扩增反应体系各组分装入ep管，放置在恒温金属浴中孵育8～15min，反应温度为37℃～39℃。扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳鉴定和胶体金试纸鉴定，根据鉴定结果，确定最佳引物和匹配探针。
[0051]
表2rpa扩增反应体系
[0052]
组分各组分体积上游引物0.42μl下游引物0.42μl匹配探针0.6μl核酸模板2μl基础缓冲液12μlddh2o补齐至18μl
[0053]
琼脂糖凝胶电泳鉴定结果显示，使用表1中所示的rpa-d-f1和rpa-d-r1引物进行rpa扩增反应，扩增产物用tris-hcl酚试剂进行dna纯化后，再经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可发现大小约为240bp左右的条带(见图1)，符合目的条带大小(242bp)；该结果表明在该rpa扩增反应中，表1中的rpa-d-f1和rpa-d-r1引物对是可以用于进行rpa扩增反应的引物对。使用表1中所示的rpa-d-f2和rpa-d-r2引物以及rpa-d-f3和rpa-d-r3引物进行rpa扩增反应，扩增产物用tris-hcl酚试剂进行dna纯化后，再经琼脂糖凝胶电泳鉴定，未发现符合目的条带大小的条带，该结果表明表1中的rpa-d-f2和rpa-d-r2引物对以及rpa-d-f3和rpa-d-r3引物对不可以进行rpa扩增反应。
[0054]
图2中胶体金试纸鉴定结果显示，使用表1中所示的rpa-d-f1和rpa-d-r1引物和匹配探针、rpa-d-f2和rpa-d-r2引物和匹配探针、rpa-d-f3和rpa-d-r3引物和匹配探针进行rpa反应，扩增产物用胶体金试纸(即lfd)鉴定，扩增产物上的fam被试纸质控线(c)处的fam抗体纳米金粒捕捉，扩增产物上的生物素被检测线(t)处的生物素抗体捕捉，鉴定结果中使用rpa-d-f1和rpa-d-r1引物和匹配探针的扩增产物显阳性(见图2)，而使用rpa-d-f2和rpa-d-r2引物和匹配探针、rpa-d-f3和rpa-d-r3引物和匹配探针的扩增产物不显示阳性结果；该结果表明在运用rpa-lfd扩增与鉴定dastv-2核酸时，表1中的rpa-d-f1和rpa-d-r1引物及其匹配探针对是可用于鉴定dastv-2核酸的引物和匹配探针；rpa-d-f2和rpa-d-r2引物及其匹配探针对以及rpa-d-f3和rpa-d-r3引物及其匹配探针对是不可以进行rpa反应，用于鉴定dastv-2核酸；实现该rpa扩增反应的温度为37℃～39℃(最佳反应温度是38℃)，时间为8～15min(最佳反应时间是10min)。
[0055]
3、引物和匹配探针的浓度
[0056]
为了确定上述rpa-d-f1和rpa-d-r1引物及其和匹配探针的最佳适用浓度，以dastv-2标准质粒作为核酸模板加入到rpa扩增反应体系中(见表2)，在引物和探针的浓度分别为20μm/μl；10μm/μl；5μm/μl；1μm/μl条件下，利用方阵法筛选最佳引物和探针浓度。扩增反应体系各组分装入ep管，放置在38℃恒温金属浴中孵育10min；反应结束后取反应液2μl加入98μl的lfd缓冲液中混合静止2min，将胶体金试纸前端插入混合液，5min内观察胶体金试纸检测线(t)条带的颜色深浅来判定最佳引物和探针浓度。
[0057]
反应条件优化结果显示，如表1中所示的rpa-d-f1和rpa-d-r1引物和匹配探针的浓度在1～10μm/μl时，胶体金试纸检测线(t)均有条带，但引物和探针浓度为5μm/μl时扩增效率最高，检测条带最清晰(见图3)；最终确定引物探针的最佳适用浓度均为5μm/μl。
[0058]
4、引物和匹配探针组合扩增与鉴定dastv-2核酸时的敏感性分析
[0059]
为测试本发明的引物和匹配探针在扩增与鉴定dastv-2核酸时的敏感性，将dastv-2标准质粒梯度稀释用作rpa-lfd反应的核酸标准品，稀释后的标准质粒拷贝数分别为3
×
106拷贝/μl、3
×
105拷贝/μl、3
×
104拷贝/μl、3
×
103拷贝/μl、3
×
102拷贝/μl、3
×
101拷贝/μl、3
×
100拷贝/μl。取上述不同拷贝数标准质粒作为核酸模板，以上述rpa-d-f1和rpa-d-r1引物和匹配探针按最佳适用浓度加入到rpa扩增反应体系中(见表2)(引物的序列为：上游引物rpa-d-f1:5'-aaattcaaacctctcttatgctgcagcgccac-3'，如seq id no.1所示；下游引物rpa-d-r1:5'-gagccatcgattgtgcgctgttg ttcttgttg-3'，如seq id no.2所示；与上述引物匹配的探针序列为：5'-tttcttgtttgggc agccctttgcatcatttattcaactacgatgtcaa-3'，如seq id no.3所示)，扩增反应体系各组分装入ep管，放置在38℃恒温金属浴中孵
育10min；扩增反应结束后取反应液用胶体金试纸鉴定，以能通过肉眼观察到试纸检测线(t)条带的对应拷贝数作为rpa-lfd扩增与鉴定dastv-2标准质粒的最低限量。
[0060]
同时取上述不同拷贝数标准质粒作为核酸模板，利用本发明上述引物(上游引物rpa-d-f1:5'-aaattcaaacctctcttatgctgcagcgccac-3'，如seq id no.1所示；下游引物rpa-d-r1:5'-gagccatcgattgtgcgctgtt gttcttgttg-3'，如seq id no.2所示)进行常规pcr扩增与鉴定，比较其与rpa-lfd扩增与鉴定dastv-2核酸的敏感性差异，实验结果见图4。按照常规pcr扩增试剂盒说明书配制反应体系，然后按照下列程序进行扩增：94℃3min；94℃30sec，55℃1min，72℃1min(此阶段循环35次)，72℃7min，4℃保存。pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察电泳条带，确定常规pcr扩增与鉴定dastv-2标准质粒的最低限量，实验结果见图5。
[0061]
由图4和图5的结果显示可知，常规pcr方法可以扩增与鉴定的限值为3
×
103拷贝/μl的质粒标准品，但条带不清晰，而rpa-lfd方法可以扩增与鉴定的限值为3
×
101拷贝/μl的质粒标准品，表明本发明的引物和匹配探针结合rpa-lfd方法扩增与鉴定dastv-2核酸时的敏感性比常规pcr方法高100倍。
[0062]
5、引物和探针组合扩增与鉴定dastv-2核酸时的特异性分析
[0063]
为测试本发明的引物和匹配探针在扩增与鉴定dastv-2核酸时的特异性，选择分子生物学特点与dastv-2相似的多种病毒进行验证分析。分别取2μl的鸭肝炎病毒(dhv)、鹅星状病毒(gastv)、鸭圆环病毒(ducv)、鸭瘟病毒(dpv)的核酸和dastv-2标准质粒作为扩增模板，以上述rpa-d-f1和rp a-d-r1引物和匹配探针按最佳浓度加入到rpa扩增反应体系(见表2)(引物的序列为：上游引物rpa-d-f1:5'-aaattcaaacctctcttatgctgcagcgc cac-3'，如seq id no.1所示；下游引物rpa-d-r1:5'-gagccatcgattgtg cgctgttgttcttgttg-3'，如seq id no.2所示；与上述引物匹配的探针序列为：5'-tttcttgtttgggcagccctttgcatcatttattcaactacgatgtc aa-3'，如seq id no.3所示)。扩增反应体系各组分装入ep管，放置在38℃恒温金属浴中孵育10min，反应结束后取反应液用胶体金试纸检测，根据各胶体金试纸检测线(t)是否出现条带判定该方法的特异性。
[0064]
由图6结果显示可知，除dastv-2组胶体金试纸检测线(t)有特异性条带外，dhv、gastv、ducv、dpv组胶体金试纸检测线(t)均无该条带，表明本发明设计的引物和匹配探针在运用rpa-lfd扩增与可视化鉴定dastv-2核酸时具有很强的特异性。
[0065]
本发明提供了一种扩增与鉴定鸭星状病毒核酸的rpa引物和探针组合，所述引物和探针组合包括引物和探针，引物的序列为：上游引物rpa-d-f1:5'-aaattcaaacctctcttatgctgcagcgccac-3'，如seq id no.1所示、下游引物rpa-d-r1:5'-gagccatcgattgtgcgctgttgttcttgttg-3'，如seq id no.2所示，与上述引物匹配的探针序列为：5'-tttcttgtttg ggcagc cctttgcatcatttattcaactacgatgtcaa-3'，如seq id no.3所示。
[0066]
在此基础上，本发明还提供了一种运用rpa-lfd技术扩增与可视化鉴定dastv-2核酸的方法。该方法是一种利用上述引物和探针组合以及最佳适用浓度扩增与鉴定dastv-2核酸的方法，包括如下步骤：
[0067]
(1)采用rna提取试剂提取鸭肝脏组织中的总rna。
[0068]
(2)将rna进一步逆转录为cdna。逆转录反应条件是：温度37℃，时间15min，共1个循环；反转录酶在85℃下失活，5sec，共1个循环。
[0069]
(3)以上述所得cdna为核酸模板，利用rpa扩增试剂与seq id no.1所示上游引物、seq id no.2所示下游引物和seq id no.3所示探针进行rpa扩增反应。rpa扩增反应体系为：上游引物和下游引物各0.42各系、探针0.62各系、dna模板2板a、基础缓冲液12础缓、引物和探针浓度为5μμ引物和，ddh2o补足至18至和，于38℃条件下反应10min，得到rpa扩增产物。
[0070]
(4)采用胶体金试纸对rpa扩增产物进行可视化鉴定，即rpa反应结束后取反应液2μl应加入98μl的lfd检测缓冲液中混合静止2min，将胶体金试纸前端插入混合液，5min内根据试纸检测线(t)是否有条带判定鸭肝脏组织中是否存在dastv-2核酸。
[0071]
下面为了更好的说明本发明实施例提供的rpa-lfd扩增与鉴定dastv-2核酸方法的特性，下面运用本发明提供的rpa-lfd方法与常规pcr方法分别扩增与鉴定鸭肝脏组织样品中的dastv-2核酸。
[0072]
利用rpa-lfd方法扩增与鉴定30份鸭肝脏组织中的核酸样本，阳性结果22份，阴性结果为8份；用常规pcr方法最终鉴定出阳性结果19份，阴性结果11份。结果显示rpa-lfd方法准确率比常规pcr方法高，两种方法的符合率为63％；rpa-lfd方法耗时约30min左右，常规pcr方法耗时约2h左右。证明本发明提供的引物和探针组合在运用rpa-lfd方法扩增与鉴定dastv-2核酸具有实验时间短、准确度高、特异性好的优点，适用于大批量dastv-2核酸样品的快速扩增和可视化鉴定。
[0073]
基于rpa-lfd技术原理和反应条件，本发明设计了针对dastv-2基因序列的rpa扩增引物和匹配探针，解决了现有技术在dastv-2核酸扩增与鉴定中对引物序列容错率低、灵敏度低等问题。该rpa扩增引物和匹配探针特异性强、扩增效率高、无假阳性和假阴性；特别是能够扩增与鉴定含量较低的dastv-2核酸样品。本发明对实现微量dastv-2核酸的快速扩增与鉴定具有重要意义，具有较大应用前景。
[0074]
本发明采用rpa-lfd技术扩增与可视化鉴定dastv-2核酸，克服了现有技术在dastv-2核酸扩增与鉴定中需要专门精密仪器、耗时长、以及扩增产物依赖琼脂糖凝胶电泳鉴定等问题，具有不需要专门精密仪器、操作简便、实验时间短等特点，只需在35℃～40℃(最佳为38℃)下反应8～15min(最佳为10min)后便可借助胶体金试纸肉眼鉴定扩增结果。本发明提供的引物与探针组合及应用方法非常适用于dastv-2核酸样品大批量的快速扩增和可视化鉴定，在dastv-2分子生物学特性的科学研究以及鸭星状病毒的防疫检疫中具有非常广阔的市场前景和巨大的经济社会效益，适于大范围推广应用。
[0075]
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
[0076]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0077]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.一种鉴定鸭星状病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合是根据鸭星状病毒的核酸所设计，包括引物和匹配探针，所述引物包括上游引物rpa-d-f1和下游引物rpa-d-r1，所述上游引物rpa-d-f1和下游引物rpa-d-r1的序列长度均为30～34bp；所述下游引物rpa-d-r1的5'端修饰生物素基团；所述匹配探针的5'端修饰一个抗原标记，5'端和3'末端的中部位置标记一个四氢呋喃，3'末端修饰一个封闭基团。2.根据权利要求1所述的一种鉴定鸭星状病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述抗原标记为6-羧基荧光素fam、异硫氰酸荧光素fitc其中的一种。3.根据权利要求1所述的一种鉴定鸭星状病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述封闭基团为胺基、磷酸基团、c3-spacer其中的一种。4.根据权利要求1所述的一种鉴定鸭星状病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述上游引物rpa-d-f1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物rpa-d-r1的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述匹配探针的序列如seq id no.3所示
。
5.权利要求1-4任一项所述的引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定鸭星状病毒核酸中的应用。6.根据权利要求5所述的引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定鸭星状病毒核酸中的应用，其特征在于，所述鸭星状病毒为dastv-2。7.根据权利要求5所述的引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定鸭星状病毒核酸中的应用，其特征在于，所述上游引物rpa-d-f1、所述下游引物rpa-d-r1和所述匹配探针的适用终浓度均为1～10μμ/μl，最佳浓度均为5μμ/μl。8.根据权利要求5所述的引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定鸭星状病毒核酸中的应用，其特征在于，利用所述引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定dastv-2的过程中，使用到的dastv-2质粒标准品的核酸模板的拷贝数≥3
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101拷贝/μl。9.根据权利要求5所述的引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定鸭星状病毒核酸中的应用，其特征在于，利用所述引物和探针组合在非诊断性扩增与鉴定dastv-2的过程中，所述引物和探针组合扩增与鉴定的靶序列为dastv-2基因组中orf2基因cds区序列。

技术总结
本发明属于动物病毒核酸扩增生物技术领域，具体涉及一种鉴定鸭星状病毒的引物和探针组合及其应用。所述引物和探针组合是根据鸭星状病毒的核酸所设计，包括引物和匹配探针，所述引物包括上游引物RPA-D-F1和下游引物RPA-D-R1，所述上游引物RPA-D-F1和下游引物RPA-D-R1的序列长度均为30～34bp；所述下游引物RPA-D-R1的5'端修饰生物素基团；所述匹配探针的5'端修饰一个抗原标记，5'端和3'末端的中部位置标记一个四氢呋喃，3'末端修饰一个封闭基团。本发明提供了一种扩增与鉴定鸭星状病毒核酸的引物和探针组合及其应用，该引物和探针组合及其应用方法特别适用于DAstV-2核酸快速扩增及可视化鉴定应用，具有灵敏度高、特异性强的特点。特点。特点。


技术研发人员：何书海 晋丹丹 薛玉坤 赵利琴 王露遥
受保护的技术使用者：信阳农林学院
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/13