甘薯病毒特异性引物对及其应用、甘薯病毒一步法多重RT-PCR检测方法

甘薯病毒特异性引物对及其应用、甘薯病毒一步法多重rt-pcr检测方法
技术领域
1.本发明属于甘薯病毒检测技术领域，具体涉及甘薯病毒特异性引物对及其应用、甘薯病毒一步法多重rt-pcr检测方法。


背景技术：

2.甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus，splv)、甘薯c病毒(sweet potato c，spvc)、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus，spfmv)和甘薯g病毒(sweet potato virus g，spvg)均属于马铃薯y病毒属，常存在不同程度复合侵染的情况。据相关文献和调查表明这四种甘薯病毒在我国各甘薯种植区频繁发生，其在田间常存在复合侵染的情况，症状主要表现为产生褪绿斑点、紫环斑、黄脉以及紫色羽状斑等，上述甘薯病毒的侵染不仅会造成甘薯产量的大量损失还会因病毒长期积累造成甘薯种性的退化，严重影响甘薯产业的发展，研究表明甘薯病毒病导致的甘薯产量损失可达20％～40％，严重时可导致产量损失至50％以上，由于目前尚未有高效防治甘薯病毒病的化学药剂，因此甘薯脱毒苗的培育和种植成为甘薯病毒病最有效的防控措施，而病毒的检测则是甘薯脱毒苗培育过程中的关键。综上可知建立快速高效的甘薯病毒病检测方法尤为重要。
3.目前虽然存在多种病毒检测技术，但是由于各种因素的限制，在实际应用中较常见的方法主要是pcr扩增技术和酶联免疫吸附技术(elisa)，由于酶连免疫吸附技术存在假阳性反应、只能特异性针对一种病毒进行高效价的血清制备而无法应用于甘薯病毒复合侵染的样品的检测等原因使病毒的检测效率低下，而pcr扩增技术中单重pcr一次仅能检测一种病毒，不仅耗费时间长而且费用较高。
4.公布号为cn103849691a的中国专利申请文献，公开了甘薯褪绿矮化病毒、甘薯g病毒和甘薯羽状斑驳病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列分别设计合成出了三对用以检测甘薯病毒的引物；并同时揭露了利用该三对引物对甘薯病毒进行检测的方法，具体地，采用rt-pcr方法，应用三对特异性引物同时对甘薯叶片中的3种病毒即甘薯褪绿矮化病毒、甘薯g病毒和甘薯羽状斑驳病毒进行扩增检测，并将扩增产物克隆测序比对进行验证。该专利公开了一种通过一次反应能够同时可靠的检测出3种甘薯病毒即甘薯褪绿矮化病毒、甘薯g病毒和甘薯羽状斑驳病毒的检测方法，具有检测效率高、成本低的特点，且具有很高的检测灵敏度，但该专利并不能并不能同时对甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒这四种病毒同时检测。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于解决现有的pcr扩增技术和酶联免疫吸附技术(elisa)所存在的检测效率低下，一次只能检测一种病毒，费时费力的问题。
6.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
7.本发明的第一方面提出一种甘薯病毒特异性引物对，所述甘薯病毒为甘薯潜隐病
毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒中的一种或多种；其特异性引物对分别如下：
8.甘薯潜隐病毒特异性引物对：
9.正向引物：5'-gcagagcaaccatacatgc-3'，(seq id no：1)
10.反向引物：5'-gtrtttcctcagtggttga-3'；(seq id no：2)
11.甘薯c病毒特异性引物对：
12.正向引物：5'-gctgggatggcaatcttgt-3'，(seq id no：3)
13.反向引物：5'-rtrtcytcttcytgcgtgga-3'；(seq id no：4)
14.甘薯羽状斑驳病毒特异性引物对：
15.正向引物5'-agttggtacgtttgtcgtgc-3'，(seq id no：5)
16.反向引物5'-rtrtcytcttcytgcgtgga-3'；(seq id no：6)
17.甘薯g病毒特异性引物对：
18.正向引物5'-acaggaaacacaggaagg-3'，(seq id no：7)
19.反向引物5'-rtrtcytcttcytgcgtgga-3'。(seq id no：8)
20.优选的，所述甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒、甘薯g病毒的特异性引物对经rt-pcr扩增后目的产物大小分别为212bp、422bp、624bp、968bp。
21.本发明的第二方面提出上述甘薯病毒特异性引物对在检测甘薯病毒中的应用。
22.本发明的第三方面提出一种甘薯病毒的一步法多重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：根据甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒四种病毒的外壳蛋白基因核苷酸序列，分别设计并合成上述四种甘薯病毒的特异性引物对，然后分别利用甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒四对特异性引物分别对甘薯叶片中的甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒进行一步法多重rt-pcr反应，将反应产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析及测序比对。
23.优选的，所述一步法多重rt-pcr反应的反应体系如下：
24.反应体系：上游引物为splv正向引物0.6μl，spvc正向引物0.6μl，spfmv正向引物0.6μl和spvg正向引物0.8μl；下游引物为splv反向引物0.6μl，spvc反向引物0.6μl，spfmv反向引物0.6μl和spvg反向引物0.8μl；2x starscriptⅲone-step rt buffer(dye)10μl；starscriptⅲone-step rt enzyme mix 1.0μl；以及分别感染spfmv、splv、spvc和spvg四种甘薯病毒的等量混合模板补至20μl。
25.优选的，所述引物对中的正向引物和反向引物的浓度均相等，splv、spvc、spfmv正向引物的浓度均为0.3μmol/l，spvg正向引物的浓度为0.4μmol/l；所述引物的浓度均是以反应体系的总体积20μl为基准。
26.优选的，所述一步法多重rt-pcr反应的反应程序如下：
27.反应程序：50℃反转录15min；94℃预变性2min；94℃变性15s；56℃退火15s；72℃延伸2min；72℃终延伸10min；循环数设置为30个循环。
28.本发明的优点在于：
29.1、本发明通过对马铃薯y病毒属的甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯g病毒和甘薯c病毒四种甘薯病毒的外壳蛋白基因进行比对，设计并筛选出四对用于检测这四种甘薯病毒的特异性引物，结合一步法rt-pcr检测方法通过对其反应条件的优化建立能同时
检测四种甘薯病毒的一步法多重rt-pcr检测方法，提高了检测效率。
30.2、通过对本发明所建立的检测方法的灵敏度、稳定性及实用性分析，得出本发明所建立的检测方法能同时高效、灵敏的检测甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯g病毒和甘薯c病毒且极大的降低了检测的成本。
附图说明
31.图1为本发明实施例1中四种甘薯病毒特异性引物一步法单重rt-pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果对比图；其中泳道1、3、5、7分别为splv、spvc、spfmv和spvg四种病毒，泳道2、4、6、8为健康甘薯对照；
32.图2为本发明实施例1中四种甘薯病毒特异性引物一步法单重rt-pcr及多重rt-pcr的琼脂糖凝胶电泳结果对比图；其中泳道1：splv泳道2：spvc泳道3：spfmv泳道4：spvg泳道5：splv、spvc、spfmv、spvg四种病毒；
33.图3为本发明实施例2中引物加入量不同时一步法单重rt-pcr的琼脂糖凝胶电泳结果对比图；其中0.2、0.4、0.6、0.8、1.0分别对应病毒检测引物加入的体积(μl)；
34.图4为本发明实施例2中不同退火温度时，一步法单重rt-pcr的琼脂糖凝胶电泳结果对比图；其中50、52、54、56、58、60分别对应不同的退火温度(℃)；
35.图5为本发明实施例2中酶加入量不同时一步法单重rt-pcr的琼脂糖凝胶电泳结果对比图，其中0.5、0.75、1.0和1.25分别对应不同的酶加入量(μl)；
36.图6为本发明实施例3中混合模板稀释不同倍数时一步法多重rt-pcr琼脂糖凝胶电泳结果对比图；其中泳道1-2：混合模板稀释1倍，泳道3-4：混合模板稀释2倍，泳道5-6：混合模板稀释3倍，泳道7-8：混合模板稀释4倍；
37.图7为本发明实施例3中随机采取疑似甘薯病毒病样品rna作为模板时一步法多重rt-pcr琼脂糖凝胶电泳结果对比图；其中泳道1～8为随机采取的具有甘薯病毒病症状的样品。
具体实施方式
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
40.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
41.实施例1：引物设计及一步法rt-pcr扩增
42.步骤1：引物设计。由于甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒均属于马铃薯y病毒属，同源性较高，因此为保证甘薯病毒病检测引物的特异性根据其外壳蛋白基因核苷酸序列使用snapgene软件先对下载的病毒基因序列(从ncbi网站上下载)进行比对，再选择其不同源的序列进行引物的设计。将设计好的引物用oligo 7软件对引物进行二聚体形成、发卡结构、碱基组成、tm值以及错配位置等方面的分析后选出合适的引物对
并由通用生物公司进行合成(其中甘薯潜隐病毒引物对名称为splv-f3、splv-r3；甘薯c病毒引物对名称为spvc-f4、spvc-r4；甘薯羽状斑驳病毒引物对名称为spfmv-f4、spfmv-r4；甘薯g病毒引物对名称为spvg-f3、spvg-r3)，其具体引物序列如下：
43.正向引物splv-f3：5'-gcagagcaaccatacatgc-3'，(seq id no：1)
44.反向引物splv-r3：5'-gtrtttcctcagtggttga-3'，(seq id no：2)
45.正向引物spvc-f4：5'-gctgggatggcaatcttgt-3'，(seq id no：3)
46.反向引物spvc-r4：5'-rtrtcytcttcytgcgtgga-3'，(seq id no：4)
47.正向引物spfmv-f4：5'-agttggtacgtttgtcgtgc-3'，(seq id no：5)
48.反向引物spfmv-r4：5'-rtrtcytcttcytgcgtgga-3'，(seq id no：6)
49.正向引物spvg-f3：5'-acaggaaacacaggaagg-3'，(seq id no：7)
50.反向引物spvg-r3：5'-rtrtcytcttcytgcgtgga-3'，(seq id no：8)
51.步骤2：rna提取。采用trizol法提取rna，将单独感染splv、spvc、spfmv
52.和spvg四种甘薯病毒的甘薯叶片分别进行rna提取，其具体步骤如下：取约1g新鲜的甘薯叶片用液氮冷冻并充分研磨至粉末状，将其转入1.5ml的无酶离心管中，加入1ml tripure并混匀，并将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5min以使核蛋白完全解离。随后在离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s后在室温下放置2-3min。在4℃，12000r/min的离心力下高速冷冻离心10-15min。将约450ml上层水相转移到新的1.5ml无酶离心管中，加入等体积的异丙醇颠倒混匀后室温放置10min。在室温或者4℃，12000r/min的条件下离心10min，弃上清液并保留管底沉淀，加入1ml用depc水配制的75％乙醇洗涤沉淀。在室温或4℃，12000r/min离心3min，弃上清留沉淀，管底少量液体可以用枪头吸出。将沉淀室温放置2-3min晾干后加入30-100μlrnase free water充分溶解rna。
53.步骤3：一步法rt-pcr扩增。将步骤2中提取的rna作为模板，以步骤1中设计的四对甘薯病毒的特异性引物作为反应引物进行一步法rt-pcr扩增，同时采用健康甘薯作为对照同时进行一步法rt-pcr扩增，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。另外为了进行对比同时进行一步法单重rt-pcr和一步法多重rt-pcr反应，并将其扩增产物同时进行琼脂糖凝胶电泳。由于单重与多重反应中模板及引物加入量不同，所以其具体反应体系和反应程序如下：
54.(1)一步法单重rt-pcr反应体系：上游引物gsp(10μm)0.8μl，下游引物gsp(10μm)0.8μl，2x starscriptⅲone-step rt buffer(dye)10μl，starscriptⅲone-step rt enzyme mix 1.0μl，nuclease-free water 6.4μl以及rna模板1μl。
55.(2)一步法多重rt-pcr反应体系：上游引物为splv、spvc、spfmv和spvg正向引物各0.8μl，下游引物为splv、spvc、spfmv和spvg反向引物各0.8μl，2x starscriptⅲone-step rt buffer(dye)10μl，starscriptⅲone-step rt enzyme mix1.0μl以及混合模板补齐至20μl。
56.(3)反应程序：50℃反转录15min；94℃预变性2min；94℃变性15s；56℃退火15s；72℃延伸2min；72℃终延伸10min；循环数设置为30个循环。
57.步骤4：各取6μl扩增产物使用含核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶在120v电压下电泳25min，使用凝胶电泳成像仪在紫外光下观察，其一步法单重rt-pcr及健康甘薯为对照的结果为图1，一步法单重rt-pcr与一步法多重rt-pcr对比结果如图2。
58.步骤5：结果分析。本实施例结果如图1和图2所示，其中图1中泳道1为splv引物对
应的一步法单重rt-pcr扩增结果；泳道3为spvc引物对应的一步法单重rt-pcr扩增结果；泳道5为spfmv引物对应的一步法单重rt-pcr扩增结果；泳道7为spvg引物对应的一步法单重rt-pcr扩增结果；泳道2、4、6、8是健康甘薯作为对照的结果。图2中泳道1～4对应的分别为splv、spvc、spfmv和spvg引物的一步法单重rt-pcr扩增；泳道5为四种甘薯病毒的一步法多重rt-pcr扩增结果。由图可知splv、spvc、spfmv和spvg对应的条带长度分别为212bp、422bp、624bp和968bp，与设计的引物的目的片段大小一致，且一步法多重rt-pcr扩增结果与单重结果一一对应，由此可知本发明建立的检测方法可以用于splv、spvc、spfmv和spvg四种甘薯病毒的检测。
59.实施例2：一步法单重rt-pcr反应体系的优化
60.步骤1：引物浓度的优化。设置引物加入量分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μl，其余反应条件及反应程序按照实施例1中的一步法单重rt-pcr的保持不变，按照不同的引物加入量进行一步法rt-pcr扩增，将其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3。根据图3分析得出splv最佳引物加入量为0.6μl，浓度为0.3μmol/l；spvc最佳引物加入量为0.6μl，浓度为0.3μmol/l；spfmv最佳引物加入量为0.6μl，浓度为0.3μmol/l；spvg最佳引物加入量为0.8μl，浓度为0.4μmol/l。
61.步骤2：退火温度优化。在上述引物浓度优化的基础上设置退火温度梯度分别为50、52、54、56、58和60℃，除引物浓度和退火温度外其它条件与实施例1中的一步法单重rt-pcr条件保持一致，按照不同的退火温度进行一步法rt-pcr扩增并将其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图4。根据图4结果分析得出最佳退火温度为56℃。
62.步骤3：酶加入量优化。在引物浓度及退火温度优化的基础上设置酶加入量分别为0.5、0.75、1.0和1.25μl，其余条件与实施例1中的一步法单重rt-pcr条件保持一致，按照不同的酶加入量进行一步法rt-pcr扩增并进行琼脂糖凝胶电泳，其结果为图5。根据图5分析最终确定酶加入量为1.0μl。
63.步骤4：根据优化结果建立一步法多重rt-pcr检测方法，最终确定一步法多重rt-pcr反应体系及反应程序如下：
64.(1)反应体系：上游引物为splv正向引物0.6μl，spvc正向引物0.6μl，spfmv正向引物0.6μl和spvg正向引物0.8μl；下游引物为splv反向引物0.6μl，spvc反向引物0.6μl，spfmv反向引物0.6μl和spvg反向引物0.8μl；2x starscriptⅲone-step rt buffer(dye)10μl；starscriptⅲone-step rt enzyme mix 1.0μl；以及分别感染spfmv、splv、spvc和spvg四种甘薯病毒的等量混合模板补至20μl。
65.(2)反应程序：50℃反转录15min；94℃预变性2min；94℃变性15s；56℃退火15s；72℃延伸2min；72℃终延伸10min；循环数设置为30个循环。
66.实施例3：一步法多重rt-pcr灵敏度、稳定性及实用性分析
67.步骤1：灵敏度及稳定性分析。将单独侵染splv、spvc、spfmv和spvg的rna模板等量混合后并进行1～4倍的稀释，并将相同稀释倍数的模板按照实施例2重复进行一次一步法多重rt-pcr反应，取6μl扩增产物使用含核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶在120v电压下电泳25min，使用凝胶电泳成像仪在紫外光下观察，结果如图6。
68.步骤2：随机采取疑似甘薯病毒病样品进行rna提取，并将其rna作为模板按照实施例2中一步法多重rt-pcr反应体系和反应程序进行一步法多重rt-pcr扩增。取6μl扩增产物
使用含核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶在120v电压下电泳25min，使用凝胶电泳成像仪在紫外光下观察，其结果如图7。
69.步骤3：本实施例结果如图6和图7所示，由图6可知随着模板稀释倍数的增加，本发明所建立的检测方法仍然能够稳定的检测出四种甘薯病毒，由图7可知在随机采取的样品中采用发明所建立的检测方法无论是单重侵染还是复合侵染的病毒均能够检测出，说明本发明所设计的引物及建立的检测方法符合实验预期。
70.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种甘薯病毒特异性引物对，其特征在于，所述甘薯病毒为甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒中的一种或多种；其特异性引物对分别如下：甘薯潜隐病毒特异性引物对：正向引物：5'-gcagagcaaccatacatgc-3'，(seq id no：1)反向引物：5'-gtrtttcctcagtggttga-3'；(seq id no：2)甘薯c病毒特异性引物对：正向引物：5'-gctgggatggcaatcttgt-3'，(seq id no：3)反向引物：5'-rtrtcytcttcytgcgtgga-3'；(seq id no：4)甘薯羽状斑驳病毒特异性引物对：正向引物5'-agttggtacgtttgtcgtgc-3'，(seq id no：5)反向引物5'-rtrtcytcttcytgcgtgga-3'；(seq id no：6)甘薯g病毒特异性引物对：正向引物5'-acaggaaacacaggaagg-3'，(seq id no：7)反向引物5'-rtrtcytcttcytgcgtgga-3'(seq id no：8)。2.根据权利要求1所述的甘薯病毒特异性引物对，其特征在于，所述甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒、甘薯g病毒的特异性引物对经rt-pcr扩增后目的产物大小分别为212bp、422bp、624bp、968bp。3.权利要求1所述的甘薯病毒特异性引物对在检测甘薯病毒中的应用。4.一种甘薯病毒的一步法多重rt-pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒四种病毒的外壳蛋白基因核苷酸序列，分别设计并合成上述四种甘薯病毒的特异性引物对，然后利用甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒四对特异性引物对甘薯叶片中的甘薯潜隐病毒、甘薯c病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯g病毒进行一步法多重rt-pcr反应，将反应产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析及测序比对。5.根据权利要求4所述的甘薯病毒的一步法多重rt-pcr检测方法，其特征在于，所述一步法多重rt-pcr反应的反应体系如下：反应体系：上游引物为splv正向引物0.6μl，spvc正向引物0.6μl，spfmv正向引物0.6μl和spvg正向引物0.8μl；下游引物为splv反向引物0.6μl，spvc反向引物0.6μl，spfmv反向引物0.6μl和spvg反向引物0.8μl；2x starscriptⅲone-step rt buffer(dye)10μl；starscriptⅲone-step rt enzyme mix 1.0μl；以及分别感染spfmv、splv、spvc和spvg四种甘薯病毒的等量混合模板补至20μl。6.根据权利要求5所述的甘薯病毒的一步法多重rt-pcr检测方法，其特征在于，每所述引物对中的正向引物和反向引物的浓度均相等，splv、spvc、spfmv正向引物的浓度均为0.3μmol/l，spvg正向引物的浓度为0.4μmol/l；所述引物的浓度均是以反应体系的总体积20μl为基准。7.根据权利要求4所述的甘薯病毒的一步法多重rt-pcr检测方法，其特征在于，所述一步法多重rt-pcr反应的反应程序如下：反应程序：50℃反转录15min；94℃预变性2min；94℃变性15s；56℃退火15s；72℃延伸2min；72℃终延伸10min；循环数设置为30个循环。

技术总结
本发明公开了甘薯病毒特异性引物对及其应用、甘薯病毒一步法多重RT-PCR检测方法，属于甘薯病毒检测技术领域。本发明对马铃薯Y病毒属的甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯G病毒和甘薯C病毒四种甘薯病毒的外壳蛋白基因进行比对，设计并筛选出四对用于检测这四种甘薯病毒的特异性引物，结合一步法RT-PCR检测方法通过对其反应条件的优化建立能同时检测四种甘薯病毒的一步法多重RT-PCR检测方法。有益效果：通过对本发明所建立的检测方法的灵敏度、稳定性及实用性分析，得出本发明所建立的检测方法能同时高效、灵敏的检测甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯G病毒和甘薯C病毒且极大的降低了检测的成本。极大的降低了检测的成本。极大的降低了检测的成本。


技术研发人员：汪章勋 李晓彤 李淼 檀根甲
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/13