玉米耐旱基因位点的开发方法及应用

1.本发明涉及基因组序列及植物生物技术领域，具体涉及玉米耐旱基因位点的开发及应用。


背景技术：

2.玉米(zea mays l.)是世界最重要作物之一，用途广泛，可用作粮食、饲料和工业原料，因此玉米的稳产增产对我国农业经济发展至关重要。干旱严重限制了玉米的生产，挖掘耐旱基因，选育高耐旱性的玉米品种，对玉米稳产增产有重要意义。通过常规选育方法进行玉米耐旱品种选育，受田间条件影响较大，表型筛选准确性低。通过分子标记辅助选择技术精准的鉴定耐旱基因型，定向选育耐旱品种是提高玉米育种效率的有效途径。
3.围绕玉米耐旱性，研究人员已经挖掘了多个qtls(柳思思.玉米耐旱功能标记开发及优异单倍型应用[d].新疆农业大学,2012.)，但由于很多qtls效应值较低，且多为ssr标记、caps标记或indel标记，在实际育种应用中准确性和检测效率较低。以snp位点为基础的kasp标记可以实现高通量自动化检测，无需琼脂糖电泳，受到广大育种、研究机构的青睐。同时，开发新的玉米耐旱基因位点既为深入研究耐旱机理提供理论基础，又为耐旱品种高效精准选育提供了技术支撑。


技术实现要素：

[0004]
本发明要解决的技术问题是通过开发新的玉米耐旱基因位点及其snp分子标记提高玉米耐旱品种选育效率，针对上述背景技术所提及的技术问题，而采用以下技术方案来实现：
[0005]
玉米耐旱基因位点的开发，其主要步骤如下：
[0006]
玉米不同材料的耐旱性鉴定，杂交群体制备，通过集群分离分析测序法对亲本和群体进行基因位点连锁性分析，，基因位点的分子标记开发与应用。所述连锁位点包含zmredrosnp0201492位点和zmredrosnp1038761位点。所述连锁位点包含zmredrosnp0201492位点和zmredrosnp1038761位点。zmredrosnp0201492位点是玉米基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为a或t，为序列表中seq id no.1的第71位核苷酸；zmredrosnp1038761位点是玉米基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为g或c，为序列表中seq id no.2的第71位核苷酸。
[0007]
作为优选实例，当所述zmredrosnp0201492位点基因型为a/a和zmredrosnp1038761位点的基因型为g/g时，玉米为耐旱或者候选为耐旱，其中，所述t/t基因型表示玉米基因组中所述zmredrosnp0201492位点的核苷酸种类为t的纯合型；所述c/c基因型表示玉米基因组中所述zmredrosnp1038761位点的核苷酸种类为c的纯合型。
[0008]
一种玉米耐旱基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的snp分子标记开发的产品。
[0009]
作为优选实例，所述产品包含以下物质，
[0010]
i、所述检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点在内的玉米基因组dna片段的pcr引物；
[0011]
ii、所述检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质为含有所述pcr引物的pcr试剂；
[0012]
iii、含有i所述pcr引物或ii所述pcr试剂的试剂盒。
[0013]
作为优选实例，pcr引物主要包括以下几个方面：
[0014]
i、所述zmredrosnp0201492的pcr引物为由核苷酸序列是序列表中seq id no.3的第22-40位单链dna、核苷酸序列是序列表中seq id no.4的第22-40位单链dna和核苷酸序列是序列表中seq id no.5的单链dna组成的引物组；
[0015]
ii、所述zmredrosnp1038761的pcr引物为由核苷酸序列是序列表中seq id no.6的第22-38位单链dna、核苷酸序列是序列表中seq id no.7的第22-38位单链dna和核苷酸序列是序列表中seq id no.8的单链dna组成的引物组。
[0016]
玉米耐旱基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的snp分子标记开发的产品而提出的应用，主要包括以下几项：
[0017]
i、应用在检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米耐旱中；
[0018]
ii、应用在检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定耐旱玉米产品中；
[0019]
iii、应用在检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质在选育耐旱玉米资源中。
[0020]
采用上述技术方案所产生的技术效果在于：本发明开发了2个新的玉米耐旱基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761，并开发出相应的snp分子标记进行基因快速分型检测，可应用于耐旱玉米育种工作中；上述位点的表型选择效率较高，可高效精准的鉴定玉米的耐旱基因；同时检测过程操作简单、高效安全，无气溶胶污染以及溴化乙锭等有毒物的使用，可在材料生长苗期进行定向基因型选择，淘汰大量无耐性材料，降低育种成本，提高玉米耐旱品种选育效率。
附图说明
[0021]
图1.集群分离分析法关联分析位点图；
[0022]
图2.两个位点的引物分型图，a)为zmredrosnp0201492引物，b)为zmredrosnp1038761引物；
[0023]
图3.位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的测序结果比对图，a)为zmredrosnp0201492位点序列，b)为zmredrosnp1038761位点序列；
[0024]
图4.zh88n41_f2群体的分子标记分型图，a)为zmredrosnp0201492位点，b)为zmredrosnp1038761位点；
具体实施方式
[0025]
为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具
体实施例，进一步阐述本发明。
[0026]
实施例一
[0027]
不同耐旱性玉米材料的鉴定和集群分离分析群体的制备
[0028]
为了获取不同耐旱性的玉米材料，首先对收集的8份玉米品种材料进行实验室栽培和干旱胁迫。采用盆栽的方式，每个品种种植30株，每盆一株，常规栽培和管理，种植工作在温室试验基地开展。待生长两周后，对上述玉米品种材料的幼苗进行耐旱胁迫表型鉴定，耐旱胁迫方法如下：对照组3天浇一次水，干旱胁迫组7天浇一次水，每个品种设置对照10株，胁迫20株，胁迫4周后进行脯氨酸含量测定。脯氨酸含量测定采用水合茚三酮法，具体方法如下：取叶片用液氮研磨成粉，取0.2g至2ml离心管中，加入1.5ml3％的磺基水杨酸溶液，充分混匀。12000rpm离心10min，然后取上清1ml至新的离心管中，加入1ml冰醋酸和1ml 2.5％酸性茚三酮试剂，沸水加热1h。待室温冷却后，加入2ml甲苯，混匀30s后静置5min。取上层脯氨酸红色甲苯溶液至比色皿中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度值，通过标曲查询该吸光度值的脯氨酸含量c。以脯氨酸含量c作为玉米耐旱性的指标，将标准定位：胁迫后脯氨酸含量c≥6ug的材料为高耐旱玉米，6＞c≥3ug的材料为中耐旱玉米，c＜3ug的材料为低耐旱玉米。8份测试材料的耐旱表型鉴定结果见表1。
[0029]
表1.8份测试玉米品种的耐旱性数据
[0030][0031]
注：t为高耐旱，m为中耐旱，s为低耐旱。
[0032]
为制备集群分离分析群体，以耐旱性高的丹599为父本，以耐旱性低的辽2345为母本进行杂交，获得一个包含388个单株的杂交群体，连续自交获得f2代集群分离分析定位群体。种植与杂交工作在田间试验基地开展，常规栽培和管理。
[0033]
实施例2
[0034]
通过集群分离分析测序法对亲本和群体进行基因位点连锁性分析，及基因位点的分子标记开发
[0035]
为获得与玉米耐旱基因紧密连锁的位点，对上述分离群体进行温室种植和耐旱表型鉴定，种植工作在温室试验基地开展，耐旱性表型鉴定方法参照实施例1。然后通过集群分离分析测序法对亲本和群体进行基因位点连锁性分析，实验方案如下：选取群体中30株高耐旱单株形成耐旱群体池，选取30株低耐旱单株形成低耐旱群体池，再取两亲本各30个单株分别形成高耐旱亲本池和低耐旱亲本池。实验室通过常规ctab法提取上述玉米高耐旱亲本池、低耐旱亲本池、高耐旱群体池、低耐旱群体池的dna。dna提取方法如下：
①
取新鲜叶片100mg，液氮研磨至粉末状，转移至2ml离心管中；
②
加入1ml的2
×
ctab裂解液，65℃裂解30min；
③
加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，混匀10min，12000rpm离心10min，取上清至新离心管；
④
加入等体积异丙醇，沉淀10min，12000rpm离心10min，弃上清；
⑤
加入1ml的75％乙醇，混匀2min，12000rpm离心10min，弃上清；
⑥
加入200μlddh2o，56℃洗脱10min，保存至-20℃。
[0036]
二代测序工作委托华大基因生物科技(深圳)有限公司完成，测序完成后通过计算机服务器进行二代测序数据的snp位点挖掘和与耐旱性连锁的基因集群分离分析。分析方法如下：利用fastq软件进行测序数据质控，然后通过bwa、samtools、vcftools和gatk软件对质控后的测序数据进行比对和snps分析，最后通过qtlseqr软件对玉米高耐旱亲本池、低耐旱亲本池、高耐旱群体池、低耐旱群体池的snps数据进行集群分离分析，挖掘与耐旱性连锁的基因位点。
[0037]
经耐旱性胁迫分析，388个群体单株中，61株为高耐旱单株，244株为中耐旱单株，83株为不耐旱单株。利用spss软件对抗病表型数据进行统计分析，表型数据符合正态分布，表明该抗病性状是典型的qtl性状。通过qtlseqr软件对四个混池的基因型数据进行集群分离分析基因定位，使用gprime模型分析，设置q＝0.01筛选出2个显著性区间，对区间内的位点进行基因注释，初步确定位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761与耐旱性相关(图1)，具备用于玉米耐旱基因检测的可能性。
[0038]
为更好地应用基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761进行玉米耐旱材料选育，对该位点分子标记进行优化。方法如下：从ncbi数据库(reference genome zm-丹599-reference-nam-5.0)下载zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761基因位点的侧翼序列，并利用oligo7.2软件设计引物，利用kasp平台检测(图2)。所述用于检测玉米耐旱基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的snp标记引物具体见序列3-8。snp标记检测方法如下：选择qpcr检测平台，反应体系为5μl，分别为样本gdna(浓度30ng/μl)1μl，引物混合液0.5μl，2
×
kasp mix 2.5μl，补充ddh2o至5μl体系。其中，2
×
kasp mix由vic荧光探针、fam荧光探针、vic荧光淬灭探针、fam荧光淬灭探针，以及taq酶，dntp，mg
2+
等pcr主要组分组成，vic荧光探针的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’，5’末端连接一个vic荧光基团；fam荧光探针的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’，其5’端连接一个fam荧光基团；vic荧光淬灭探针的核苷酸序列为：5
’‑
aatccgttgactccgaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq；fam荧光淬灭探针的核苷酸序列为：5
’‑
agcatgaacttggtcaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq。扩增程序是95℃加热10min，1个循环；95℃加热30s，56℃退火30s，设置45个循环。以上反应体系为本发明推荐反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0039]
注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。
[0040]
为确认核酸组合物的特异性，将pcr的扩增产物进行克隆测序，克隆测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行。将测序结果与玉米参考基因组(reference genome zm-丹599-reference-nam-5.0)对比(图3)，对比结果显示两个引物探针组合的扩增产物确实为玉米位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的片段，符合预期。
[0041]
实施例3
[0042]
基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的snp分子标记在玉米耐旱植株选育中的应用
[0043]
为了检测本发明zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的实用性，利用高耐旱材料丹599与低耐旱材料中黄64杂交获得f1群体，通过连续自交分离产生f2分离群体67株。对分离群体进行基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的snp标记检测
和耐旱性表型鉴定(表2，图4)，耐旱性表型验证实施方法参考实施例1，kasp检测方法如下，
[0044]
对抗病鉴定表型数据与基因型数据进行一致性分析，zmredrosnp0201492位点基因型为t/t的有15株，其中接种鉴定结果为高耐旱的单株为11株，筛选效率为73.3％；zmredrosnp1038761位点基因型为c/c的有13株，其中接种鉴定结果为高耐旱的单株为11株，筛选效率为84.6％；zmredrosnp0201492位点基因型为t/t并且zmredrosnp1038761位点基因型为c/c的有12株，其中接种鉴定结果为高耐旱的单株为11株，筛选效率为91.7％。结果表明，同时使用位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761进行耐旱单株筛选的效率远高于单个位点，同时也表明基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761在玉米耐旱植株筛选中具有较高的实用性。
[0045]
表2.群体的耐旱表型数据与基因型信息
[0046]
[0047]
[0048][0049]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
[0050]
序列表
[0051]
序列1
[0052]
attgatggaactatagcctatatgctaattatgttgatgtcgctaaattcgaccttttgaatgagaaacawgaaactttagtctttagcaaacatcgcaagtgagaagcacccatccctgatgcaacttcgaaataaaga
[0053]
序列2
[0054]
agtgtgaacctttggcacctgtataacttatacactagagcaaactagttagtccaattatatgtgttggscaattcaaccaccaaaattaattagggactaggtgtaagcctaattccctttcaatctccccctttttggtgattgatgc
[0055]
序列3
[0056]5’‑
gaaggtcggagtcaacggattccttttgaatgagaaacaa-3’[0057]
序列4
[0058]5’‑
gaaggtgaccaagttcatgctccttttgaatgagaaacat-3’[0059]
序列5
[0060]5’‑
tttgctaaagactaaagt-3’[0061]
序列6
[0062]5’‑
gaaggtcggagtcaacggattcaattatatgtgttggg-3’[0063]
序列7
[0064]5’‑
gaaggtgaccaagttcatgctcaattatatgtgttggc-3’[0065]
序列8
[0066]
5'-ctaattaattttggtggttga-3'

技术特征：
1.一种玉米耐旱基因snp位点开发方法，其特征在于，其主要步骤如下：玉米不同材料的耐旱性鉴定，杂交群体制备，通过集群分离分析测序法对亲本和群体进行基因位点连锁性分析，基因位点的分子标记开发与应用；所述基因位点包含zmredrosnp0201492位点和zmredrosnp1038761位点，zmredrosnp0201492位点是玉米基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为a或t，为序列表中seq id no.1的第71位核苷酸；zmredrosnp1038761位点是玉米基因组中的一个snp位点，其核苷酸种类为g或c，为序列表中seq id no.2的第71位核苷酸。2.根据权利要求1所述的玉米耐旱基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的snp分子标记开发方法，其特征在于，当所述zmredrosnp0201492位点基因型为t/t和zmredrosnp1038761位点的基因型为c/c时，玉米为耐旱或者候选为耐旱，其中，所述t/t基因型表示玉米基因组中所述zmredrosnp0201492位点的核苷酸种类为t的纯合型；所述c/c基因型表示玉米基因组中所述zmredrosnp1038761位点的核苷酸种类为c的纯合型。3.根据权利要求2所述的玉米耐旱基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的snp分子标记开发的产品，其特征在于，所述产品包含以下物质，i、所述检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点在内的玉米基因组dna片段的pcr引物；ii、所述检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质为含有所述pcr引物的pcr试剂；iii、含有i所述pcr引物或ii所述pcr试剂的试剂盒。4.根据权利要求3所述的玉米耐旱基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的snp分子标记开发的产品所提出的物质，其特征在于，包括以下几个方面：i、所述zmredrosnp0201492的pcr引物为由核苷酸序列是序列表中seq id no.3的第22-40位单链dna、核苷酸序列是序列表中seq id no.4的第22-40位单链dna和核苷酸序列是序列表中seq id no.5的单链dna组成的引物组；ii、所述zmredrosnp1038761的pcr引物为由核苷酸序列是序列表中seq id no.6的第22-38位单链dna、核苷酸序列是序列表中seq id no.7的第22-38位单链dna和核苷酸序列是序列表中seq id no.8的单链dna组成的引物组。5.根据权利要求4所述的玉米耐旱基因位点zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761的snp分子标记开发的产品而提出的应用，其特征在于，主要包括以下几项：i、应用在检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米耐旱中；ii、应用在检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定耐旱玉米材料中；iii、应用在检测玉米基因组中zmredrosnp0201492和zmredrosnp1038761位点的多态性或基因型的物质在选育耐旱玉米材料中。

技术总结
本发明公开了一种玉米耐旱基因位点的开发方法及应用，属于基因组序列及植物生物技术领域。它包括检测待测玉米的基因型，根据基因型结果鉴定或辅助鉴定耐旱；ZmReDroSNP0201492位点是玉米基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为A或T，为序列表中SEQ ID No.1的第71位核苷酸；ZmReDroSNP1038761位点是玉米基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为G或C，为序列表中SEQ ID No.2的第71位核苷酸。本发明开发了新的玉米耐旱基因位点，并利用KASP分型技术对耐旱基因位点进行快速基因分型，可用于玉米分子标记辅助育种。分子标记辅助玉米进行耐旱性选育，选择效率高、周期短，可在苗期进行定向基因型选择，淘汰大量不耐旱的材料，降低育种成本，提高育种效率。提高育种效率。


技术研发人员：徐扬 于广宁 周恺 张宇翔 李成 杨文艳 徐一亿 李芙蓉 关秀生 陈茹佳 鲁月 李鹏程 杨泽峰 徐辰武
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/8/13