牛促卵泡激素及其稳定表达制备的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，涉及基因工程技术和动物繁殖技术，尤其涉及一种制备牛促卵泡素的方法，具体涉及一种稳定表达制备牛促卵泡激素的方法。


背景技术：

2.随着社会的发展和人们生活水平的提高，对牛奶和牛肉的需求处于与日俱增的状态，而且对于高品质和牛的需求也是持续增加。
3.牛胚胎工程是指以胚胎移植为基础的一整套胚胎生物技术，包括牛的超数排卵、胚胎采集、胚胎冷冻、胚胎分割、体外受精、胚胎克隆等。有利于优良母牛繁殖潜力的充分发挥，为优良种畜的大量繁殖提供有效的解决办法。牛胚胎工程的商业化应用开始于20世纪70年代，已经有50余年历史，加之近10年来性控冻精、基因组检测技术的快速发展，奶牛的胚胎良种快繁已经越发普及，甚至已经成为国际、国内优质奶牛繁育牧场高效发展的风向标。以美国为例，在过去的五年时间里，牛体外胚胎移植在美国增长了145％。借助胚胎工程可以有效提高后代生产群的生产性能，但受促卵泡激素的限制，其应用受到影响。
4.促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，亦称为促卵泡素，本领域通常也简称为fsh)是动物垂体前叶分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，其主要作用为促进卵泡成熟，促进卵泡颗粒层细胞增生分化，并促进整个卵巢长大。促卵泡激素可以促进母牛子宫内膜、卵巢和卵泡的生长；促进雌激素的合成与分泌；诱导公牛曲细精管的发育和维持精子生成。牛促卵泡激素由2个不同亚基组成，α亚基由120个氨基酸组成，与其他三种促性腺激素的α亚基相同；牛促卵泡激素的β亚基是由109个氨基酸组成，其决定特有的生物活性。促卵泡激素在动物繁殖领域中常用于同期发情、超数排卵、胚胎移植、母畜卵巢疾病的治疗。目前牛胚胎移植最常用的是猪脑垂体提取的促卵泡激素，但是由于猪脑垂体数量及提取工艺的限制，目前市面可用促卵泡激素根本不足以满足日益增长的需求。因此，采用基因工程技术手段，体外生物合成促卵泡激素具有重要的实践意义和经济价值。
5.中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cells，cho细胞)是目前动物细胞表达系统中最具代表性的细胞之一，也是用来表达外源目的蛋白最多也最成功的一类细胞，是一种目前实验室常用的贴壁细胞系。1957年，puck tt从成年中国仓鼠卵巢的活检组织建立了cho细胞，并广泛用于生物制品的表达。cho细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选细胞系之一，与其他表达系统相比，细胞具有如下优点：驯化后可悬浮培养，且表达水平较高，可以用于大规模生产；准确的转录后修饰功能，使其表达的糖基化蛋白在分子结构、理化性质及生物学功能方面更接近于天然蛋白分子；具有重组基因的高效扩增和表达能力；属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，有利于外源目的产物的分泌；产物胞外分泌，便于下游产物分离纯化。珠海恺瑞公司的cho-k1细胞株是驯化用于稳转的细胞株，其最大优势为生长状态稳定，存活率高，且最接近原始cho细胞的状态。
6.piggybac转座子载体系统属于ii类转座子，通过“剪切-粘贴”机制移动，即从基因组一个位置转座到另一个位置，不留下序列本身与i类启动子通过“复制-粘贴”的移动方式
不同)。piggybac载体系统成员主要有：一个辅助质粒：编码转座酶；一个转座子质粒：含优化的两端亚末端反向重复序列，中间是被转座区域，可插入我们想转座到宿主基因组中的目的基因序列。piggybac(pb)转座子来源于鳞翅目昆虫，最初是在研究杆状病毒(baculovirus)侵袭粉纹夜蛾细胞系tn-368时首次发现并分离到的。在分类上属于真核生物的第二类转座子，是一个自主因子，长2476bp，有短的末端反向重复序列(itr)和一个开放编码框(orf)，itr长13bp，orf长2.1kb。pb转座子主要采取“cut-paste”机制发生转座。pb系统转座效率高，宿主范围广，广泛应用于昆虫等低等生物的基因转移及突变筛选。利用pb转座子构成的载体-辅助质粒系统已成功地获得了转基因地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕。pb转座子具有广泛的转座活性，较少地依赖于宿主因子即可实现高效转座。近年来，研究发现pb系统在哺乳动物及其细胞中也具有高效的转座活性，已在动物基因组功能研究、基因转移及诱导多能干细胞等领域得到了广泛应用。pb两端各有一个13bp和19bp的反向末端重复序列(inverted terminal repeat，itr)，中间编码一个长594个氨基酸残基的转座酶。根据转座酶的转录方向来区分转座子的两个末端，两端最外侧各有长13bp并且对称的itr，内侧各有一段间隔区(spacer)，但并不对称(左端长3bp，右端长31bp)，再靠内侧是各长19bp且对称的亚末端反向重复序列(subterminal inverted repeat，str)。反向重复序列的5'有2～3个c碱基，对应3'端的g碱基在选择剪切位点过程中均起作用。左侧ltr只有长于311bp，并且右侧ltr长于235bp的pb转座子才具有转座活性。转座子左右两个末端组合研究表明仅有“左+右”及“右+左”具有转座活性，前者转座活性为后者的4.6倍，昆虫中具有启动子作用的左末端重复序列在哺乳动物中也具有类似功能。还有研究发现pb转座子的右末端重复序列具有增强子功能。对pb转座酶的268、346、447及450位置的天冬氨酸进行定点突变研究表明，四个天冬氨酸均是pb转座剪切所必需的，但是450位置的天冬氨酸突变对转座酶的活性影响较小。cadinanos和bradley对pb转座酶进行鼠源密码子优化，转座活性提高了近10倍，还通过转座酶与雌激素应答原件(ert2)融合实现了对pb转座事件的可控性。转座时转座酶通过与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，转座子完全切离后，通过其3'oh末端攻击靶dna序列中ttaa位点的5'末端，转座子5'序列的ttaa悬垂与靶dna打开的单链ttaa相配对，与整合位置两侧的空隙重新连接，连接过程不需要合成dna。pb转座酶的这种转座方式表明，虽然它与dde(两个天冬氨酸和一个谷氨酸组成的具有转座酶活性的区域)重组酶家族没有序列同源性，但是类似的转座机制仍表明它是该家族中的一员。piggybac转座子载体系统的优点在于：安全性高、操作方便(可直接用质粒转化细胞)；载体容量大(10kb-20kb)，可实现多基因的共表达；可通过调节转座子质粒和辅助质粒的比例，提高外源基因的整合效率，并且可通过反向pcr精确确定目的基因插入的位置；转座后不引起染色体重排等不稳定现象；再次转座后实现精确切离；宿主范围广，转座效率高，较少依赖宿主因子。
7.本发明以牛促卵泡激素核苷酸序列作为理论基础，通过串联表达和融合表达的设计，采用稳定表达的方式，利用cho细胞生产牛促卵泡激素，获得较高的产量并具有较好活性。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种牛促卵泡激素的核苷酸序列，串联表达和融合表达及密码子优化设计，piggybac转座子载体系统的重组表达载体、cho-k1细胞株及重组牛促卵泡
激素的制备方法。
9.更具体地，本发明提供以下各项：
10.1、一种牛促卵泡激素核苷酸序列，其包含一个基因，该基因可以编码与含有α亚单位(或称α亚基)和β亚单位(或称β亚基)的天然牛促卵泡激素相同的蛋白序列，α亚基的基因序列如seq id no.1所示，β亚基的基因序列如seq id no.2所示。
11.seq id no.1：atggattactacagaaaatatgcagctgtcattctgaccattttgtctctgtttctgcaaattctccattcctttcctgatggagagt ttacaatgcagggctgtcctgaatgcaagctaaaagaaaacaaatacttctccaagccagatgctgcaatctatcagtgcatggggtgctgcttctccagggca taccccactccagcgaggtctaagaagacaatgttggtccccaagaacatcacctcggaagctacatgctgtgtggccaaagcatttaccaaggccacagtg atgggaaatgtcagagtggagaaccacaccgagtgccactgcagcacttgttattatcacaaatcctaa。
12.seq id no.2：atgaagtctgtccagttctgtttccttttctgttgctggagagcaatctgctgcagaagctgcgagctgaccaacatcaccatc acggtggagaaagaggaatgtggcttctgcataagcatcaacaccacgtggtgtgcaggctactgctacacccgggacttggtgtacagggacccagcaaggcccaatatccagaaaacgtgtaccttcaaggagctggtctacgagacggtgaaagtgcctggctgtgctcaccatgcagactccctgtacacgtacccagtagccactgaatgtcactgcagcaagtgcgacagcgacagcactgactgcaccgtgagaggcctggggcccagctactgctccttcagggaaatcaaagaataa。
13.2、一种牛促卵泡激素的蛋白序列，其为串联表达方式，并带有自剪切2肽-p2a(其序列为gsgatnfsllkqagdveenpgp)。
14.3、一种牛促卵泡激素的蛋白序列，其为融合表达方式，并带有linker序列(其序列为ggggsggggsggggsggggs)。
15.4、一种稳定表达载体，其为piggybac转座子载体系统，其特征在于，所用的启动子和终止子分别为：cmv和sv40 poly(a)。
16.5、根据上述稳定表达载体，其所用细胞株为cho-k1(其可借由商业途径例如由珠海恺瑞公司驯化所得，该细胞株状态稳定，最接近原始菌株，常被用于稳定表达)。
17.6、一种制备牛促卵泡激素的方法，包含以下步骤：
18.提供牛促卵泡激素核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；
19.将该核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，进行合成(其可借由商业途径合成)；
20.从插入重组质粒的甘油菌中提取质粒，使用电转仪(例如thermo公司的)将提取的质粒转入cho-k1细胞株中；
21.单克隆筛选，显微镜下荧光观察并大规模培养，从培养液中纯化促卵泡激素蛋白，得到促卵泡激素(该促卵泡激素可使用western blot验证，纯化的促卵泡激素蛋白可以进行细胞水平上的活性测定，例如测定促卵泡激素诱导kgn细胞产生孕酮的量)。
22.7、制备牛促卵泡激素的方法，包含以下步骤：
23.(1)获得pb+β+p2a+α和pb+β+l+α载体；
24.(2)质粒提取；
25.(3)pb+β+p2a+α和pb+β+l+α电转化入cho-k1细胞；
26.(4)cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞的单克隆筛选；
27.(5)镍柱纯化。
28.8、制备牛促卵泡激素的方法，其中步骤(1)获得pb+β+p2a+α和pb+β+l+α载体是照如下方式进行的：提供牛促卵泡激素核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；将核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，合成得到包括pb-cmv-mcs-ef1α-greenpuro、β亚基、p2a肽和α亚基的串联表达重组载体即重组质粒pb+β+p2a+α，以及包括pb-cmv-mcs-ef1α-greenpuro、β亚基、linker和α亚基的融合表达重组载体即重组质粒pb+β+l+α，以及得到插入该等重组质粒的甘油菌；
29.9、制备牛促卵泡激素的方法，其中步骤(2)质粒提取使用无内毒素质粒大量提取试剂盒(例如采用endo-free plasmid maxi kit试剂盒)进行质粒提取并测定浓度，具体是照如下方式进行的：
30.2.1)将插入了重组质粒的甘油菌培养所得(例如200ml)过夜培养菌液转移至(例如250ml的)离心杯中，离心(例如4000
×
g室温离心10min)，倒掉培养基(通过倒置于纸上以彻底流干培养基)；
31.2.2)加入solution i/rnasea，涡旋或移液器上下吹打重悬菌体；
32.2.3)加10ml solution ii，轻柔地来回颠倒(例如8-10次)获得澄清的裂解液；室温孵育(例如，2-3min，过程中偶尔混匀一次)；
33.2.4)加入(例如5ml)冰buffer n3，轻轻颠倒充分混匀几次直至白色絮状沉淀出现；室温放置(例如，2-3min，期间偶尔颠倒混匀，以使其充分反应)；
34.2.5)于4℃离心(例如4000
×
g离心10min)，将上清转移到注射器中，过滤至新的(例如50ml)离心管中，测定所得裂解液的体积；
35.2.6)加入0.1倍体积的etr溶液，上下反复颠倒(例如10次)；
36.2.7)冰浴(例如10min)，期间将试管上下翻转多次(加入etr溶液之后，裂解液应变浑浊，当放冰上后，变澄清)；
37.2.8)于42℃孵育裂解(例如5min)，应再次变浑浊；
38.2.9)于25℃离心(例如4000
×
g离心5min)，etr溶液在管底形成蓝色层；
39.2.10)转移顶部水相(即清澈的裂解液)到一个新的(例如50ml)离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，颠倒6-7次，得到澄清裂解液；
40.2.11)插入一个结合柱(例如hibind dna maxi结合柱)到一个(例如50ml)离心管中，加入(例如3ml)gps buffer到结合柱中，室温放置(例如4min)，离心(例如，4000
×
g离心3min)，丢弃废液；
41.2.12)转移(步骤2.10)得到的)澄清裂解液(例如20ml)到步骤2.11)处理的结合柱中，4000
×
g离心3min，弃滤液并重复使用收集管；
42.2.13)重复2.10-2.12步骤直至所有的澄清裂解液全部转移到结合柱中；
43.2.14)向结合柱中加入(例如10ml)hbc buffer，离心(例如，4000
×
g离心3min)，弃滤液并重复使用收集管；
44.2.15)加入(例如15ml)dna wash buffer，离心(例如，4000
×
g离心3min)，弃滤液并重复使用收集管；
45.2.16)加入(例如10ml)dna wash buffer，离心(例如，4000
×
g离心3min)，弃滤液
并重复使用收集管；
46.2.17)将空的结合柱离心(例如，4000
×
g离心10min)使色谱柱干燥；
47.2.18)将柱转移至一个新的(例如50ml的，无核酸酶的)离心管中；
48.2.19)加入1-3ml endo-free elution buffer(70℃预热)于柱中心，室温放置5min，离心(例如，4000
×
g离心5min)得上清，即为提取的质粒，置于-20℃保存。
49.10、制备牛促卵泡激素的方法，其中步骤(3)pb+β+p2a+α和pb+β+l+α电转化入cho-k1细胞是使用电转化试剂盒(例如neon
tm transfection system 10μl kit)按照如下操作处理的：
50.3.1)准备cho-k1细胞：将cho-k1细胞置于5％的co2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，使用处于指数生长期(密度约为2
×
106个/ml)，且存活率大于97％的细胞进行转化；
51.3.2)待细胞生长至密度为2
×
106个/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液(例如10ml)于离心管中(使其终密度为2
×
107个/ml)，1000rpm离心5min，弃上清；
52.3.3)加入(例如1ml)pbs溶液，重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清；
53.3.4)使用电转化试剂盒中的r buffer重悬细胞；
54.3.5)电转体系：9μl细胞(密度为2
×
107个/ml)，0.6μl的pb+β+p2a+α质粒，转座酶质粒0.4μl；9μl细胞(密度为2
×
107个/ml)，0.6μl的pb+β+l+α质粒，转座酶质粒0.4μl；
55.3.6)电转条件：1620v，10ms，3pulse；
56.3.7)在24孔板中加入1ml新鲜kdcho培养液，进行培养，并在24h时添加5μg/ml的嘌呤霉素，进行筛选；
57.3.8)逐步提高嘌呤霉素的筛选浓度，最终达到8μg/ml，得到cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞，其用于后续的单克隆筛选。
58.11、制备牛促卵泡激素的方法，其中步骤(4)cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞的单克隆筛选是按照如下操作处理的：
59.4.1)取待单克隆的cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞各100μl，分别加入管中，混匀；按梯度稀释的方法稀释(10倍梯度)，稀释两次；利用aopi双染试剂检测细胞数量，并进行稀释，终浓度为100个/10ml。
60.4.2)吸取100μl上述细胞稀释液，置于96孔板中。
61.4.3)保持3天不动，第4天每孔补加100μl的kd-clone；
62.4.4)一周之后观察，圈出长势较好的孔且显微镜下可看到明显的绿色荧光，即可在第10天左右将其转移至一个新的24孔板中。
63.4.5)待24孔板中细胞长满后转移一部分至新的6孔板，并添加kdcho-cd3培养基，于荧光显微镜下观察并拍照，成功表达的细胞呈现绿色荧光，未成功表达的细胞不显示荧光，由此可以得到cho-k1(pb+β+p2a+α)单克隆和cho-k1(pb+β+l+α)单克隆细胞及其表达上清。
64.12、制备牛促卵泡激素的方法，其中步骤(4)还进一步地将所得cho-k1(pb+β+p2a+α)单克隆和cho-k1(pb+β+l+α)单克隆按如下步骤进行无血清培养重组高蛋白表达：
65.4.6)将筛选得到成功表达的单克隆置于kdcho-cd3培养液中，按1x106cells/ml接种摇瓶培养(37℃，5％ co2)，每日计数；
66.4.7)待细胞密度达到5x106cells/ml之后开始补料，每天按照同样比例添加
cd3feed-k液和cd3feed-c液(例如，每毫升细胞培养液添加k液3.4μl和c液15μl)(例如，随cd3feed-k液和cd3feed-c液添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含0.6mg/ml丙酮酸钙和15mg/ml果糖的灭菌水溶液)；
67.4.8)待细胞密度超过1x107cells/ml，则需要同时额外补加葡萄糖，依照细胞密度每107cells/ml、每天、每升培养液补加1g葡萄糖；
68.4.9)待细胞密度达到1.5x107cells/ml时将培养移到32℃条件下继续进行培养15天后，分别收获cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞的表达了促卵泡激素蛋白的细胞表达上清；任选的，可以使用western blot法进一步验证这些表达上清中的促卵泡激素蛋白表达。
69.13、制备牛促卵泡激素的方法，其中步骤(5)镍柱纯化包括如下操作：
70.6.1)将镍柱(例如ni-nta his-tag purification agarose)从4℃温度处取出，置于架子上；
71.6.2)流干柱中的乙醇保存液，并加入20％的乙醇，流干；
72.6.3)加入足量的pbs，流干；重复一次；
73.6.4)加入待纯化的样本即细胞表达上清，流干；
74.6.5)加入足量的10mm的咪唑溶液，流干；
75.6.6)加入500mm的咪唑洗脱，并收集流出液；
76.6.7)加入足量的水清洗咪唑；
77.6.8)加入足量的20％的乙醇，流干，重复此操作，最终保留柱子1/3量的20％的乙醇，并将整个柱子存于4℃；
78.6.9)使用超滤离心管(10kd)4000
×
g离心60min，重复多次，直至浓缩液为500μl左右；
79.6.10)加入10ml pbs，4000
×
g离心60min，重复多次此步骤，直至咪唑无残留；
80.6.11)得到最终浓缩液为纯化的牛促卵泡激素蛋白(其可置于-80℃冰箱保存)。
81.如本发明上下文所详述的，本发明方法能够成功地通过串联表达方式或者融合表达方式获得牛促卵泡激素蛋白，并且所得牛促卵泡激素蛋白呈现令人期待的生物学活性。
82.以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
83.图1：串联表达重组片段的模式图，包括fshβ基因表达盒和fshα基因表达盒，其中包含一个p2a的切割肽，启动子为cmv，终止子为sv40 poly(a)。
84.图2：融合表达重组片段的模式图，包括fshβ基因表达盒和fshα基因表达盒，其中包含一个linker，启动子为cmv，终止子为sv40 poly(a)。
85.图3：稳定表达细胞单克隆荧光显微镜效果图，a：单克隆正常光，b：单克隆荧光。
86.图4：稳定表达细胞western blot结果图(1：cho细胞(pb+β+l+α)融合表达；2：cho细胞(pb+β+p2a+α)串联表达)。
87.图5：促卵泡激素在细胞水平上活性检测结果图。
具体实施方式
88.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
89.本发明以下实施例中，以牛促卵泡激素核苷酸序列作为理论基础，对其进行密码子优化，设计了串联表达和融合表达的方式，借由商业途径(如未另外说明，本发明具体实例中，委托南京金斯瑞生物有限公司)合成，得到pb+β+p2a+α和pb+β+l+α甘油菌株，质粒抽提后测定浓度，pb+β+p2a+α通过电转化方式导入cho-k1细胞中，实现串联表达；pb+β+l+α通过电转化方式导入cho-k1细胞中，实现融合表达；单克隆筛选和荧光验证；阳性克隆western blot验证；选取高产量阳性克隆，摇瓶发酵，镍柱纯化蛋白，并通过测定kgn细胞经促卵泡激素作用后的孕酮产量确定其在细胞水平上的活性。
90.实施例1：获得pb+β+p2a+α和pb+β+l+α载体
91.在本实施例中首先提供牛促卵泡激素核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；将该核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，进行合成；其中，
92.串联表达重组载体包括pb-cmv-mcs-ef1α-greenpuro、β亚基、p2a肽和α亚基，重组片段的组成如图1，获得的重组质粒命名为pb+β+p2a+α，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并寄送甘油菌。
93.融合表达重组载体包括pb-cmv-mcs-ef1α-greenpuro、β亚基、linker和α亚基，重组片段的组成如图2，获得的重组质粒命名为pb+β+l+α，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并寄送甘油菌。
94.如上所述，α亚基的基因序列和β亚基的基因序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示：
95.seq id no.1：atggattactacagaaaatatgcagctgtcattctgaccattttgtctctgtttctgcaaattctccattcctttcctgatggagagt ttacaatgcagggctgtcctgaatgcaagctaaaagaaaacaaatacttctccaagccagatgctgcaatctatcagtgcatggggtgctgcttctccagggcataccccactccagcgaggtctaagaagacaatgttggtccccaagaacatcacctcggaagctacatgctgtgtggccaaagcatttaccaaggccacagtgatgggaaatgtcagagtggagaaccacaccgagtgccactgcagcacttgttattatcacaaatcctaa
96.seq id no.2：atgaagtctgtccagttctgtttccttttctgttgctggagagcaatctgctgcagaagctgcgagctgaccaacatcaccatc acggtggagaaagaggaatgtggcttctgcataagcatcaacaccacgtggtgtgcaggctactgctacacccgggacttggtgtacagggacccagcaaggcccaatatccagaaaacgtgtaccttcaaggagctggtctacgagacggtgaaagtgcctggctgtgctcaccatgcagactccctgtacacgtacccagtagccactgaatgtcactgcagcaagtgcgacagcgacagcactgactgcaccgtgagaggcctggggcccagctactgctccttcagggaaatcaaagaataa
97.据此可以确定牛促卵泡激素核苷酸序列，其包含一个基因，该基因可以编码与含有α亚单位(或称α亚基)和β亚单位(或称β亚基)的天然牛促卵泡激素相同的蛋白序列。
98.实施例2：质粒提取
99.本实施例采用endo-free plasmid maxi kit试剂盒(omega品牌，货号d6926-03，为一种无内毒素质粒大量提取试剂盒)提取，并测定浓度。处理步骤参考该试剂盒的说明书
进行，具体为：
100.2.1)将实施例1之甘油菌培养所得200ml过夜培养菌液转移至一个250ml的离心杯中，4000
×
g室温离心10min，倒掉培养基(通过倒置于纸上以彻底流干培养基)。
101.2.2)加10ml的solution i/rnasea，涡旋或移液器上下吹打重悬菌体。
102.2.3)加10ml solution ii，轻柔地来回颠倒8-10次获得澄清的裂解液；室温孵育2-3min，过程中偶尔混匀一次。
103.2.4)加入5ml冰buffer n3，轻轻颠倒充分混匀几次直至白色絮状沉淀出现；室温放置2-3min，期间偶尔颠倒混匀，以使其充分反应。
104.2.5)于4℃、4000
×
g离心10min，将上清转移到一个注射器中，将上清过滤至新的50ml离心管中，测定所得裂解液的体积。
105.2.6)加入0.1倍体积的etr溶液，上下反复颠倒10次。
106.2.7)冰浴10min，期间将试管上下翻转多次(加入etr溶液之后，裂解液应变浑浊，当放冰上后，变澄清)。
107.2.8)于42℃孵育裂解5min，应再次变浑浊。
108.2.9)于25℃、4000
×
g离心5min，etr溶液应在管底形成蓝色层。
109.2.10)转移顶部水相(即清澈的裂解液)到一个新的50ml的离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，颠倒6-7次，得到澄清裂解液。
110.2.11)插入一个hibind dna maxi结合柱到一个50ml的离心管中(试剂盒提供的)，加入3ml gps buffer到hibind dna maxi结合柱中，室温放置4min，4000
×
g离心3min，丢弃废液。
111.2.12)转移20ml(2.10步骤得到的)澄清裂解液到hibind dna maxi柱中，4000
×
g离心3min，弃滤液并重复使用收集管。
112.2.13)重复2.10-2.12步骤直至所有的澄清裂解液全部转移到hibind dna maxi柱中。
113.2.14)向hibind dna maxi柱中加入10ml hbc buffer，4000
×
g离心3min，弃滤液并重复使用收集管。
114.2.15)加入15ml dna wash buffer，4000
×
g离心3min，弃滤液并重复使用收集管。
115.2.16)加入10ml dna wash buffer，4000
×
g离心3min，弃滤液并重复使用收集管。
116.2.17)将空hibind dna maxi柱4000
×
g离心10min使色谱柱干燥。
117.2.18)将柱转移至一个新的50ml(无核酸酶的)离心管中。
118.2.19)加入1-3ml endo-free elution buffer(70℃预热)于柱中心，室温放置5min，4000
×
g离心5min得上清，即为提取的质粒，置于-20℃保存。
119.实施例3：pb+β+p2a+α和pb+β+l+α电转化入cho-k1细胞
120.接续实施例2步骤2.19)进行本实施例。
121.本实施例使用电转化试剂盒(neon
tm transfection system 10μl kit，一种商业途径可得的转染系统，thermo品牌，货号mpk10025)并参照其说明书进行。
122.3.1)准备cho-k1细胞：将cho-k1细胞置于5％的co2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，使用处于指数生长期(密度约为2
×
106个/ml)，且存活率大于97％的细胞进行转化。
123.3.2)待细胞生长至密度为2
×
106个/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液(10ml)
于离心管中(使其终密度为2
×
107个/ml)，1000rpm离心5min，弃上清。
124.3.3)加入1ml pbs溶液，重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清。
125.3.4)使用电转化试剂盒中的r buffer重悬细胞。
126.3.5)电转体系：9μl细胞(密度为2
×
107个/ml)，0.6μl的pb+β+p2a+α质粒，转座酶质粒0.4μl；9μl细胞(密度为2
×
107个/ml)，0.6μl的pb+β+l+α质粒，转座酶质粒0.4μl；
127.3.6)电转条件：1620v，10ms，3pulse。
128.3.7)在24孔板中加入1ml新鲜kdcho培养液，进行培养，并在24h时添加5μg/ml的嘌呤霉素，进行筛选。
129.3.8)逐步提高嘌呤霉素的筛选浓度，最终达到8μg/ml，得到cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞，其用于后续的单克隆筛选。
130.实施例4：cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞的单克隆筛选。
131.接续实施例3步骤3.8)进行本实施例。
132.4.1)取待单克隆的cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞各100μl，分别加入管中，混匀；按梯度稀释的方法稀释(10倍梯度)，稀释两次。利用aopi双染试剂(品牌countstar，货号re010212)检测细胞数量，并进行稀释，终浓度为100个/10ml。
133.4.2)吸取100μl上述细胞稀释液，置于96孔板中。
134.4.3)保持3天不动，第4天每孔补加100μl的kd-clone(含it-plus，购自珠海恺瑞公司，货号k07001)。
135.4.4)一周之后观察，圈出长势较好的孔且显微镜下可看到明显的绿色荧光，即可在第10天左右将其转移至一个新的24孔板中。
136.4.5)待24孔板中细胞长满后转移一部分至新的6孔板，并添加kdcho-cd3培养基(购自珠海恺瑞公司)，于荧光显微镜下观察并拍照，成功表达的细胞呈现绿色荧光，未成功表达的细胞不显示荧光(典型的如图3所示)，由此可以得到2种成功表达细胞的表达上清。
137.这些成功表达的细胞单克隆，即cho-k1(pb+β+p2a+α)单克隆和cho-k1(pb+β+l+α)单克隆，可以进一步按如下步骤进行无血清培养重组高蛋白表达。
138.4.6)将筛选得到成功表达的单克隆置于kdcho-cd3培养液(珠海恺瑞，货号k03201-cd3)中，按1x106cells/ml接种摇瓶培养(37℃，5％ co2)，每日计数。
139.4.7)待细胞密度达到5x106cells/ml之后(约3天)开始补料，每天按照同样比例添加cd3feed-k液和cd3feed-c液(购自珠海恺瑞，货号分别为k40005k和k40005c，每毫升细胞培养液添加k液3.4μl和c液15μl)。
140.4.8)待细胞密度超过1x107cells/ml，则需要同时额外补加葡萄糖，依照细胞密度每107cells/ml、每天、每升培养液补加1g葡萄糖(或根据葡萄糖残留量进行补加)。
141.4.9)待细胞密度达到1.5x107cells/ml时将培养移到32℃条件下继续进行培养15天后(可以大幅延长细胞存活时间和蛋白质产量)，分别收获cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞的表达了促卵泡激素蛋白的细胞表达上清，可以使用western blot法进一步验证这些表达上清中的促卵泡激素蛋白表达。
142.实施例5：cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞表达的促卵泡激素蛋白western blot验证
143.使用western blot的常规操作进行，具体如下：
144.5.1)将实施例4步骤4.9)获得的cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞表达上清分别与loading buffer(6
×
)按照5:1的比例配置，并置于沸水中煮10min，而后3000rpm离心1min，置于4℃冰箱中备用。
145.5.2)配置12％的聚丙烯酰胺凝胶：按照配方加入适量的聚丙烯酰胺凝胶，10％ sds，分离胶缓冲液，混匀。加入适量的过硫酸铵和temed，轻轻搅拌(注：不要产生气泡)，将此液体缓缓地加入到模具中。在上面加大约1ml左右的无水乙醇，静置30min。
146.5.3)待下层胶凝固之后，轻轻倾斜制胶板，使无水乙醇流出，并采用滤纸吸干残余无水乙醇。
147.5.4)配置5％sds-page浓缩胶：按照配方加入适量的聚丙烯酰胺凝胶，10％ sds，分离胶缓冲液，混匀。加入适量的过硫酸铵和temed，轻轻搅拌(注：不要产生气泡)，将此液体缓缓地加入到分离胶上并灌满，随后插入梳子(保证梳子齿末端没有气泡)。
148.5.5)等待30min，待凝胶聚合后小心拔出梳子，将制好的凝胶和玻璃板放入电泳槽内并组装好。
149.5.6)将电泳缓冲液加入内外槽中，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲液中。
150.5.7)将5.1制备好的样品取20μl加入至凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。
151.5.8)接通电源进行电泳，观察marker，待marker显示的目标蛋白与其他蛋白明显分离时停止电泳(一般情况下是等溴酚蓝标记的样本跑出凝胶，目标蛋白的分子量不同电泳停止的时间不同，视实验而定)。
152.5.9)准备好转膜缓冲液，将胶浸于转膜缓冲液10min左右。
153.5.10)根据胶的大小裁剪pvdf膜(使用前需要进行甲醇浸泡处理)和滤纸，放到转膜缓冲液中平衡10min左右。
154.5.11)装配转膜：在海绵上放置3层已经用转膜液浸泡过的滤纸，放置胶，放置处理好的pvdf膜，放置3层已经用转膜液浸泡过的滤纸，放置海绵，注意每层之间不能有气泡，用转膜仪中的支架夹住(胶位于负极)，装配成转膜“三明治”。
155.5.12)将转膜“三明治”放置到转膜槽中，加转膜缓冲液，将转移槽置于冰浴中；插上电极，根据蛋白分子量确认转膜的电压/电流和时间。
156.5.13)转膜结束后，切断电源，取出pvdf膜。
157.5.14)将膜置于5％脱脂牛乳的tbst溶液中，于室温处置1h。
158.5.15)用tbst洗3min，然后置于配置好的带有his抗体(1:5000，鼠源)的5％脱脂牛乳的tbst溶液中，4℃过夜。
159.5.16)用tbst洗3次，每次5min。
160.5.17)配置好带有goat anti-mouse hrp抗体(1:3000)的5％脱脂牛乳的tbst溶液中，室温2小时。
161.5.18)用tbst洗3次，每次5min。
162.5.19)配置化学发光液，将其直接加入膜表面，用保鲜膜覆盖(注：无气泡无褶皱)；胶片在暗盒中进行压片10s至几分钟时间不等(根据条带亮度确定时间)，取出后显影液浸泡后置于定影液中浸泡，最后清水冲洗，即可拍照(或者直接滴加发光液在显影仪器中直接显影和拍照)，如图4所示，结果表明牛促卵泡激素蛋白在两种细胞中的优良表达。
163.本发明人另外还使用全自动化学发光成像分析系统(tanon 5200，天能)进行wb曝光，使用系统配置软件读取目标条带的灰度值和面积，并计算各样品条带各斑点的总灰度，
164.以表达上清条带35kd斑点总灰度除以标准蛋白marker条带35kd斑点总灰度所得的商，作为该表达上清的目标蛋白相对量。经计算，实施例4步骤4.9)获得的cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞表达上清之目标蛋白相对量为636
±
56(6次重复试验获得的表达上清之结果)、cho-k1(pb+β+l+α)细胞表达上清之目标蛋白相对量为1562
±
121(6次重复试验获得的表达上清之结果)。本发明的一个补充试验中(其可称为补充试验a)，与实施例1～实施例4步骤4.5)操作相同，通过2种方式获得细胞表达上清；接着，参照实施例4步骤4.6)至步骤4.9)的操作，不同的仅是在步骤4.7)中随cd3feed-k液和cd3feed-c液添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含0.6mg/ml丙酮酸钙和15mg/ml果糖的灭菌水溶液；由此，在步骤4.9)中，获得两种细胞的表达上清；接着，照实施例5的方法测定所得表达上清之目标蛋白相对量；结果：cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞串联表达上清之目标蛋白相对量为1278
±
84(6次重复试验获得的表达上清之结果)、cho-k1(pb+β+l+α)细胞融合表达上清之目标蛋白相对量为1638
±
144(6次重复试验获得的表达上清之结果)。本发明的一个补充试验中(其可称为补充试验b)，与实施例1～实施例4步骤4.5)操作相同，通过2种方式获得细胞表达上清；接着，参照实施例4步骤4.6)至步骤4.9)的操作，不同的仅是在步骤4.7)中随cd3feed-k液和cd3feed-c液添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含0.6mg/ml丙酮酸钙的灭菌水溶液；由此，在步骤4.9)中，获得两种细胞的表达上清；接着，照实施例5的方法测定所得表达上清之目标蛋白相对量；结果：cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞串联表达上清之目标蛋白相对量为662
±
92(6次重复试验获得的表达上清之结果)、cho-k1(pb+β+l+α)细胞融合表达上清之目标蛋白相对量为1486
±
136(6次重复试验获得的表达上清之结果)。本发明的一个补充试验中(其可称为补充试验c)，与实施例1～实施例4步骤4.5)操作相同，通过2种方式获得细胞表达上清；接着，参照实施例4步骤4.6)至步骤4.9)的操作，不同的仅是在步骤4.7)中随cd3feed-k液和cd3feed-c液添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含15mg/ml果糖的灭菌水溶液；由此，在步骤4.9)中，获得两种细胞的表达上清；接着，照实施例5的方法测定所得表达上清之目标蛋白相对量；结果：cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞串联表达上清之目标蛋白相对量为587
±
65(6次重复试验获得的表达上清之结果)、cho-k1(pb+β+l+α)细胞融合表达上清之目标蛋白相对量为1574
±
168(6次重复试验获得的表达上清之结果)。
165.根据上文实施例1～4以及补充试验a至补充试验c的结果，表明在无血清培养过程中添加本发明上文所述增补液能够显著地增加cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞串联表达上清之目标蛋白相对量，但是对cho-k1(pb+β+l+α)细胞融合表达上清之目标蛋白相对量无影响。
166.实施例6：镍柱纯化
167.6.1)将镍柱(ni-nta his-tag purification agarose，medchemexpress llc，货号hy-k0210，参照其说明书操作)从4℃温度处取出，置于架子上。
168.6.2)流干柱中的乙醇保存液，并加入20％的乙醇(已过膜)，流干。
169.6.3)加入足量的pbs(已过膜)，流干；重复一次。
170.6.4)加入待纯化的样本(在此是实施例4步骤4.5(当然亦可以是步骤4.9))所得表达上清，已过膜)，流干。
171.6.5)加入足量的10mm的咪唑溶液(已过膜)，流干。
172.6.6)加入500mm的咪唑洗脱(已过膜)，并收集流出液。
173.6.7)加入足量的水(已过膜)清洗咪唑。
174.6.8)加入足量的20％的乙醇(已过膜)，流干，重复此操作，最终保留柱子1/3量的20％的乙醇，并将整个柱子存于4℃。
175.6.9)使用超滤离心管(10kd)4000
×
g离心60min，重复多次，直至浓缩液为500μl左右。
176.6.10)加入10ml pbs，4000
×
g离心60min，重复多次此步骤，直至咪唑无残留。
177.6.11)得到最终浓缩液为纯化的牛促卵泡激素蛋白(包括串联表达方式和融合表达方式获得的2种蛋白)，置于-80℃冰箱保存。
178.实施例7：促卵泡激素诱导kgn细胞产生孕酮并测定孕酮含量
179.促卵泡激素能够诱导kgn细胞产生孕酮，孕酮含量能够反映促卵泡激素细胞水平活性。本实施例使用人孕酮(prog)elisa检测试剂盒(品牌：岚派，货号：lp-h01679)，测定实施例6获得的2种牛促卵泡激素蛋白(浓缩液，测定前用生理盐水将两种浓缩液调整其蛋白质浓度至与促卵泡激素标准品相当)诱导kgn细胞产生孕酮的量。
180.7.1)细胞培养：kgn细胞为单层贴壁生长细胞，生长用培养基为dmem/f12培养基+10％胎牛血清，于37℃、5％co2条件下培养3～4天，待细胞生长至对数生长期后；用胰酶消化，计数后保证在96孔细胞培养板(100μl)中的细胞数约为2
×
104个细胞/孔。
181.7.2)促卵泡激素样品准备：待细胞接种24h后，更换为1％fbs的dmem/f12培养基，然后用含1％fbs的dmem/f12培养基对促卵泡激素样品进行稀释，按照促卵泡激素蛋白浓缩液和dmem/f12培养基的比例为1:1、1:2进行稀释，稀释好的样品加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，每个样品2个复孔；于37℃、5％co2条件下分别培养48、72小时后取样检测。
182.7.3)促卵泡激素标准孔准备：待细胞接种24h后，更换为1％fbs的dmem/f12培养基，然后用含1％fbs的dmem/f12培养基对促卵泡激素标准品进行稀释，按照标准品(usa)和dmem/f12培养基的比例为1:1、1:2进行稀释，稀释好的样品加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，每个样品2个复孔；于37℃、5％co2条件下分别培养48、72小时后取样检测。
183.7.4)elisa试剂盒检测孕酮含量：从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
184.7.5)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
185.7.6)样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；空白孔不加。
186.7.7)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
187.7.8)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
188.7.9)每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。
189.7.10)每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。
190.7.11)绘制标准曲线：在excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应od值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。绘制柱状图，结果(n＝6的均值表示)如图5所示。另外同法测定补充试验a所得两种细胞表达上清经实施例6处理所得
浓缩液，显示串联表达所得fsh组孕酮含量为4.474nmol/ml、串融合表达所得fsh组孕酮含量为2.017nmol/ml。这些结果表明，本发明通过串联表达和融合表态两种方式制备得到的fsh均能够诱导kgn细胞产生孕酮。
191.本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种牛促卵泡激素核苷酸序列，其包含一个基因，该基因可以编码与含有α亚单位或称α亚基和β亚单位或称β亚基的天然牛促卵泡激素相同的蛋白序列，α亚基的基因序列如seq id no.1所示，β亚基的基因序列如seq id no.2所示。2.一种牛促卵泡激素的蛋白序列，其为串联表达方式，并带有自剪切2肽-p2a，其序列为gsgatnfsllkqagdveenpgp；或者，其为融合表达方式，并带有linker序列，其序列为ggggsggggsggggsggggs。3.一种稳定表达载体，其为piggybac转座子载体系统，其所用的启动子和终止子分别为：cmv和sv40 poly(a)；例如，其所用细胞株为cho-k1。4.一种制备牛促卵泡激素的方法，包含以下步骤：提供牛促卵泡激素核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；将该核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，进行合成；从插入重组质粒的甘油菌中提取质粒，使用电转仪将提取的质粒转入cho-k1细胞株中；单克隆筛选，显微镜下荧光观察并大规模培养，从培养液中纯化促卵泡激素蛋白，得到促卵泡激素；例如，制备牛促卵泡激素的方法包括以下步骤：(1)获得pb+β+p2a+α和pb+β+l+α载体；(2)质粒提取；(3)pb+β+p2a+α和pb+β+l+α电转化入cho-k1细胞；(4)cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞的单克隆筛选；(5)镍柱纯化。5.根据权利要求4的方法，其中步骤(1)获得pb+β+p2a+α和pb+β+l+α载体是照如下方式进行的：提供牛促卵泡激素核苷酸序列，确认α亚基和β亚基的基因序列，并进行密码子优化设计；将核苷酸序列设计成串联表达和融合表达两种方式，合成得到包括pb-cmv-mcs-ef1α-greenpuro、β亚基、p2a肽和α亚基的串联表达重组载体即重组质粒pb+β+p2a+α，以及包括pb-cmv-mcs-ef1α-greenpuro、β亚基、linker和α亚基的融合表达重组载体即重组质粒pb+β+l+α，以及得到插入该等重组质粒的甘油菌。6.根据权利要求4的方法，其中步骤(2)质粒提取使用无内毒素质粒大量提取试剂盒进行质粒提取并测定浓度，具体是照如下方式进行的：2.1)将插入了重组质粒的甘油菌培养所得过夜培养菌液转移至离心杯中，离心(例如4000
×
g室温离心10min)，倒掉培养基；2.2)加入solution i/rnasea，涡旋或移液器上下吹打重悬菌体；2.3)加10ml solution ii，轻柔地来回颠倒获得澄清的裂解液；室温孵育；2.4)加入冰buffer n3，轻轻颠倒充分混匀几次直至白色絮状沉淀出现；室温放置；2.5)于4℃离心(例如4000
×
g离心10min)，将上清转移到注射器中，过滤至新的(例如50ml)离心管中，测定所得裂解液的体积；2.6)加入0.1倍体积的etr溶液，上下反复颠倒；2.7)冰浴，期间将试管上下翻转多次；2.8)于42℃孵育裂解，应再次变浑浊；
2.9)于25℃离心(例如4000
×
g离心5min)，etr溶液在管底形成蓝色层；2.10)转移顶部水相到一个新的离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，颠倒6-7次，得到澄清裂解液；2.11)插入一个结合柱(例如hibind dna maxi结合柱)到一个离心管中，加入gps buffer到结合柱中，室温放置，离心(例如，4000
×
g离心3min)，丢弃废液；2.12)转移步骤2.10)得到的澄清裂解液到步骤2.11)处理的结合柱中，4000
×
g离心3min，弃滤液并重复使用收集管；2.13)重复2.10-2.12步骤直至所有的澄清裂解液全部转移到结合柱中；2.14)向结合柱中加入hbc buffer，离心(例如，4000
×
g离心3min)，弃滤液并重复使用收集管；2.15)加入dna wash buffer，离心(例如，4000
×
g离心3min)，弃滤液并重复使用收集管；2.16)加入dna wash buffer，离心(例如，4000
×
g离心3min)，弃滤液并重复使用收集管；2.17)将空的结合柱离心(例如，4000
×
g离心10min)使色谱柱干燥；2.18)将柱转移至一个新的离心管中；2.19)加入1-3ml endo-free elution buffer(70℃预热)于柱中心，室温放置5min，离心(例如，4000
×
g离心5min)得上清，即为提取的质粒，置于-20℃保存。7.根据权利要求4的方法，其中步骤(3)pb+β+p2a+α和pb+β+l+α电转化入cho-k1细胞是使用电转化试剂盒按照如下操作处理的：3.1)准备cho-k1细胞：将cho-k1细胞置于5%的co2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，使用处于指数生长期(密度约为2
×
106个/ml)，且存活率大于97%的细胞进行转化；3.2)待细胞生长至密度为2
×
106个/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液于离心管中(使其终密度为2
×
107个/ml)，1000rpm离心5min，弃上清；3.3)加入pbs溶液，重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清；3.4)使用电转化试剂盒中的r buffer重悬细胞；3.5)电转体系：9μl细胞(密度为2
×
107个/ml)，0.6μl的pb+β+p2a+α质粒，转座酶质粒0.4μl；9μl细胞(密度为2
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107个/ml)，0.6μl的pb+β+l+α质粒，转座酶质粒0.4μl；3.6)电转条件：1620v，10ms，3 pulse；3.7)在24孔板中加入1ml新鲜kdcho培养液，进行培养，并在24h时添加5μg/ml的嘌呤霉素，进行筛选；3.8)逐步提高嘌呤霉素的筛选浓度，最终达到8μg/ml，得到cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞，其用于后续的单克隆筛选。8.根据权利要求4的方法，其中步骤(4)cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞的单克隆筛选是按照如下操作处理的：4.1)取待单克隆的cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞各100μl，分别加入管中，混匀；按梯度稀释的方法稀释，稀释两次；利用aopi双染试剂检测细胞数量，并进行稀释，终浓度为100个/10ml；4.2)吸取100μl上述细胞稀释液，置于96孔板中；
4.3)保持3天不动，第4天每孔补加100μl的kd-clone；4.4)一周之后观察，圈出长势较好的孔且显微镜下可看到明显的绿色荧光，即可在第10天左右将其转移至一个新的24孔板中；4.5)待24孔板中细胞长满后转移一部分至新的6孔板，并添加kdcho-cd3培养基，于荧光显微镜下观察并拍照，成功表达的细胞呈现绿色荧光，未成功表达的细胞不显示荧光，由此可以得到cho-k1(pb+β+p2a+α)单克隆和cho-k1(pb+β+l+α)单克隆细胞及其表达上清。9.根据权利要求4的方法，其中步骤(4)还进一步地将所得cho-k1(pb+β+p2a+α)单克隆和cho-k1(pb+β+l+α)单克隆按如下步骤进行无血清培养重组高蛋白表达：4.6)将筛选得到成功表达的单克隆置于kdcho-cd3培养液中，按1x106cells/ml接种摇瓶培养(37℃，5% co2)，每日计数；4.7)待细胞密度达到5x106cells/ml之后开始补料，每天按照同样比例添加cd3feed-k液和cd3feed-c液(例如，每毫升细胞培养液添加k液3.4μl和c液15μl)(例如，随cd3feed-k液和cd3feed-c液添加的同时，每毫升细胞培养液还添加增补液25μl，该增补液是包含0.6mg/ml丙酮酸钙和15mg/ml果糖的灭菌水溶液)；4.8)待细胞密度超过1x107cells/ml，则需要同时额外补加葡萄糖，依照细胞密度每107cells/ml、每天、每升培养液补加1g葡萄糖；4.9)待细胞密度达到1.5x107cells/ml时将培养移到32℃条件下继续进行培养15天后，分别收获cho-k1(pb+β+p2a+α)细胞和cho-k1(pb+β+l+α)细胞的表达了促卵泡激素蛋白的细胞表达上清；任选的，可以使用western blot法进一步验证这些表达上清中的促卵泡激素蛋白表达。10.根据权利要求4的方法，其中步骤(5)镍柱纯化包括如下操作：6.1)将镍柱从4℃温度处取出，置于架子上；6.2)流干柱中的乙醇保存液，并加入20%的乙醇，流干；6.3)加入足量的pbs，流干；重复一次；6.4)加入待纯化的样本即细胞表达上清，流干；6.5)加入足量的10mm的咪唑溶液，流干；6.6)加入500mm的咪唑洗脱，并收集流出液；6.7)加入足量的水清洗咪唑；6.8)加入足量的20%的乙醇，流干，重复此操作，最终保留柱子1/3量的20%的乙醇，并将整个柱子存于4℃；6.9)使用超滤离心管(10kd)4000
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g离心60min，重复多次，直至浓缩液为500μl左右；6.10)加入10ml pbs，4000
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g离心60min，重复多次此步骤，直至咪唑无残留；6.11)得到最终浓缩液为纯化的牛促卵泡激素蛋白。

技术总结
本发明涉及牛促卵泡激素及其稳定表达制备的方法。一方面，本发明涉及牛促卵泡激素核苷酸序列，其包含一个基因，其可以编码与含有α亚基和β亚基的天然牛促卵泡激素相同的蛋白序列，α亚基和β亚基的基因序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。还涉及牛促卵泡激素的蛋白序列、稳定表达载体、以及制备牛促卵泡激素的方法。本发明使用稳定表达的重组表达载体为PiggyBac转座子载体系统，通过电转化的方式将带有目标基因的表达载体转入目标细胞株中，抗生素加压筛选后进行单克隆筛选、发酵表达及验证。纯化后的蛋白可用于同期发情、超数排卵、牛胚胎移植等领域。牛胚胎移植等领域。


技术研发人员：郑小娥 刘庆喜 郭春明 赵明礼
受保护的技术使用者：天津力牧生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/13