一种发酵复合植物材料制备抗溃疡病生物制剂的方法与流程

1.本发明涉及一种发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，属于生物发酵技术领域。


背景技术：

2.溃疡病是由地毯草黄单胞致病菌感染柑橘等果树引起的一种细菌性病害。能够侵染柑橘的叶片、果实、枝条，病变部位形成类似火山口形状的病斑。发病严重时会导致叶片大量脱落，影响光合作用的正常进行，果实出现大量病斑，严重损害果实外观和品质，导致其失去经济价值。果树的溃疡病属于世界性病害，国内华南、西南、东南等地区的柑橘主产区，每年都会因为溃疡病的大面积发生而造成严重的经济损失。每年全世界用于防治溃疡病菌的费用高达数亿美元。目前，对于溃疡病菌的危害主要使用化学农药进行防治，不仅污染环境，还易造成植物药害，容易引起人畜中毒。因此生物性杀菌剂的研发一直是业内人士关注的焦点。
3.一般采用化学农药进行杀菌是目前农业生产上的常规作业方式，长期的化学防治不但使病原菌产生抗药性，且大剂量地使用药剂容易造成环境污染，同时长期存在毒性残留的问题。在果树和蔬菜种植的过程中，化学杀菌剂的使用是相当普遍的，通常导致各种副作用，不利于人体的健康。随着人们生态环境保护意识日益增强，对于化学农药这类高农药残留的杀菌剂逐渐持反对态度，因此，减少农药使用，以生物农药替代化学农药已成为目前杀菌剂的发展趋势。目前，发现黄连等多种植物材料具体较好的杀菌效果。丁香含有丁香素以及多种倍半萜类次生代谢物质，其中很多成分有杀菌效果。目前也有研究表明通过采用发酵的方式来制取生物制剂的杀虫剂。如中国专利申请（公开号：cn106867947a）公开了一种以苦楝为原料经微生物发酵制备杀菌剂的方法，该方法包括将解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金杆菌分别接种于种子培养基中进行培养成活按比例配成混合菌，再将苦楝经过乙醇和水处理后，粉碎加水、灭菌后放入发酵罐中，将上述混合菌接种，并在37℃培养3-12天后，得到相应的发酵液，过滤后，得到的发酵液即可杀虫，对溃疡病菌的传播媒介潜叶蛾有一定的效果。虽然，其通过生物发酵的方式能够在一定程度上避免失活和有机溶剂污染的问题，但是，其采用多种生物菌共存的方式进行发酵，存在成本高，多种菌共存的条件复杂等问题，且其仅是针对单一植物的发酵。


技术实现要素：

4.本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提供一种发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，解决的问题是如何实现兼具改善植物生长和高活性的抗溃疡病虫性能。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：a.选取马齿苋，丁香和黄连清洗干净后，进行粉碎处理后，加入发酵罐内，再加水
稀释成发酵底物；b.将得到的发酵底物进行灭菌处理后，再将经活化的地衣芽孢杆菌按照108cfu/ml-109cfu/ml的量接种到灭菌后的发酵底物，使发酵温度在25℃-37℃的条件下进行发酵处理，得到发酵液；c.将得到的发酵液进行过滤除去沉淀物，得到抗溃疡病生物制剂。
6.作为优选，所述的步骤a中马齿苋，丁香，黄连，水的质量比例为：1：0.5-0.7：0.7-0.9：10-15。
7.作为优选，所述的步骤a中粉碎处理添加有冰粉，所述冰粉的添加量为马齿苋质量的2.0%-5.0%。
8.作为进一步的优选，所述冰粉的温度为-30℃-10℃。提高冰粉的硬度，使其有更好的刺破能力。
9.作为优选，所述的步骤b中灭菌后向发酵底物中添加入碳源，所述碳源的添加量为马齿苋的加入量的5.0%-10.0%。
10.作为进一步的优选，所述碳源选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的一种或几种。有利于提高地衣芽孢杆菌的利用效率。
11.作为优选，所述的步骤b中发酵处理的时间为7-10天。目的是充分地利用发酵底物的营养成分，提高植物组织细胞中活性成分的释放。
12.作为优选，所述的步骤b中发酵处理时体系的ph值为6.5-7.5。使发酵培养的环境更有利于地衣芽孢杆菌的生长。
13.作为优选，所述的步骤c中所述抗溃疡病生物制剂中含有生物碱、丁香素、小檗碱成分。
14.为了使通过发酵之后得到的发酵液中各活性物质的成分对溃疡病菌具有更好的杀菌能力，尤其是从马齿苋中得到的生物碱和从丁香中得到的丁香素占有较高的比例，提高对溃疡病菌的杀菌效果。
15.由于冰粉具有一定的硬度和棱角，在粉碎的过程中能够对植物组织细胞壁起到破坏作用，从而使更好的释放细胞内的活性成分同时，能够使植物组织粉碎得更彻底，提高地衣芽孢杆菌对它们的有效利用，且采用的冰粉溶化后直接形成水当然发酵液原料，也不会对原料产生其副作用。通过在前期加入少量的碳源，能够提高地衣芽孢杆菌的生长繁殖，繁殖生长的大量地衣芽孢杆菌能够更充分和快速的利用加入了马齿苋，丁香和黄连原料。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过以单一的地衣芽孢杆菌作为唯一的微生物菌发酵，使能够同时对马齿苋，丁香和黄连进行一次性发酵培养，且有效的利用它们作为营养成分进行生长，从而使有利于其中的活性成分的释放，使生物制剂中能够同时含有生物碱，丁香油和小檗碱，实现提高了对溃疡病菌的杀菌功能，且采用的地衣芽孢杆菌对果树植物本身具有促进生长的效果，在使用本生物制剂的同时对果树植物具有促进生长的效果。
附图说明
17.图1为本发明的生物制剂制备流程图。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
19.按照马齿苋，丁香，黄连的用量比例选取各自的植物原料，先选取生长健康的新鲜马齿苋，使马齿苋的干重为900g，用清水清洗干净后，再采用粉碎机进行粉碎处理成马齿苋浆液，粉碎过程中可加入少量的水以避免过热而破坏活性成分，采用新鲜的马齿苋本身带有一部分水，也是为了起到防止过热的效果再选取新鲜的丁香，使丁香的干重为700g，用清水清洗干净后，再采用粉碎机进行粉碎处理成丁香浆液，最后再选取新鲜的黄连，使黄连的干重为630g，用清洗干净后，再进行粉碎处理成黄连浆液，然后，将上述得到的三种浆液加入发酵罐内进行混合，再加入水稀释成10l体积的含水的发酵底物将得到的发酵底物进行灭菌处理后，灭菌处理采用的温度为80℃，灭菌处理的时间为15分钟，灭菌处理后，再将经活化的地衣芽孢杆菌按照的量接种到灭菌后的发酵底物，这里地衣芽孢杆菌直接通过购买得到即可，具体的活性采用常规的种子培养基进行培养活化处理，得到含活化的地衣芽孢杆菌液，具体的种子培养基配方成分如下:蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l，其余为水，将得到的培养液取一定量使接种量达到要求加入上述发酵底物的溶液中即可，接种完成后，控制发酵体系的发酵温度在25℃-30℃的条件下，并使体系的ph值控制在7.1-7.3的范围内进行发酵处理10天，发酵结束后，得到相应的发酵液再将得到的发酵液进行滤芯过滤除去沉淀物，即可得到抗溃疡病生物制剂。将得到的生物制剂进行分析，具体分析结果如下：本生物制剂中含有生物碱、丁香素、小檗碱成分较高，且生物碱，丁香素及小檗碱的含量比为1：0.5：0.4。从含量情况还可以分析出，其中马齿苋中生物碱的提取率高达60%以上，丁香中丁香素的提取率达到40%以上，黄连中小檗碱的总提取达到50%以上。
实施例
20.按照马齿苋，丁香，黄连的用量比例选取各自的植物原料，先选取生长健康的新鲜马齿苋，用清水清洗干净后，先将马齿苋切断成小颗粒物，再采用粉碎机进行粉碎处理成马齿苋浆液再选取新鲜的丁香，用清水清洗干净后，再采用粉碎机进行粉碎处理成丁香浆液，最后再选取新鲜的黄连，用清洗干净后，再进行粉碎处理成黄连浆液，然后，将上述得到的三种浆液加入发酵罐内进行混合，再加入水稀释成含水的发酵底物各成分的加入量按照马齿苋，丁香，黄连，水的质量比为1：0.5：0.7：10，这里马齿苋，丁香和黄连的质量按照干重进行折算，将得到的发酵底物进行灭菌处理后，灭菌处理采用的温度为85℃，灭菌处理的时间为10分钟，灭菌处理后，再将经活化的地衣芽孢杆菌按照108cfu/ml的量接种到灭菌后的发酵底物，这里地衣芽孢杆菌直接通过购买得到即可，具体的活性采用常规的种子培养基进行培养活化处理，得到含活化的地衣芽孢杆菌液，本实施例的地衣芽孢杆菌的活化同实施例1的一致，接种完成后，控制发酵体系的发酵温度在30℃-35℃的条件下，并使体系的ph值
控制在6.5-7.0的范围内进行发酵处理7天，发酵结束后，得到相应的发酵液先进行粗滤，除去发酵液中较大的固体残留物，再进行精滤，即可得到抗溃疡病生物制剂。
21.本生物制剂中含有生物碱、丁香素、小檗碱成分较高，且生物碱，丁香素，小檗碱的含量比为1:0.4:0.3。从含量情况还可以分析出，其中马齿苋中生物碱的提取率高达60%以上，丁香中丁香素的提取率达到40%以上，黄连中小檗碱的总提取达到50%以上。
实施例
22.按照马齿苋，丁香，黄连的用量比例选取各自的植物原料，先选取生长健康的新鲜马齿苋，用清水清洗干净后，先将马齿苋切断成小颗粒物，再采用粉碎机进行粉碎处理成马齿苋浆液再选取新鲜的丁香，用清水清洗干净后，再采用粉碎机进行粉碎处理成丁香浆液，最后再选取新鲜的黄连，用清洗干净后，再进行粉碎处理成黄连浆液，然后，将上述得到的三种浆液加入发酵罐内进行混合，再加入水稀释成含水的发酵底物各成分的加入量按照马齿苋，丁香，黄连，水的质量比为1：0.7：0.9：15，这里马齿苋，丁香和黄连的质量按照干重进行折算，将得到的发酵底物进行灭菌处理后，灭菌处理采用的温度为85℃，灭菌处理的时间为15分钟，灭菌处理后，选加入蔗糖，使蔗糖的加入量为马齿苋加入重量的5%，最好按照马齿苋的干重进行折算，再将经活化的地衣芽孢杆菌按照1.5x108cfu/ml的量接种到灭菌后的发酵底物，这里地衣芽孢杆菌直接通过购买得到即可，接种完成后，控制发酵体系的发酵温度在28℃-32℃的条件下，并使体系的ph值控制在7.1-7.5的范围内进行发酵处理8天，发酵结束后，得到相应的发酵液先进行粗滤，除去发酵液中较大的固体残留物，再进行精滤，即可得到抗溃疡病生物制剂。
23.本生物制剂中含有生物碱、丁香素、小檗碱成分较高，且生物碱，丁香素，小檗碱的含量比为1：0.4：0.3。从含量情况还可以分析出，其中马齿苋中生物碱的提取率高达60%以上，丁香中丁香素的提取率达到40%以上，黄连中小檗碱的总提取达到50%以上。
实施例
24.将分别经过清水清洗处理干净后的马齿苋，丁香，黄连，按照马齿苋，丁香，黄连的用量比例选取各自的植物原料，将三种植物原料选进行剪碎成小颗粒物，再加入冰粉，初始加入的冰粉的温度为-10℃，使冰粉的加入量为马齿苋干重的2.0%，然后进行强力搅拌粉碎处理，搅拌速度控制在8000转/分钟，得到直接混合后的混合浆料，再加入水稀释成含水的发酵底物使各成分的加入量按照马齿苋，丁香，黄连，水的质量比为1：0.6：0.8：13，这里马齿苋，丁香和黄连的质量按照干重进行折算，将得到的发酵底物进行灭菌处理后，灭菌处理采用的温度为90℃，灭菌处理的时间为10分钟，灭菌处理后，选加入蔗糖，使蔗糖的加入量为马齿苋加入重量的8%，最好按照马齿苋的干重进行折算，再将经活化的地衣芽孢杆菌按照3x108cfu/ml的量接种到灭菌后的发酵底物，这里地衣芽孢杆菌直接通过购买得到即可，一般相当于经活化的地衣芽孢杆菌培养液100ml左右，接种完成后，控制发酵体系的发酵温度在30℃-33℃的条件下，并使体系的ph值控制在7.1-7.5的范围内进行发酵处理9天，发酵结束后，得到相应的发酵液先进行粗滤，除去发酵液中较大的固体残留物，再进行精滤，即可得到抗溃疡病生物制剂。
25.本生物制剂中含有生物碱、丁香素、小檗碱成分较高，且生物碱，丁香素，小檗碱的
含量比为1：0.5：0.4。从含量情况还可以分析出，其中马齿苋中生物碱的提取率高达75%以上，丁香中丁香素的提取率达到60%以上，黄连中小檗碱的总提取达到60%以上。
26.对比例1：本比较例选用单一的苏云金杆菌作为微生物菌进行具体的比例实施，苏云金杆菌通过市售购买即可。
27.按照马齿苋，丁香，黄连的用量比例选取各自的植物原料，先选取生长健康的新鲜马齿苋，使马齿苋的干重为900g，用清水清洗干净后，再采用粉碎机进行粉碎处理成马齿苋浆液，粉碎过程中可加入少量的水以避免过热而破坏活性成分，采用新鲜的马齿苋本身带有一部分水，也是为了起到防止过热的效果再选取新鲜的丁香，使丁香的干重为700g，用清水清洗干净后，再采用粉碎机进行粉碎处理成丁香浆液，最后再选取新鲜的黄连，使黄连的干重为630g，用清洗干净后，再进行粉碎处理成黄连浆液，然后，将上述得到的三种浆液加入发酵罐内进行混合，再加入水稀释成体积10l的含水的发酵底物将得到的发酵底物进行灭菌处理后，灭菌处理采用的温度为80℃，灭菌处理的时间为15分钟，灭菌处理后，再将经活化的苏云金杆菌按照109cfu/ml的量接种到灭菌后的发酵底物，具体的活性采用常规的种子培养基进行培养活化处理，得到含活化的地衣芽孢杆菌液，具体的种子培养基配方成分为：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l，其余为水，将得到的培养液取一定量使接种量达到要求加入上述发酵底物的溶液中即可，接种完成后，控制发酵体系的发酵温度在25℃-30℃的条件下，并使体系的值控制在ph7.1-7.3的范围内进行发酵处理10天，发酵结束后，得到相应的发酵液再将得到的发酵液进行滤芯过滤除去沉淀物，即可得到抗溃疡病生物制剂。将得到的生物制剂进行分析，具体分析结果如下：本生物制剂中含有生物碱、丁香素、小檗碱成分较高，且生物碱，丁香素，小檗碱的含量比为1：0.1：0.5，含量比例相当较大，从含量情况还可以分析出，其中马齿苋中生物碱的提取率高达40%以上，丁香中丁香素的提取率达到10%以上，黄连中小檗碱的总提取达到15%以上。
28.对比例2本比较例选用单一的短小芽孢杆菌作为微生物菌进行具体的比例实施，短小芽孢杆菌通过市售购买即可，具体的实施方式同比较例一致，区别仅在于采用短小芽孢杆菌代替苏云金杆菌。得到相应的生物制剂。
29.本生物制剂中含有生物碱、丁香素、小檗碱成分较高，且生物碱丁香素小檗碱的含量比为1：0.2：0.1，含量比例小，从含量情况还可以分析出，其中马齿苋中生物碱的提取率高达45%以上，丁香中丁香素的提取率达到15%以上，黄连中小檗碱的总提取达到15%以上。
30.采用本实施例1-4得到的生物制剂和对比例1-2制备的生物制剂进行抗溃疡病实验，将试验田溃疡病危害的水果植株分割成大小相同的6块，将本实施例1-4制备的生物制剂用水稀释到100倍后进行喷洒治疗溃疡病菌处理。发现喷洒本生物制剂后，两天内均能够将溃疡病菌基本上全部杀灭，病斑康复率达到95%以上，五天以上叶片病灶基本上能够完全恢复，具有很好的抗溃疡病的效果，且喷洒后，果树的生长情况更好，可见具有一定的促生作用效果。
31.对比例1-2喷洒本生物制剂后，两天内均能够将溃疡病菌基本上全部杀灭，病斑康复率达到75%以上，五天以上叶片病灶基本上也只能够达到80%左右恢复率，抗溃疡病的效
果相对较差且喷洒后，果树的生长情况一般，没有明显的促进生长的效果。
32.将实施例1-4制备的生物制剂和对比例的生物制剂进行抗溃疡病实验，将实施例1-4制备的生物制剂和对比例1-2制备的生物制剂用水稀释200倍后采用喷雾瓶喷药进行叶正背面均匀喷射，喷施叶片而不滴水为止，利用microsoft excel 进行数据分析，利用spss软件进行相对防效计算。
33.药后 24h 、48小时和72小时分别调查病斑数，并计算其防治效果。其中 ：抗病斑率 (%)=[( 防治前的病斑数—防治后的病斑数 ) / 防治前的病斑 ]
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100 ；实验结果如下
[0034]
由此可以进一步验证，本实施例1-4制备的生物制剂抗病斑效果明显优于对照组，由此可验证本实施例1-4的生物制剂具备较好的抗病斑效果。
[0035]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)选取马齿苋，丁香和黄连清洗干净后，进行粉碎处理后，加入发酵罐内，再加水稀释成发酵底物；(b)将得到的发酵底物进行灭菌处理后，再将经活化的地衣芽孢杆菌按照108cfu/ml-109cfu/ml的量接种到灭菌后的发酵底物，使发酵温度在25℃-37℃的条件下进行发酵处理，得到发酵液；(c)将得到的发酵液进行过滤除去沉淀物，得到抗溃疡病生物制剂。2.根据权利要求1所述发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，所述步骤a中马齿苋，丁香，黄连和水的质量比为1：0.3-0.5：0.5-0.7：10-15。3.根据权利要求1所述发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，所述的步骤a中粉碎处理添加有冰粉，所述冰粉的添加量为马齿苋质量的3.0%-7.0%。4.根据权利要求3所述发酵复合植物原料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，所述冰粉的温度为-30℃-10℃。5.根据权利要求1所述发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，所述的步骤b中灭菌后向发酵底物中添加入碳源，所述碳源的添加量为丁香加入量的5.0%-10.0%。6.根据权利要求5所述发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖，果糖或蔗糖中的任何一种。7.根据权利要求1中所述的发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，所述的步骤b中发酵处理的时间为8-10天。8.根据权利要求1中所述的发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，所述的步骤b中发酵处理时体系的ph值为6.5-7.5。9.根据权利要求1中所述的发酵植物复合材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，其特征在于，所述的步骤c中抗溃疡病生物制剂中含有生物碱，丁香油，小檗碱成分。

技术总结
本发明涉及一种发酵复合植物材料制备抗溃疡病生物制剂的方法，选取马齿苋，丁香和黄连清洗干净后，进行粉碎处理后，加入发酵罐内，再加水稀释成发酵底物；将得到的发酵底物进行灭菌处理后，再将经活化的地衣芽孢杆菌按照108cfu/mL-109cfu/mL的量接种到灭菌后的发酵底物，使发酵温度在25℃-37℃的条件下进行发酵处理，得到发酵液；将得到的发酵液进行过滤除去沉淀物，得到抗溃疡病生物制剂。本发明得到的生物制剂中能够同时含有生物碱，丁香油，小檗碱实现提高对溃疡病菌的杀菌功能，且对果树植物本身具有促进生长的效果。树植物本身具有促进生长的效果。树植物本身具有促进生长的效果。


技术研发人员：廖祥儒
受保护的技术使用者：苏州谱伊顿生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/13