氟伐他汀在制备抑制乳腺癌干细胞药物中应用

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及氟伐他汀在制备抑制乳腺癌干细胞药物中应用，具体氟伐他汀(fluvastatin)在抑制乳腺癌细胞干性，转移能力和增强化疗敏感性中的应用。
背景技术：
：：2.乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，手术、放射治疗和化疗是目前主要的治疗手段。然而，患者对常规疗法会产生耐药性。而乳腺癌细胞中存在一类具有自我更新及分化能力强的细胞亚群，这类细胞被称为乳腺癌干细胞，虽然乳腺癌干细胞在乳腺癌中含量很低，但是其在乳腺癌发生发展、侵袭、转移及治疗中发挥重要作用，并且越来越多的研究表明乳腺癌干细胞是乳腺癌发生耐药性的重要原因。具体而言。肿瘤干细胞与其相关的非肿瘤祖细胞存在相同基因型，但肿瘤干细胞具有不同的表观遗传学特点并可导致多个信号通路变化，使肿瘤干细胞适应微环境变化，包括炎症、低氧、低ph值、营养物质匮乏及对肿瘤治疗(化疗和放疗)抵抗等。即肿瘤干细胞对治疗抵抗及遗传进化和表观遗传的可塑性可能是肿瘤复发转移的根源。肿瘤干细胞通常对化疗和放疗有抵抗力，这意味着尽管治疗成功杀灭了大部分肿瘤细胞，然而剩余的一部分肿瘤干细胞依然可以存活并促进肿瘤复发，从而导致侵袭转移及对治疗的抵抗，因此抑制或杀死肿瘤干细胞在肿瘤治疗、特别是耐药性方面成为本领域难题和研究热点。3.他汀类药物是被广泛处方的降胆固醇药物，耐受性良好且相对便宜。长期以来，人们一直对重新利用他汀类药物来治疗乳腺癌感兴趣。有文献报道他汀类药物对不同肿瘤敏感度不同，且不同他汀作用效果和作用机制具有差别。4.氟伐他汀是一种常见的抗高胆固醇血症药物，通过抑制3-羟基甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制乳腺癌细胞的增殖、血管生成和转移。但未见文献报道氟伐他汀可以抑制乳腺癌细胞干性。技术实现要素：5.发明目的：本发明目的是提供氟伐他汀抑制乳腺癌细胞干细胞新的应用。6.技术方案：7.氟伐他汀在制备抑制乳腺癌干细胞药物中应用。8.所述的乳腺癌细胞包括人乳腺癌细胞系mda-mb-231细胞或mcf-7-adr细胞。9.进一步地，所述mda-mb-231细胞或mcf-7-adr细胞以密度为3000-5000个细胞/孔接种。10.氟伐他汀在抑制乳腺癌转移的研究中，其用法和用量为：对8周龄小鼠进行尾静脉注射，每三天一次，每次剂量为10mg/kg体重，持续21天。11.有益效果12.乳腺癌干细胞适应微环境变化，包括炎症、低氧、低ph值、营养物质匮乏及对肿瘤治疗(化疗和放疗)抵抗。现有技术虽然公开了部分他汀类药物具有对肿瘤细胞干性有抑制作用，但氟伐他汀作为他汀类药物一种常见药物，文献报道未见有类似作用。13.本发明发现在不影响细胞活力的情况下，氟伐他汀特异性地削弱乳腺癌细胞的干性，显著减弱干性相关蛋白表达，显著降低干细胞群标志物cd44+/cd24-亚群的表达，削弱乳腺成球能力和肿瘤起始能力以及抑制乳腺癌细胞迁移侵袭能力等。本发明的研究结果为氟伐他汀治疗乳腺癌提供了理论依据，特别是发现已被用于临床但局限适用于治疗胆固醇的药物氟伐他汀，可适用于乳腺癌，老药新用，为治疗乳腺癌提供新策略。14.综上所述，本发明首次发现了氟伐他汀在抑制乳腺癌细胞干性，其可以对抗肿瘤转移和增强化疗敏感性(抗耐药性)方面起作用，有广泛的临床应用价值。附图说明15.图1为westernblot分析氟伐他汀给药后mda-mb-231细胞和mcf-7-adr细胞中干性相关蛋白的表达水平，其中a为mda-mb-231细胞的wb结果，b为mda-mb-231细胞中蛋白表达数据统计结果，c为mcf-7-adr的wb结果，d为mcf-7-adr的细胞中蛋白表达数据统计结果。16.图2为流式细胞术分析氟伐他汀给药后mda-mb-231和mcf-7-adr细胞中干细胞群(cd44+/cd24-)的比例，其中a为mda-mb-231细胞流式细胞检测结果，b为mda-mb-231流式细胞数据统计结果，c为mcf-7-adr细胞流式细胞检测结果，d为mcf-7-adr细胞流式细胞数据统计结果。17.图3为三维半固体成球分析氟伐他汀对于乳腺癌细胞的成球能力的影响，a为不同药物浓度对mda-mb-231作用后显微照片，b为mda-mb-231细胞成球统计结果，c为不同药物浓度对mcf-7-adr作用后显微照片，d为mcf-7-adr细胞成球统计结果。18.图4为氟伐他汀对于乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响，a为mda-mb-231细胞侵袭照片，b为mda-mb-231细胞侵袭数据统计结果，c为mcf-7-adr细胞侵袭照片，d为mcf-7-adr细胞侵袭数据统计结果19.图5为裸鼠异种移植瘤结合有限稀释法分析氟伐他汀对于乳腺癌细胞肿瘤起始能力的影响，a为以mda-mb-231细胞作为移植瘤照片，b为mda-mb-231细胞移植瘤重量统计结果，c为mcf-7-adr细胞作为移植瘤照片，d为mcf-7-adr细胞移植瘤重量统计结果。20.图6为建立裸鼠肺部转移模型，检测氟伐他汀对于乳腺癌细胞体内转移能力的影响，a为裸鼠肺转移模型构建过程，b为每次给药后裸鼠的平均体重统计，c为阴性对照pbs给药组裸鼠的肺部h&e染色结果图，d为氟伐他汀(fluvastatin)给药组裸鼠的肺部h&e染色结果图。21.图7为cck8分析氟伐他汀对乳腺癌细胞mcf-7-adr阿霉素敏感性的影响。具体实施方式22.以下通过实施例进一步描述本发明。但应当理解的是，以下具体实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非限制本发明。23.氟伐他汀(s1909)购自cat#hy-14664,medchemexpress,monmouthjunction,nj,usa实施例1:氟伐他汀在体外抑制乳腺癌细胞干性相关蛋白的表达24.通过cck8确定氟伐他汀能够减弱乳腺癌细胞干性而不影响细胞活力的给药浓度。将mda-mb-231细胞和mcf-7-adr细胞以3000-5000/孔的密度接种至96孔板中，24小时后，加入不同浓度的氟伐他汀。48小时后，每孔加入100μl稀释10倍的cck8溶液，孵育1小时，测定450nm处的吸光度。如表1，确定了氟伐他汀在mda-mb-231和mcf-7-adr中的半抑制浓度。25.table1lc50offluvastatininbreastcancercells[0026][0027]为了检测氟伐他汀对乳腺癌细胞干性蛋白表达水平的影响，实验选取干性较强的mda-mb-231细胞和mcf-7-adr细胞，给药之后提取蛋白，最后通过westernblot进行分析。[0028]选取处于对数生长期的mda-mb-231和mcf-7-adr细胞，接种至六孔板中，待细胞贴壁且生长密度约为30％-40％时，于培养上清中给dmso及氟伐他汀，48小时后，收集细胞，提取蛋白。提取蛋白的具体步骤如下：[0029](1)弃去六孔板中的培养上清，加入pbs清洗残留培养基，加入200μl蛋白裂解液(ripa:pmsf＝100:1v/v)，使用细胞刮刮下细胞，将蛋白裂解液转移至1.5mlep管中，4℃，12000rpm离心15min，收集上清，使用蛋白定量试剂盒检测上清蛋白样品浓度。[0030](2)加入5×loadingbuffer，吹打混匀，沸水煮5min。[0031]westernblot操作如下：[0032](1)将样品取出，置于冰上融化，涡旋混匀，吸取10μg样品通过sds-page电泳进行分离。[0033](2)通过湿转电转法将胶中分离好的蛋白转移至活化的pvdf膜上，使用5％-8％的脱脂牛奶封闭2h。[0034](3)将膜取出，tbst清洗膜上牛奶，抗体4℃孵育过夜。[0035](4)取出膜，使用tbst洗膜三次，每次10min。[0036](5)室温孵育相应二抗40min。[0037](6)使用tbst洗膜三次，每次10min。[0038](7)使用ecl曝光显影。[0039]结果如图1所示，氟伐他汀以浓度依赖性的方式降低了干性相关标志物蛋白的表达。[0040]实施例2:氟伐他汀在体外抑制乳腺癌干细胞群比例[0041](1)将给药48小时后的细胞使用胰酶进行消化，加入培养基终止消化，使用移液枪吹下细胞，收集至1.5mlep管中，4℃，300g离心5min，收集细胞。[0042](2)使用1mlpbs清洗细胞一次，离心去上清，使用100μlpbs重悬细胞。[0043](3)加入5μlcd44-apc抗体和5μlcd24-pe抗体。另取100μl细胞悬液，加入5μliso-apc抗体和5μliso-pe抗体，置于冰上避光孵育30min。[0044](4)孵育结束后，加入200μlpbs重悬，离心弃上清。[0045](5)pbs重悬，使用300目筛网进行过滤后，流式上机检测。[0046]结果如图2所示，氟伐他汀以浓度依赖性的方式减少了cd44+/cd24-干细胞群比例。[0047]实施例3:氟伐他汀在体外抑制乳腺癌细胞成球能力[0048](1)配置成球培养体系：向成球培养基中加入成球增殖补液(1ml/10ml)、肝素(4μg/ml)和皮质醇(0.48μg/ml)。[0049](2)于低黏附板中每孔加入500μl成球培养基，3000-5000个细胞以及dmso或氟伐他汀。[0050](3)将低黏附板置于培养箱中培养8-10天，使用显微镜进行拍照并计数。[0051]结果如图3所示，氟伐他汀抑制乳腺癌细胞的成球大小及成球数目。[0052]实施例4:氟伐他汀抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭[0053]检测细胞迁移的操作如下：[0054](1)将40000个mda-mb-231和mcf-7-adr细胞接种至小室中，于内室加入无血清的含药培养基，于外室加入800μl20％血清的培养基。[0055](2)24小时后，取出小室，使用pbs清洗一遍。[0056](3)使用70％乙醇固定细胞30min后，pbs清洗一遍。[0057](4)使用0.1％结晶紫染色30min，pbs清洗染料。[0058](5)使用棉签清理未迁移的细胞，使用显微镜进行观察并拍照。[0059]检测细胞侵袭的操作如下：[0060](1)将存于-20℃的基质胶提前放置4℃进行融化。[0061](2)将基质胶稀释10倍，取100μl铺于内室，37℃包被2h，使基质胶凝固。[0062](3)基质胶凝固后，于内室加入60000个细胞和200μl无血清含药培养基，于外室加入800μl20％血清的培养基。[0063](4)24小时后取出小时进行清洗、固定和染色。[0064](5)使用棉签擦去基质胶及未迁移细胞，使用显微镜进行拍照。[0065]如图4所示，氟伐他汀处理细胞后，乳腺癌细胞迁移能力和侵袭能力减弱。[0066]实施例5:氟伐他汀在体内抑制乳腺癌细胞干性[0067]使用裸鼠异种移植瘤模型结合有限稀释法，检测氟伐他汀对于乳腺癌细胞肿瘤起始能力的影响。[0068](1)扩大培养mda-mb-231和mcf-7-adr细胞，于最后一次传代后，待细胞贴壁并生长至30％-40％时，于培养基上清加入dmso或氟伐他汀，培养48小时。[0069](2)使用胰酶消化细胞，加入培养基终止消化并收集细胞，使用100μl双无培养基连续稀释使细胞浓度为107、106、105。[0070](3)将细胞经皮下接入裸鼠腋下，14天后观察肿瘤形成。[0071]如图5所示，氟伐他汀处理后，细胞的致瘤能力降低。[0072]实施例6:氟伐他汀在体内抑制乳腺癌细胞转移[0073](1)将1×106个mda-mb-231细胞通过尾静脉注射至裸鼠体内，构建裸鼠肺转移模型。[0074](2)将pbs或氟伐他汀(10mg/kg)经尾静脉注射给药，每三天一次，同时对小鼠进行称重并记录。[0075](3)24天后处死裸鼠，取肺，加入多聚甲醛进行固定。[0076](4)进行h&e染色分析，观察小鼠的肺部结节。[0077]如图6所示，氟伐他汀给药后，小鼠肺部结节明显减少。记录小鼠体重发现，与溶剂对照组相比，氟伐他汀给药后小鼠体重并无明显差异，提示氟伐他汀在体内具有抑制乳腺癌细胞转移的功能且毒副作用较低。[0078]实施例7：氟伐他汀可增强乳腺癌细胞的化疗敏感性[0079]将mcf-7-adr细胞以3000-5000/孔的密度接种至96孔板中，24小时后，加入不同浓度的阿霉素(广谱抗癌药物)和相同浓度的氟伐他汀，阴性对照为dmso和氟伐他汀。48小时后，每孔加入100μl稀释10倍的cck8溶液，孵育1小时，测定450nm处的吸光度。分析氟伐他汀对乳腺癌细胞对阿霉素敏感性的影响。[0080]如图7所示，氟伐他汀与阿霉素共同处理乳腺癌细胞后，与对照组相比，阿霉素的半抑制浓度(ic50)降低，说明氟伐他汀可提高乳腺癌细胞的化疗敏感性。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.氟伐他汀在制备抑制乳腺癌干细胞药物中应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的乳腺癌细胞包括人乳腺癌细胞系mdamb231细胞或mcf7adr细胞。3.氟伐他汀在制备提高对乳腺癌细胞对抗癌药物的化疗敏感性药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗癌药物为阿霉素。

技术总结
本发明涉及生物医药领域，具体涉及氟伐他汀在制备抑制乳腺癌干细胞药物中应用；本发明发现在不影响细胞活力的情况下，氟伐他汀特异性地削弱乳腺癌细胞的干性，显著减弱干性相关蛋白表达，显著降低干细胞群标志物CD44+/CD24亚群的表达，削弱乳腺成球能力和肿瘤起始能力以及抑制乳腺癌细胞迁移侵袭能力等。本发明的研究结果为氟伐他汀治疗乳腺癌提供了理论依据，特别是发现已被用于临床但局限适用于治疗胆固醇的药物氟伐他汀，可适用于乳腺癌，老药新用，为治疗乳腺癌提供新策略。为治疗乳腺癌提供新策略。为治疗乳腺癌提供新策略。


技术研发人员：郑禄枫 陈颖 李慧龙 郭倩倩 袁正东 张译文
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/8/14