一种夏枯草提取物的制备方法及产品与应用

1.本发明属于天然产物提取技术领域，尤其涉及一种夏枯草提取物的制备方法及产品与应用。


背景技术：

2.夏枯草，属唇形科(lamiaceae)多年生草本植物，其命名源于“此草夏至后即枯”而得名，最早记载于《神农本草经》，其药用历史可追溯至数千年前。临床上，夏枯草被广泛用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、高血压、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎等疾病。现代研究表明，夏枯草含有多种类型的化学成分，已分离出萜类、酚酸类、黄酮类、甾醇类、香豆素类、有机酸类、挥发油及糖类等多种化学成分。夏枯草中含有多种三萜类成分，主要为齐墩果烷型、乌苏烷型和羽扇豆烷型三萜。其中，熊果酸(ua)和齐墩果酸(oa)等三萜类物质是具有重要药理活性的成分，具有镇静、抗炎、抗菌、抗高血压、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应。但现有技术中夏枯草的萜类化合物的提取率较低，提取物中三萜类化合物的纯度较低，无法最大化利用夏枯草的药用价值。
3.因此，如何提供一种能够提高夏枯草提取物中三萜类化合物含量及纯度的提取方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提出了一种基于响应面法优化超声辅助提取夏枯草中三萜类化合物的方法及产品与应用。
5.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
6.一种夏枯草提取物的制备方法，包括以下步骤：利用超声辅助有机溶剂对夏枯草全草进行提取，再采用box-behnken响应面分析法，以夏枯草三萜类化合物得率为响应值，以超声功率、提取温度、有机溶剂浓度为响应变量进行响应面实验，计算夏枯草中三萜类化合物平均得率，对提取夏枯草中三萜类化合物工艺进行优化，得到最佳提取工艺。
7.有益效果：影响夏枯草三萜类化合物提取的因素很多，不同因素的影响程度不同，同时不同因素之间是否有交互作用也未知，本发明旨在优化超声法提取夏枯草三萜类物质的工艺，通过单因素实验的方法选择出超声功率、提取溶剂和超声温度三个因素变量范围，并以三个水平为基础，采用box-behnken实验设计方法，采用响应面分析法对实验结果进行优化和验证，以确定最佳提取工艺，本发明的最佳提取工艺，有效提高提取物的抗菌能力，而且提高得率，产业化价值高。
8.优选的，所述提取过程中，超声功率为300～500w，提取温度为30～50℃；
9.所述有机溶剂为乙醇，所述乙醇浓度为40％～80％。
10.有益效果：本发明通过单因素实验，选择了对夏枯草三萜类化合物提取率影响较大的三个影响因素，分别为超声功率，提取温度和乙醇浓度。然后对其进行响应面的优化考查。
11.优选的，所述响应面试验中，夏枯草中三萜类化合物响应面因素和水平表如下所示：
[0012][0013][0014]
优选的，所述响应面试验中，所得回归方程为：
[0015]
y＝22.99+0.30a-0.36b+0.39c+0.052ab-0.26ac+0.20bc-1.27a
2-0.45b
2-1.08c2；
[0016]
其中a为超声功率、b为提取温度、c为提取溶剂，y为三萜类化合物平均得率。
[0017]
优选的，所述超声功率415w，所述提取温度36℃，所述乙醇浓度62％。
[0018]
有益效果：本发明根据响应面的最佳提取工艺参数，夏枯草三萜类提取率可以达到23mg/g.
[0019]
优选的，还包括以下步骤：
[0020]
将提取后所得提取液过大孔树脂柱后洗脱，再将所得洗脱液浓缩干燥，得到所述夏枯草提取物。
[0021]
优选的，所述大孔树脂为ab-8。
[0022]
有益效果：本发明将提取液利用大孔树脂洗脱后，能够有效提纯提取液中三萜类物质，提高夏枯草提取物中三萜类化合物的含量，进而提高提取物的抗菌能力。
[0023]
优选的，所述富集过程中，上样浓度为0.2mg/ml，最大上样量为3bv树脂用量，流速2.0v/h；
[0024]
所述洗脱方法为：先用体积分数为10％的乙醇洗去杂质，再用6bvab-8大孔树脂用量的无水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，得到洗脱液。
[0025]
有益效果：本发明通过除杂和富集，夏枯草三萜类化合物的纯度增加，最高达到57.5％。
[0026]
一种所述的夏枯草提取物的制备方法制备得到的夏枯草提取物。
[0027]
有益效果：本发明通过单因素结合响应面方法，获得的最佳的提取工艺，并对提取物进行大孔吸附树脂的富集，得到纯度》50％的夏枯草三萜类化合物。
[0028]
一种夏枯草提取物在抗菌药物的制备中的应用。
[0029]
优选的，所述抗菌为抗大肠杆菌。
[0030]
本发明公开了一种夏枯草提取物的制备方法及产品与应用，本发明以夏枯草为原材料，采用box-behnken响应面法对提取夏枯草三萜类化合物工艺进行优化，获得最佳工艺，并采用大孔吸附树脂对提取物中的萜类成分进行富集。相比正交提取法及单纯的响应面优化提取法，本发明提高了夏枯草三萜类化合物得率及纯度，而且同时有效提高提取物抗菌活性，可更好应用于制备抗菌药物。并且，本发明采用响应面优化模型可靠，获得最佳
工艺，最大化发挥夏枯草提取物功能性。此外，本发明提取方法快捷、简便、高效、可靠的方法，产业化价值高。
附图说明
[0031]
构成本技术的一部分的附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
[0032]
图1为实施例1中所得标准曲线；
[0033]
图2为实施例1中乙醇浓度(a)、温度(b)交互作用对夏枯草三萜类化合物得率的等高线图；
[0034]
图3为实施例1中乙醇浓度(a)、温度(b)交互作用对夏枯草三萜类化合物得率的响应面图；
[0035]
图4为实施例1中乙醇浓度(a)、超声功率(c)交互作用对夏枯草三萜类化合物得率的等高线图；
[0036]
图5为实施例1中乙醇浓度(a)、超声功率(c)交互作用对夏枯草三萜类化合物得率的响应面图；
[0037]
图6为实施例1中温度(b)、超声功率(c)交互作用对夏枯草三萜类化合物得率的等高线图；
[0038]
图7为实施例1中温度(b)、超声功率(c)交互作用对夏枯草三萜类化合物得率的响应面图；
[0039]
图8为实施例4中夏枯草三萜类提取物对大肠杆菌的抑制活性；
[0040]
图9为实施例4中夏枯草三萜类化合物的抗菌活性测试。
具体实施方式
[0041]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0042]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0043]
本发明中的原料均通过市售途径购买获得。
[0044]
本发明中的夏枯草原料为夏枯草植物的干燥果穗。
[0045]
1.部分药品来源为：
[0046]
无水乙醇、乙酸乙酯:天津市富宇精细化工有限公司；
[0047]
冰醋酸：国药集团化学试剂有限公司；
[0048]
香草醛、齐墩果酸：上海麦克林生化科技有限公司；
[0049]
高氯酸：天津市科密欧化学试剂有限公司。
[0050]
2.主要仪器与设备
[0051]
kq-800db型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；
[0052]
df-101z集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司；
[0053]
jy502电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；
[0054]
722n分光光度计：上海精科实业有限公司。
[0055]
实施例1
[0056]
一种基于响应面法优化夏枯草提取物的制备，包括以下步骤：
[0057]
1.夏枯草三萜类物质提取工艺单因素实验
[0058]
为探究超声功率、乙醇浓度、超声时间和超声温度对夏枯草三萜类物质提取的影响，采用单因素实验设计，以吸光度值为评估指标，对不同实验水平进行探究。
[0059]
实验设计包括超声功率160、240、320、400、480、560、640w，乙醇浓度20、40、60、80、100％，超声时间15、25、35、45、55、65min，超声温度30、40、50、60、70℃。通过对提取条件的初步优化，确定了较佳因素实验参数范围，并对每个处理重复进行了三次实验。结果以平均值进行统计分析。
[0060]
(1)齐墩果酸标准曲线的制作
[0061]
5％香草醛冰乙酸溶液的配制：准确称取5g香草醛，用冰乙酸溶解后定容至100ml。
[0062]
标准曲线的制作：准确称取齐墩果酸标准品17mg，用无水乙醇溶解并准确定容至100ml，配制成0.17mg/ml的标准溶液。取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml标准溶液于7个试管中，加入无水乙醇至1ml。然后将试管置于沸水浴中挥去溶剂，随后加入5％香草醛冰乙酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，迅速混匀后置于70℃水浴锅中加热15min，随后用冰水将混合物快速冷却至室温，再加入乙酸乙酯8ml，混合均匀后于560nm处测定吸光值。并以齐墩果酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。
[0063]
(2)超声功率对三萜类物质得率的影响
[0064]
将夏枯草粉末按照35ml/g的比例加入70％乙醇，并在每个锥形瓶上标注相应的比例，随后进行超声处理。超声处理条件为：超声温度50℃，超声时间45min，超声功率梯度为160、240、320、400、480、560、640w。超声结束后，在3000r/min的条件下离心5min，并从每个离心管中分别取上清液0.05ml。随后加入0.95ml的无水乙醇溶液并混合摇匀，最后在水浴锅中加热挥去溶剂，检测其中三萜类物质得率。最终总结不同超声功率对夏枯草三萜类物质得率的影响。
[0065]
(3)乙醇浓度对三萜类物质得率的影响
[0066]
将夏枯草粉末加入不同浓度的乙醇溶剂(20、40、60、80、100％)，并在每个锥形瓶上标注相应的浓度比例，随后进行超声处理。超声处理条件为：超声温度50℃，超声时间45min，超声功率400w。超声结束后，在3000r/min的条件下离心5min，并从每个离心管中分别取上清液0.05ml。随后加入0.95ml的无水乙醇溶液并混合摇匀，最后在水浴锅中加热挥去溶剂，检测其中三萜类物质得率。最终总结不同乙醇浓度对夏枯草三萜类物质得率的影响。
[0067]
(4)超声时间对三萜类物质得率的影响
[0068]
将夏枯草粉末按照35ml/g的比例加入70％乙醇，并在每个锥形瓶上标注相应的比例，随后进行超声处理。超声处理条件为：超声温度50℃，超声时间梯度为15、25、35、45、55、65min，超声功率400w。超声结束后，在3000r/min的条件下离心5min，并从每个离心管中分别取上清液0.05ml。随后加入0.95ml的无水乙醇溶液并混合摇匀，最后在水浴锅中加热挥去溶剂，检测其中三萜类物质得率。最终总结不同超声时间对夏枯草三萜类物质得率的影
响。
[0069]
(5)超声温度对三萜类物质得率的影响
[0070]
将夏枯草粉末按照35ml/g的比例加入70％乙醇，并在每个锥形瓶上标注相应的比例，随后进行超声处理。超声处理条件为：超声温度梯度为30、40、50、60、70℃，超声时间45min，超声功率400w。超声结束后，在3000r/min的条件下离心5min，并从每个离心管中分别取上清液0.05ml。随后加入0.95ml的无水乙醇溶液并混合摇匀，最后在水浴锅中加热挥去溶剂，检测其中三萜类物质得率。最终不同液料比例对夏枯草三萜类物质得率的影响。
[0071]
2.响应面优化实验
[0072]
基于单因素实验结果，选择超声功率、乙醇浓度和超声温度三个单因素，采用三因素三水平的box-behnken实验设计，并利用design-expert8.06软件进行响应面分析，以确定提取夏枯草三萜类物质的最佳条件。
[0073]
3.结果与分析
[0074]
(1)夏枯草三萜类物质提取的单因素实验结果
[0075]
以齐墩果酸的含量(mg)为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，评估齐墩果酸的浓度，标准曲线结果见图1。图1可以看出，齐墩果酸标准曲线y＝0.00414x+0.0284,r2＝0.995，齐墩果酸与吸光度在一定范围内表现出良好的线性关系。
[0076]
(2)响应面法优化实验设计及结果分析
[0077]
响应面实验设计与分析
[0078]
基于单因素实验结果，选择超声功率、乙醇浓度和超声温度三种因素，采用box-behnken响应面实验设计，将夏枯草三萜类物质含量作为响应值，进行三因素三水平的实验。响应面的方程为：
[0079]
y＝22.99+0.30a-0.36b+0.39c+0.052ab-0.26ac+0.20bc-1.27a
2-0.45b
2-1.08
[0080]
c2[0081]
响应面实验设计及结果如下表1所示：
[0082]
表1
[0083][0084]
为了进一步验证模型的可靠性进行方差分析，实验结果由表2可知，模型p值《0.0001，表明方程模型极其显著，失拟项p值》0.05，表明失拟不显著，说明模型拟合程度较好。
[0085]
表2.回归模型方差分析
[0086][0087]
最后确定夏枯草三萜类化合物提取的最佳工艺为：超声功率为415w、温度36℃、乙醇浓度为62％。
[0088]
实施例2
[0089]
一种夏枯草提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0090]
将夏枯草与浓度为62％的乙醇以35ml/g的比例混合，并在超声功率为415w，温度36℃的条件下超声提取45min，得到夏枯草提取液。
[0091]
所得夏枯草提取液中三萜类化合物得率达到23mg/g。
[0092]
实施例3
[0093]
大孔吸附树脂富集结果分析
[0094]
采用不同的大孔吸附树脂(ab-8、nka-9、s-8、d101、hpd-100)对实施例2所得夏枯草提取液进行萜类化合物进行富集。
[0095]
富集条件为：上样浓度0.2mg/ml，最大上样量为3bv树脂用量，流速2.0v/h；
[0096]
洗脱方法为：先用体积分数为10％的乙醇洗去杂质，再用6bvab-8大孔树脂用量的无水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分。结果如表3所示：
[0097]
表3
[0098][0099]
由表3可以看出，利用ab-8树脂对萜类化合物的吸附效果最好，纯度可达57.5％。
[0100]
实施例4
[0101]
夏枯草三萜提取物的抗菌活性：
[0102]
对夏枯草萜类物质的抗菌活性进行研究，其中，试验菌种为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，具体步骤如下：
[0103]
(1)将培养好的菌种管中刮取菌苔，加入到无菌生理盐水中，混匀，在摇床上于37℃震荡培养，金黄色葡萄球菌培养13h，大肠杆菌培养6h，枯草芽孢杆菌培养8h，利用血球计数板将菌株用无菌生理盐水配制成10-107cfu/ml的菌悬液，备用。
[0104]
(2)将定量滤纸用打孔器打成直径为6mm圆片,置于洁净干燥试管内120℃湿热灭菌30min后，即得。
[0105]
(3)取直径6mm的灭菌滤纸片于三萜提取物中浸泡12h，将无菌的lb培养基制成平板,取0.1ml菌悬液利用涂布法将其均匀涂布到平板上，用无菌镊子取含三萜提取物的滤纸片并贴在平板表面，每板贴含不同浓度三萜提取物的滤纸片于37℃培养24h，观察结果。
[0106]
大肠杆菌的抗菌效果如图8所示，可以看出，夏枯草萜类物质抗菌效果明显。
[0107]
如图9所示，夏枯草三萜类化合物(0.5mg/ml)对大肠杆菌(a)、枯草芽孢杆菌(b)和金黄色葡萄球菌(c)的抑制活性，其中大肠杆菌抑制活性明显，抑菌率为48.6％。
[0108]
以上，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种夏枯草提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：利用超声辅助有机溶剂对夏枯草全草进行提取，再采用box-behnken响应面分析法，以夏枯草三萜类化合物得率为响应值，以超声功率、提取温度、有机溶剂浓度为响应变量进行响应面实验，计算三萜类化合物平均得率，对提取夏枯草中三萜类化合物工艺进行优化，得到最佳提取工艺。2.根据权利要求1所述的一种夏枯草提取物的制备方法，其特征在于，所述提取过程中，超声功率为300～500w，提取温度为30～50℃；所述有机溶剂为乙醇，所述乙醇浓度为40％～80％。3.根据权利要求1所述的一种夏枯草提取物的制备方法，其特征在于，所述响应面试验中，所得回归方程为：y＝22.99+0.30a-0.36b+0.39c+0.052ab-0.26ac+0.20bc-1.27a
2-0.45b
2-1.08c2；其中a为超声功率、b为提取温度、c为提取溶剂，y为三萜类化合物平均得率。4.根据权利要求2或3所述的一种夏枯草提取物的制备方法，其特征在于，所述超声功率415w，所述提取温度36℃，所述乙醇浓度62％。5.根据权利要求1所述的一种夏枯草提取物的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：将提取后所得提取液过大孔树脂柱富集后洗脱，再将所得洗脱液浓缩干燥，得到所述夏枯草提取物。6.根据权利要求5所述的一种夏枯草提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂为ab-8。7.根据权利要求5所述的一种夏枯草提取物的制备方法，其特征在于，所述富集过程中，上样浓度为0.2mg/ml，最大上样量为3bv树脂用量，流速2.0v/h；所述洗脱方法为：先用体积浓度为10％乙醇洗去杂质，再用6bvab-8大孔树脂用量的无水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，得到洗脱液。8.如权利要求1-3和5-7任一项所述的一种夏枯草提取物的制备方法制备得到的夏枯草提取物。9.如权利要求8所述的一种夏枯草提取物在抗菌药物的制备中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，所述抗菌为抗大肠杆菌。

技术总结
本发明公开了一种夏枯草提取物的制备方法及产品与应用，属于天然产物提取技术领域。提取方法具体包括以下步骤：利用超声辅助有机溶剂对夏枯草全草进行提取，再采用Box-Behnken响应面分析法对提取夏枯草中三萜类化合物工艺进行优化，得到最佳提取工艺。本发明还公开了上述制备方法制备得到的夏枯草提取物，同时公开了该夏枯草提取物在抗菌药物的制备中的应用。本发明提高了夏枯草三萜类化合物得率及纯度，而且同时有效提高提取物抗菌活性，可更好应用于制备抗菌药物。并且，本发明采用响应面优化模型可靠，获得最佳工艺，最大化发挥夏枯草提取物功能性。发挥夏枯草提取物功能性。发挥夏枯草提取物功能性。


技术研发人员：马风伟 邓青芳 陆逸昊 许粟
受保护的技术使用者：贵阳学院
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/8/14