六氧化四砷组合物在制备用于预防或治疗肝癌的药物组合物中的用途的制作方法

1.本发明涉及一种六氧化四砷组合物在制备用于预防或治疗肝癌的药物组合物中的用途。


背景技术：

2.癌被特定为不可抑制的细胞生长，而这种非正常的细胞生长会形成被称作肿瘤(tumor)的细胞块，从而渗透到周围的组织中，严重时还会转移到身体的其它器官。从学术角度来说也被称为新生物(neoplasia)。癌以不同程度的患病率而对身体的所有的组织及脏器产生影响。
3.肝癌(liver cancer)是非正常细胞在肝中以不能控制的方式生长时所产生的，原发性肝癌(primary liver cancer)在全世界的癌死亡中占第四位(bosch f.x.，et al.，2004)，在韩国成为40～50岁左右的男性的主要死亡原因，在每10万名人口中，每年有22.6名死于肝癌(annual report cause of death 2004，2005)。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)为目前韩国癌症发病第3位的主要癌症，观察5年的存活率为9.6％，是预后非常不良的癌症。
4.对于肝细胞癌最有效的治疗方法为手术切除术和肝移植。肝移植为目前为止存活率最高的方法，但难以找到供体，通过手术来进行的肝切除虽然存活时间很长，但手术对象被限制在20％以内。此外，对于无法进行肝移植或肝切除术的进行性肝细胞癌，采用的是非手术型局部癌去除的治疗方法，其中包括动脉化疗栓塞、高频电灼及乙醇注入法、放射线治疗等。
5.对于肝细胞癌患者，对选择有效的治疗法难以给出指导性建议的原因在于，首先，大部分的肝细胞癌患者还伴有肝硬化症，其次，因肝功能降低而导致的死亡人数占大多数，因此难以证明治疗方法的效果。因此，今后为了能够完全治愈肝细胞癌，需要在现有的效果已被证实的治疗方法的基础上，多方面地结合新的治疗方法，通过联合治疗来提高治疗反应和存活率方面进行努力。
6.因此，关于治疗肝癌方面，正在持续地要求开发出具有优异的抗癌效果的治疗剂。
7.此外，本发明人已经以下述技术特征获得了韩国授权专利号为第272835号的专利。所述技术特征为，通过提纯技术从包含砷的自然产砷石中精制出的六氧化四砷在动物实验中显示出了抑制癌转移的效果，并且在对子宫癌、膀胱癌、肺癌、上颌窦癌、肾癌等晚期癌症患者进行给药时，具有优异的抗癌治疗效果。
8.本发明人通过对砷的持续地进行研究的结果，发现了采用与上述授权专利中所公开的方法不同的新型制备方法能够制备出包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a的六氧化四砷，而包含这种六氧化四砷的组合物尤其是在预防或治疗肝癌方面具有显著的效果，从而完成了本发明。
9.现有技术文献
10.专利文献
11.(专利文献0001)韩国授权专利第272835号(天然化学物质六氧化四砷作为新型抗肿瘤治疗剂的用途及其药物组合物，2000年8月30日，授权)。
12.非专利文献
13.(非专利文献0001)annual report cause of death 2004，national stastical office，2005。
14.(非专利文献0002)bosch f.x.，et al.，primary liver cancer：worldwide incidence and trends，gastroenterology，127(s)，s15-s16，2004。


技术实现要素：

15.要解决的技术问题
16.本发明的目的在于，提供一种包含六氧化四砷(as4o6)的多晶型物作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物。
17.本发明的另一目的在于，提供一种包含六氧化四砷(as4o6)的多晶型物作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物的制备方法。
18.本发明的又一目的在于，提供一种六氧化四砷(as4o6)组合物在制备用于预防或治疗肝癌的药物组合物中的用途。
19.技术方案
20.本发明涉及一种包含六氧化四砷(as4o6)的多晶型物的用于预防或治疗肝癌的药物组合物，涉及一种包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a(as4o
6-a)的组合物。
21.所述组合物可以包含小于1％的六氧化四砷的多晶型物b(as4o
6-b)。
22.所述六氧化四砷的纯度可以为99.9％以上。
23.所述as4o
6-a及as4o
6-b可以为具有下述(i)～(iii)的特性的六氧化四砷多晶型物。
24.表1
[0025][0026]
所述as4o
6-a的特征为，在x-射线粉末衍射分光图中，在光源波长为时，在衍射角2θ10
°
～50
°
的范围下，用1
°
/min的速度(扫描步进0.02
°
)表示的峰显示为13.84、27.88、32.32、35.3、39.84、42.38、46.34、48.6及49.34的晶型(参见图1a和图1b)。此外，2θ值13.8和27.9中显示的主峰的比率为1：1.3。
[0027]
所述as4o
6-b的特征为，在x-射线粉末衍射分光图中，在光源波长为时，在衍射角2θ10
°
～50
°
的范围下，用1
°
/min的速度(扫描步进0.02
°
)表示的峰显示为13.86、27.92、32.36、35.34、39.9、42.44、46.4、48.66及49.4的晶型(参见图1a和图1b)。此外，2θ值13.8和27.9中显示的主峰的比率为1：2.5。
[0028]
下面，对本发明进行更加详细的说明。
[0029]
本发明涉及包含六氧化四砷(as4o6)作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a(as4o
6-a)。
[0030]
根据本发明的另一实施方式，涉及一种包含六氧化四砷(as4o6)的多晶型物作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物的制备方法，所述用于预防或治疗肝癌的药物组合物包括以下工序而制得：将氯化钠在100～800℃下加热后进行冷却的第一工序；将三氧化二砷(as2o3)置于氯化钠上，然后在密闭状态下从100℃加热至1000℃后进行冷却的第二工序；在滤纸中分离结晶化的结晶的第三工序；以及用上述第三工序中获得的结晶来代替第二工序中的三氧化二砷重复实施4～10次第二工序及第三工序，从而获得六氧化四砷结晶的第四工序；在所述第四工序中获得的六氧化四砷结晶包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a(as4o
6-a)。
[0031]
准备高岭土材质的合成反应器，以及在合成反应器的上方能够安装过滤器的夹钳(clamp)，在合成反应器内放置氯化钠进行加热及冷却。在本发明的制备方法中使用氯化钠的原因是，在第二工序中将三氧化二砷放置在氯化钠上进行加热，能够使得热均匀地传递到砷化合物上，有助于砷化合物的升华，为了通过第一工序来去除这种氯化钠的杂质及水分，在100～800℃下加热2～6小时。在第一工序中，对氯化钠进行加热后，在室温下冷却3～10小时。
[0032]
之后，进行第二工序。即，将三氧化二砷(as2o3)置于氯化钠上，然后在密闭状态下从100℃加热至1000℃后进行冷却。在此，放置三氧化二砷后，在夹钳上安装3～6个能够捕集升华的砷的过滤器(滤纸)，使得各过滤器与过滤器之间的间距为2mm～6mm。此时使用的过滤器优选使用基本重量(basic weight)为70～100g/m2，厚度(thickness)为0.17～0.25mm，过滤速度(filtration speed)为22～30s/100ml，以及保留粒径(retention rate)为5～10μm的过滤器。
[0033]
安装过滤器之后进行密闭，然后在合成反应器下部从100℃阶段性地升温至1000℃，同时加热3～10小时，使得滤纸的最上部中心部的温度维持在150℃
±
100℃，使得六氧化四砷通过滤纸的同时被结晶化。然后，在常温下冷却5小时以上，优选冷却5～10小时。
[0034]
然后，实施第三工序。即，对间隔层叠设置的3～6个滤纸所捕集的白色结晶进行分离。
[0035]
去除合成反应器中的氯化钠上残留的微量的三氧化二砷后，放上所述捕集的白色结晶，然后以相同的条件重复实施4～10次第二工序及第三工序，最终获得六氧化四砷。对根据本发明的制备方法获得的结晶结构进行确认的结果为，大部分为as4o
6-a，as4o
6-a占99％以上。
[0036]
本发明的包含六氧化四砷的多晶型物的药物组合物能够有效地用于肝癌的预防或治疗。
[0037]
本发明的药物组合物可以分别通过常规方法被剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服剂型、外用剂、栓剂及灭菌注射溶液形态而使用。所述药物组合物中可以包含的载体、赋形剂及稀释剂可列举如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻朊酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油。在进行制剂化时，使用通常使用的填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿
剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂而制备。用于口服的固体型制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体型制剂在本发明的六氧化四砷中至少混合一种以上的如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等赋形剂而制得。此外，除了简单的赋形剂之外，也使用硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。作为用于口服的液状制剂相当于悬浮剂、内溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了经常使用的作为简单稀释剂的水、液状石蜡之外，还可以包括多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。作为非口服给药的制剂，包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥剂、栓剂。作为非水性溶剂、悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物性油，油酸乙酯等可注射的酯等。作为栓剂的基材，可以使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
[0038]
所述药物组合物的给药量根据受治对象的年龄、性别、体重和所治疗的特定疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、给药途径及开药者的判断而有所不同。基于这种因素的给药量的确定在本领域技术人员的水平范围内，通常的给药量的范围在0.01mg/kg/天～约500mg/kg/天。更优选为0.01mg/kg/天～100mg/kg/天。可以一天给药一次，也可以分成数次给药。所述给药量从任何方面来说都不是为了限定本发明的范围。
[0039]
所述药物组合物可以以多种途径对鼠、家畜、人等哺乳动物施用。施用的所有方式是可以预计的，例如，可以通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内粘膜或脑血管内注射来进行给药。
[0040]
发明的效果
[0041]
本发明的用于预防或治疗肝癌的药物组合物由于包含99％以上的六氧化四砷的多晶型物a，从而具有优异的抗癌效果。
附图说明
[0042]
图1a和图1b为as4o
6-a及as4o
6-b的x-射线粉末衍射分光图。
[0043]
图2a和图2b为示出使用实施例1及比较例1～3对smmc-7721细胞系进行处理后，培养48小时(图2a)及72小时(图2b)后，通过mtt检测试验来评价细胞增殖抑制效果的结果的图。
[0044]
图3a和图3b为示出使用实施例1及比较例1～3对hcclm3细胞系进行处理后，培养48小时(图3a)及72小时(图3b)后，通过mtt检测试验来评价细胞增殖抑制效果的结果的图。
[0045]
图4为示出使用实施例1对移植了肝癌细胞系的h22细胞的小鼠进行处理时，根据实施例1的处理量及处理时间的癌的体积变化的确认结果图。
[0046]
图5为示出使用实施例1对移植了肝癌细胞系的h22细胞的小鼠进行处理时，通过观察根据实施例1的处理量及处理时间的癌的体积变化来评价癌生长抑制率的结果图。
[0047]
图6为示出使用实施例1以不同的浓度对移植了肝癌细胞系的smmc-7721细胞的小鼠进行处理时，癌组织大小根据实施例1的处理而变化的图。
具体实施方式
[0048]
下面，对本发明的优选实施例进行详细说明。但是，本发明不仅限定于在此说明的实施例，也可以具体化为其它形态。是为了使得在此介绍的内容非常完整，向本领域技术人员充分地传递本发明的思想而提供的。
[0049]
实施例1：本发明的六氧化四砷的制备
[0050]
准备由高岭土特殊制得的合成反应器(高100mm，直径190mm)和可安装3～6个过滤器的夹钳。在距离合成反应器50mm处设置1次夹钳，在所述1次夹钳的上方，以2～6mm的间隔设置2次～6次夹钳，此时，各个夹钳的规格为直径210mm及厚度10mm。
[0051]
将400g～600g的称量的粗盐(水分含量10％以下)加入到合成反应器内，以20mm左右的厚度铺展均匀，并压实，于100℃～800℃下缓慢加热3小时，同时进行连续加热，以使得反应器内部的盐表面温度为290
±
30℃，从而去除水分及杂质，并在室温下冷却5小时。
[0052]
将作为原料物质的100gas2o3(纯度98％以上，制备公司yunnan wenshan jinchiarsenic co.,ltd.)放置在合成反应器内的粗盐上，安装3～6个位于合成器上方的夹钳，以设置可捕集升华的砷的过滤器(滤纸)、各个过滤器之间的间隔为2～6mm。此时使用的过滤器优选使用基本重量为70～100g/m2，厚度为0.17～0.25mm，过滤速度为22～30s/100ml，以及保留粒径为5～10μm的过滤器。
[0053]
利用夹钳固定过滤器，并在合成反应器下部加热，从100℃阶段性地升温至1,000℃。首先，加热1小时，以使得合成反应器下部的外部温度为350℃
±
100℃左右，之后，进行加热，使得合成反应器下部的外部温度为600～650℃，以及700～1,000℃，总加热时间为5～10小时，使得过滤器最上方滤纸的中心部温度维持150℃
±
100℃后，在常温下冷却5～7小时。在该过程中，放置在合成反应器的盐上的粉末as2o3在合成反应器内部变成气体而上升，由于合成反应器外部的上部温度相对要低，因此变成液体，之后结晶化为固体，从而在过滤器上生成白色结晶体。
[0054]
将采集的白色结晶体放置在合成反应器的粗盐上再次进行加热和冷却，再重复实施4次采集结晶的工序，最终获得12.0g的结晶。对获得的砷化合物结晶的结构进行确认的结果，大部分为as4o
6-a，as4o
6-a占99％以上，as4o
6-b小于1％。
[0055]
确认到dsc(示差扫描量热分析)值在升温速度为10℃/min时，as4o
6-a在282.67℃的点处显示出了吸热峰(熔点)，as4o
6-b在286.77℃的点处显示出了吸热峰(熔点)。
[0056]
as4o
6-a及as4o
6-b的粉末x射线衍射分光图示于图1a和图1b中，as4o
6-a及as4o
6-b的衍射数据如下述表2所示。
[0057]
表2
[0058][0059][0060]
由图1a和图1b及表2可以确认，具有如下特征：as4o
6-a在2θ值为13.8和27.9时显示出的主峰的比例为1：1.3，as4o
6-b在2θ值为13.8和27.9时显示出的主峰的比例为1：2.5。对制备的化合物的dsc分析、结构确定及x射线衍射分析按照如下方法实施。
[0061]
(1)dsc分析
[0062]
在dsc装置(sdt q600 v20.9 build 20)中，使n2以100ml/min的速度流入，并以10℃/min的升温速度将温度升至310℃，同时对20.0mg的试样进行分析。
[0063]
(2)x射线结晶学
[0064]
将六氧化四砷(as4o6，mw＝395.6)的单结晶置于玻璃纤维(glass fiber)上，照射x-射线束，并观察是否存在衍射出的照片花纹和衍射数据的体系性，从而确定空间群(space group)，确定单位细胞常数(cell parameter)。衍射强度在10
°
《2θ《50
°
的范围下采集。使用结构确定程序(shelxtl程序)对该数据进行处理，并利用重原子方法(patterson方法)确认as4o6的结晶结构。
[0065]
(3)x射线衍射分析法
[0066]
将获得的结晶粉碎，制成10μm～30μm(-325目)的颗粒，填充到x-射线衍射分析用玻璃框(glass holder)(20mm
×
16mm
×
1mm)中后，用载玻片等进行压实后，使其变得平展，以使待测面和支撑面形成平衡，从而准备试样。利用xrd的cu kα1在2θ10
°
～50
°
的范围下以1
°
/min的速度(扫描步进0.02
°
)绘出结晶的x-射线衍射分光图。
[0067]
比较例1：六氧化四砷的制备
[0068]
准备由高岭土特殊制得的合成反应器(高100mm，直径190mm)和3～6个可安装过滤器的夹钳。在距离合成反应器50mm处设置1次夹钳，在所述1次夹钳的上方，以2～6mm为间隔设置2次～6次夹钳，此时，各个夹钳的规格为直径210mm及厚度10mm。
[0069]
将称量的400g～600g的粗盐(水分含量10％以下)加入到合成反应器中后，将其铺展均匀并压实，使厚度为20mm左右，以100℃～800℃缓慢加热3小时，并连续加热，使得反应器内部的盐表面温度成为290
±
30℃，以去除水分及杂质，并在室温下冷却5小时。
[0070]
将100g的作为原料物质的as2o3(纯度98％以上，制备公司yunnan wenshan jinchiarsenic co.,ltd.)放到合成反应器内的粗盐上，在合成器的上方安装3～6个夹钳，使得位于合成器上方的能够捕集升华的砷的过滤器(滤纸)与过滤器之间的间隔为2～6mm。此时使用的过滤器优选使用基本重量为70～100g/m2，厚度为0.17～0.25mm，过滤速度为22～30s/100ml，以及保留粒径为5～10μm的过滤器。
[0071]
利用夹钳固定过滤器，并在合成反应器的下部施加热量，从100℃阶段性地加热至1,000℃。首先，对合成反应器加热1小时，以使合成反应器下部的外部温度为350℃
±
100℃，然后，进行加热使得合成反应器的外部温度为600～650℃，以及700～1,000℃，总加热时间为5小时～10小时，以使得过滤器最上方滤纸的中心部温度维持在150℃
±
100℃，然后在常温下冷却5～7小时。在该过程中，放置在合成反应器中的盐上的as2o3粉末在合成反应器的内部变成气体上升后，由于合成反应器外部的上部温度相对要低，因此会变成液体，之后结晶成固体，从而在过滤器上生成白色结晶体。从过滤器中获取48.5g的结晶。对获取的砷化合物的结晶结构进行确认的结果为，99％以上为as4o
6-b，即大部分为as4o
6-b。
[0072]
比较例2～3六氧化四砷的制备
[0073]
将实施例1(多晶型物as4o
6-a为99％以上的组合物)和比较例1(多晶型物as4o
6-b为99％以上的组合物)分别以4：1及1：1的比例混合后，分别作为比较例2及比较例3。
[0074]
实验例1：抑制人肝癌(human liver cancer)细胞增殖效果实验
[0075]
(1)实验材料及细胞培养
[0076]
准备胎牛血清(fbs)和细胞培养基(hyclone公司)，并准备二甲基亚砜(dmso)和3-(4,5-二甲基-噻唑-2基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，mtt)(amresco llc，usc)。
[0077]
作为人癌细胞系，从中国科学研究院的上海细胞银行获得作为人肝癌细胞系(human hepatoma cells)smmc-7721细胞及hcclm3细胞。利用包含10％fbs、50u/ml的青霉素，以及50μg/ml的链霉素的rpmi-1640培养基对smmc-7721细胞在具有5％co2及95％的空气和湿气的状态的培养器中对细胞进行培养。利用包含10％fbs、100u/ml的青霉素，以及100μg/ml的链霉素的dmem(dulbecco's modified eagle's medium)培养基对hcclm3细胞在具有5％co2及95％的空气和湿气的状态的培养器中对细胞进行培养。培养基每3天更换一次。
[0078]
(2)细胞增殖实验(mtt实验)
[0079]
利用mtt实验来评价实施例1及比较例1～比较例3的细胞增殖效果。mtt实验是基于相对于mtt存活的细胞生成不溶性深蓝色甲臜反应物的能力的实验。通过使用胰蛋白酶进行处理而使细胞漂浮在培养基中而收集后，以4
×
103细胞/孔(cells/well)的密度接种到96孔培养皿(costar，剑桥，马萨诸塞州，美国)中。24小时后，将实施例1及比较例1～比较例3作为处理试样分别添加到包含含10％fbs的培养基的细胞中，以使实施例1及比较例1～比较例3成为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40或80μm，并进行培养。此时，实施例1及比较例1～比较例3利用了以5
×
10-2
m的浓度溶解到1m的氢氧化钠中的存储溶液。为了实施对于细胞增殖的mtt实验，从进行试样处理后培养48小时及72小时的细胞中去除上清液，在每孔(well)中添加20μl的5mg/ml的mtt溶液，然后，为了形成甲瓒结晶，在37℃下孵育4小时。在孵育之后，再次去除上清液，在所有的孔中以每孔100μl的量添加dmso，使深蓝色结晶完全溶解而混合。在室温下放置15分钟，以使所有的结晶完全溶解，在570nm(a
570
)波长下利用微型板仪器测定吸光度。
[0080]
(3)统计分析
[0081]
将未用试样进行处理的对照组的吸光度值计算为100，并校准(calibration)相对于对照组用试样处理的处理组的吸光度值，并根据下述公式计算细胞增殖抑制率。
[0082]
细胞增殖抑制率(％)＝((对照组细胞的平均吸光度-处理组细胞的平均吸光度)/对照组细胞的平均吸光度)
×
100
[0083]
所有的数据以平均
±
标准误差(means
±
sem)来表现。在进行单因素方差分析(one-way analysis of variance，anova)后，通过新复极差法事后检验(dunnett’s post-test)来进行多重比较。显著性水平为p＜0.05，各实验重复进行3次。
[0084]
(4)利用smmc-7721细胞的结果
[0085]
将实施例1及比较例1～比较例3对人肝癌细胞系smmc-7721细胞进行处理，然后培养48小时及72小时，进行mtt实验，将实验结果示于图2a和图2b中。用实施例1进行处理后培养48小时(图2a)及72小时(图2b)的所有的实验结果为，确认了与使用比较例1处理的情况相比对人肝癌细胞系smmc-7721细胞的增殖抑制率高。此外，与实施例1和比较例1以4：1混合的比较例2或以1：1混合的比较例3相比，确认了smmc-7721细胞的增殖抑制率高。
[0086]
(5)利用hcclm3细胞的结果
[0087]
将实施例1及比较例1～比较例3对人肝癌细胞系hcclm3细胞进行处理，然后培养
48小时及72小时，进行mtt实验，将实验结果示于图3a和图3b中。用实施例1进行处理后培养48小时(图3a)及72小时(图3b)的所有的实验结果为，确认了与使用比较例1处理的情况相比肝癌细胞系hcclm3细胞的增殖抑制率高。此外，与实施例1和比较例1以4：1混合的比较例2或以1：1混合的比较例3相比，确认了hcclm3细胞的增殖抑制率高。
[0088]
实验例2：人肝癌细胞系h22细胞移植动物模型中的体内药效试验
[0089]
(1)实验方法
[0090]
将人肝癌细胞系h22细胞(购自中国科学研究院上海细胞银行)在温度37℃，5％co2及95％的空气条件下的培养器中，利用包含10％fbs、100u/ml的青霉素，以及100μg/ml的链霉素的rpmi-1640培养基进行培养。培养基每3天更换一次。
[0091]
实验动物选用的是对特定病原菌及呼吸器官疾病安全的6周龄的体重为18～20g左右的icr雌性及雄性小鼠50只。使小鼠自由摄取食物和水，以12小时的黑天和12小时的白天为周期进行饲养。
[0092]
在50只小鼠中，10只被分为正常组，剩余的四十只以每只为1
×
107个h22细胞的量进行皮下接种，并饲养7天。在接种细胞7天后，使小鼠随机分组，每组为10只，并按照下述表3中那样分成实验组，每天对小鼠经口给药相应量的试样，共给药11天。将用作抗癌剂的5-氟尿嘧啶(5-fuorouracil，5-fu)作为阳性对照组来处理。
[0093]
表3
[0094][0095][0096]
(2)癌的生长抑制确认
[0097]
按照各个组别施用药物后，用游标卡尺(vernier caliper)每天测定癌的大小，利用式v＝0.5
×
ab2(a为癌的最长直径，b为癌的最短直径)计算癌的体积，并将其结果示于表4及图4中。此外，按照下述式计算出根据给药天数的癌的体积生长的抑制，并将其结果示于表5及图5中。
[0098]
癌的生长抑制率＝(1-(试样处理组)/癌模型组))
×
100
[0099]
表4
[0100][0101]
表5
[0102][0103]
从上述表4及图4中可知，与癌模型组相比，施用实施例1的实验组1及实验组2，癌的体积根据给药的时间而减小，癌的体积根据实施例1的给药量而减小。
[0104]
此外，从上述表5及图5中可以看出，使用实施例1进行处理时，癌的体积生长抑制率伴随给药时间而增加，可以确认施用了4.5mg/kg的实施例1的实验组1与施用了2.25mg/kg的实施例1的实验组2相比，癌的体积生长抑制率高。
[0105]
由此可知，本发明的实施例1能够抑制肝癌的生长。
[0106]
实验例3：人肝癌细胞系smmc-7721细胞移植动物模型中的体内药效试验
[0107]
(1)实验方法
[0108]
将人肝癌细胞系smmc-7721细胞(购自中国科学研究院上海细胞银行)在温度37℃，5％co2及95％的空气条件下的培养器中，利用包含10％fbs、50u/ml的青霉素，以及50μg/ml的链霉素的rpmi-1640培养基进行培养。培养基每3天更换一次。
[0109]
实验动物选用的是对特定病原菌及呼吸器官疾病安全的5周龄的体重为18～20g左右的babl/c-nu雌性裸鼠(nude mouse)25只。使裸鼠自由摄取食物和水，以12小时的黑天和12小时的白天为周期饲养7天。
[0110]
对25只裸鼠以每只为2
×
107个smmc-7732细胞的量进行颈部皮下接种，并饲养7天。在7天后，使小鼠随机分组，每组为5只，并按照下述表6中那样分成实验组，每天对小鼠经口给药相应量的试样，共给药7天。将用作抗癌剂的5-氟尿嘧啶作为阳性对照组来处理。
[0111]
表6
[0112]
组处理试剂癌模型组蒸馏水阳性对照组5-氟尿嘧啶-20mg/kg实验组1实施例1-4.5mg/kg实验组2实施例2-2.25mg/kg实验组3实施例1-1.125mg/kg
[0113]
(2)癌的生长抑制确认
[0114]
从按照各个组别施用药物7天后的小鼠中分离出癌组织，用肉眼观察癌组织，并称取癌的重量。此外，基于测定了癌生长抑制的癌组织的体积，根据下述式进行计算，并将其结果示于表7及图6中。
[0115]
癌的生长抑制率＝(1-(试样处理组)/癌模型组))
×
100
[0116]
表7
[0117]
[0118][0119]
从上述表7中可知，相比于癌模型组，确认了施用实施例1的实验组1～实验组3的癌的重量减少，癌的重量伴随实施例1的给药量而减小。此外，在图6中示出了癌组织的大小随着实施例1的给药而减小。
[0120]
由此可知，本发明的实施例1能够抑制肝癌的生长。

技术特征：
1.六氧化四砷(as4o6)组合物在制备用于预防或治疗肝癌的药物组合物中的用途，其中，所述六氧化四砷(as4o6)组合物包含99重量％以上的具有下述i至iii的特性的六氧化四砷的多晶型物a；i、单位细胞常数：α＝β＝γ＝90
°
，ii、as-o键长：iii、o-as-o键角：98.36
°
。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多晶型物a在x-射线粉末衍射分光图中，在光源波长为时，在衍射角2θ10
°
～50
°
的范围下，用1
°
/min的速度(扫描步进0.02
°
)表示的峰显示为13.84、27.88、32.32、35.3、39.84、42.38、46.34、48.6及49.34。

技术总结
本发明涉及一种六氧化四砷(As4O6)组合物在制备用于预防或治疗肝癌的药物组合物中的用途，其中，所述六氧化四砷(As4O6)组合物包含99％以上的具有下述i至iii的特性的六氧化四砷的多晶型物a；i、单位细胞常数：α＝β＝γ＝90


技术研发人员：裴日周 连增林
受保护的技术使用者：凯马斯株式会社
技术研发日：2017.03.06
技术公布日：2023/8/14