谷子抗白发病KASP分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用

谷子抗白发病kasp分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用
技术领域：
：1.本发明属于分子生物学
技术领域：
：，特别是涉及谷子抗白发病kasp分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用。
背景技术：
：：2.谷子（setariaitalica）在中国有8000多年的栽培历史，由于其籽粒中氨基酸和维生素的含量高于其它谷类作物，并且可以降低糖尿病及其它心血管疾病的风险，几千年来一直被作为主食作物在我国栽培。同时以其较高的产量和在不利的农业经济条件下生长的能力而闻名世界，逐渐成为世界上主要的杂粮作物之一，也被认为是全球气候急剧变化情况下最具发展潜力的作物之一。3.由专性的生物营养卵菌-禾生指梗霉菌引起的（sclerosporagraminicola，sacc.）schroeter霜霉病是一种危害谷子、珍珠粟等禾谷类作物的严重病害，在印度、中国、日本和非洲国家等地区均有发生，尤其是在干旱和半干旱地区，严重影响禾本科作物的产量和质量，是农业生产的一大不利因素。4.目前，谷子白发病抗性机理的研究主要集中在生理生化方面，主要包括β-1,3-葡聚糖酶、富含羟脯氨酸的糖蛋白、超氧化物歧化酶和苯丙氨酸解氨酶等。转录组分析表明，接种s.graminicola后，抗病品种中r基因、pr蛋白、过敏性坏死反应相关基因和植物激素信号转导途径相关基因上调表达；而s.graminicola成功侵染谷子后，会导致谷子叶片黄化，叶绿素结构破坏，光系统相关基因表达下调，最终影响谷子的产量。珍珠粟抗霜霉病qtl位点的鉴定目前已有报道。通过构建抗、感品种杂交群体，已在连锁群lg1、lg2、lg4上检测到抗性qtl位点；gulia等利用rflp和ssr标记对珍珠粟进行了抗霜霉病qtl定位，确定了9个可能的主效抗霜霉病qtl；taunk等人的研究同样将抗霜霉病qtl位点定位于lg1或lg4上。珍珠粟是一种高度异花授粉的二倍体c4植物（2n=14），而作为s.graminicola另一种重要寄主的谷子是二倍体自花授粉作物，9对染色体（2n=18），谷子白发病抗性qtl位点是否与珍珠粟一致还需要进一步研究。5.kasp技术是由英国lgc公司开发的新一代高通量自动化snp检测技术，现已成为国际上snp分型以及插入缺失变异检测的主要方法之一。其基本程序是：利用带有两种通用标签并连接snp位点的两条正向引物和一条反向引物构成primermix。带有不同荧光信号的两条检测引物mastermix，经三次pcr反应进行snp位点荧光检测。同其他检测技术相比，kasp技术只需合成两个带有不同颜色的荧光基团和双链通用的探针，不需要针对每个snp位点分别设计荧光探针，具有高通量、准确、省时、便捷、低成本的特点，实现了更加灵活的检测，已成功用于超过100多个物种的基因分型、遗传多样性分析、指纹图谱构建等方面。目前，尚未有针对谷子抗白发病的kasp分子标记的开发及应用的相关研究，因此，谷子抗白发病kasp分子标记的研究对谷子抗病材料的鉴定及谷子抗病育种具有重要的意义。技术实现要素：6.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种谷子抗白发病kasp分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用，本发明使用从不同地域分离的谷子白发病菌菌株对开发的ssr引物进行pcr鉴定，所获扩展序列多态性高、测定结果真实可靠。7.本发明的目的是提供谷子抗白发病kasp分子标记引物，包括9对引物对，所述引物对的序列如：seqidno.1～3、seqidno.4～6、seqidno.7～9、seqidno.10～12、seqidno.13～15、seqidno.16～18、seqidno.19～21、seqidno.22～24、seqidno.25～27所示。8.本发明的另一目的是提供一种谷子抗白发病kasp分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用。9.本发明提供的谷子抗白发病kasp分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用，包括如下步骤：步骤一：提取不同品种谷子叶片材料的dna；步骤二：用权利要求1所述seqidno.1～seqidno.27所示的引物对步骤一提取的dna进行竞争性等位基因特异性pcr（kasp）；步骤三：使用荧光定量pcr仪读取步骤二所得扩增产物的荧光信号值；步骤四：根据荧光信号值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇确定基因型，对谷子品种进行抗病性分析。10.进一步地，竞争性等位基因特异性pcr扩增的体系为10μl：higeno2×ꢀprobemix5μl，引物混合物0.14μl，ddh2o3μl，10ng·μl-1dna1.86μl；其中，引物混合物由下述引物混合得到：100μmkasp-f1引物12μl、100μmkasp-f2引物12μl、100μmkasp-r引物30μl、ddh2o46μl。11.进一步地，所述pcr扩增的程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61-55℃退火和延伸40s，10个循环，每个循环退火和延伸的温度依次降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火和延伸40s，30次循环。pcr扩增循环结束后，在终点荧光模式下，利用荧光定量pcr仪读取荧光信号值并保存。12.本发明还提供了一种谷子抗白发病检测试剂盒，包括本发明所述的谷子抗白发病kasp分子标记引物。13.本发明提供的谷子抗白发病检测试剂盒，还包括higeno2×ꢀprobemix和基因组提取试剂。14.本发明提供所述的谷子抗白发病检测试剂盒在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用。15.本发明与现有技术相比，其有益效果为：16.本发明利用群体表型和生物信息学方法从谷子基因组中挖掘抗白发病基因并筛选优异单倍型，开发kasp抗病分子标记，克服了谷子抗白发病分子标记获取困难的技术问题；本发明使用从ril群体中获取抗病优异单倍型位点，并开发kasp分子标记在自然群体中进行验证，测定结果真实可靠；本发明获取谷子kasp抗病分子标记引物的方法简单，操作简便，获得的分子标记真实可靠，为谷子抗感品种鉴定及谷子抗病育种奠定基础。附图说明17.图1为本发明中ril群体变异检测bin标记图；图2为本发明qtl定位遗传图谱；图3a为本发明候选基因seita.8g193500在rils群体中单倍型分析结果图；图3b为本发明候选基因seita.8g193700在rils群体中单倍型分析结果图；图3c为本发明候选基因seita.8g194100在rils群体中单倍型分析结果图；图3d为本发明候选基因seita.8g195000在rils群体中单倍型分析结果图；图3e为本发明候选基因seita.8g195900在rils群体中单倍型分析结果图；图3f为本发明候选基因seita.8g198300在rils群体中单倍型分析结果图；图3g为本发明候选基因seita.8g199300在rils群体中单倍型分析结果图；图3h为本发明候选基因seita.8g199800在rils群体中单倍型分析结果图；图3i为本发明候选基因seita.8g199900在rils群体中单倍型分析结果图；图3j为本发明候选基因seita.8g200400在rils群体中单倍型分析结果图；图4为本发明抗病qtl基因簇位置分布图；图5a为本发明seita.8g199800在34,589,536bp位置处自然群体抗、感品种中的基因分型结果图及不同基因型对应的发病率表型值；图5b为本发明seita.8g199800在34,589,829bp位置处自然群体抗、感品种中的基因分型结果图及不同基因型对应的发病率表型值；图6a为本发明seita.8g195900在34,288,211bp位置处自然群体抗、感品种中的基因分型结果图及不同基因型对应的发病率表型值；图6b为本发明seita.8g195900在34,288,905bp位置处自然群体抗、感品种中的基因分型结果图及不同基因型对应的发病率表型值；图6c为本发明seita.8g195900在34,288,968bp位置处自然群体抗、感品种中的基因分型结果图及不同基因型对应的发病率表型值；图6d为本发明seita.8g195900在34,293,919bp位置处自然群体抗、感品种中的基因分型结果图及不同基因型对应的发病率表型值；图7为本发明seita.8g198300在34,450,614bp位置处自然群体抗、感品种中的基因分型结果图及不同基因型对应的发病率表型值；图8a为本发明seita.8g199300在34,528,861bpbp位置处自然群体抗、感品种中的基因分型结果图及不同基因型对应的发病率表型值；图8b为本发明seita.8g199300在34,528,872bp位置处自然群体抗、感品种中的基因分型结果图及不同基因型对应的发病率表型值；具体实施方式18.下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。19.本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。20.本发明使用dnaman软件针对snp位点两侧的序列进行kasp引物设计，包括两条特异性正向引物和一条通用反向引物，三条引物构成primermix。根据higeno2xprobemix预混液开发商推荐的标准，引物设计需遵循以下原则：（1）单条引物内部不能出现连续5个及以上的碱基序列互补，同时引物3'端连续的4个及以上碱基序列不能与引物内部的其他序列互补；（2）正向引物与反向引物之间不能出现连续6个及以上的碱基互补序列，而且正向或反向引物3'端连续的5个及以上的碱基不能与另外一条引物序列互补；（3）两个正向引物的退火温度（tm）在59˚c-65˚c之间，以61˚c-63˚c最适；反向引物tm值在62˚c-65˚c之间；（4）正向引物长度不小于19bp，反向引物长度不小于20bp；（5）pcr预扩增产物长度小于120bp。两条特异性正向引物3'末端碱基为snp位点变异碱基，引物设计完成后需在其5'端分别加上荧光标签fam(gaaggtgaccaagttcatgct)和hex(gaaggtcggagtcaacggatt)序列，用于基因分型。荧光引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；再用80份自然群体的抗、感谷子品种dna为模板进行基因分型（如表1所示）。21.表180份自然群体材料抗性分级table1resistanceclassificationof80foxtailmilletnaturalpopulationvarieties22.本发明9对引物对的序列如下：kasp1引物对的序列如下（seita.8g195900）：kasp1-f1：5'-gctgctttggaagagtatgaacattag-3'（seqidno.1），kasp1-f2：5'-gctgctttggaagagtatgaacattaa-3'（seqidno.2），kasp1-r：5'-gtaaccttaatagcaagaggaaggcc-3'（seqidno.3）；kasp2引物对的序列如下（seita.8g195900）：kasp2-f1：5'-acaatctggaatactttgtatagttgaat-3'（seqidno.4），kasp2-f2：5'-acaatctggaatactttgtatagttgaac-3'（seqidno.5），kasp2-r：5'-acggactttgcttattcgcttt-3'（seqidno.6）；kasp3引物对的序列如下（seita.8g195900）：kasp3-f1：5'-ttgatccatttacggttgcttaatct-3'（seqidno.7），kasp3-f2：5'-gatccatttacggttgcttaatcc-3'（seqidno.8），kasp3-r：5'-ccctgcaagctcaatacctgaa-3'（seqidno.9）；kasp4引物对的序列如下（seita.8g195900）：kasp4-f1：5'-gttgagagacgcatggttaggtg-3'（seqidno.10），kasp4-f2：5'-ggttgagagacgcatggttaggta-3'（seqidno.11），kasp4-r：5'-tggacatgtatgcagtaattctggag-3'（seqidno.12）；kasp5引物对的序列如下（seita.8g198300）：kasp5-f1：5'-ggagcttgccatcttcaaattc-3'（seqidno.13），kasp5-f2：5'-ggagcttgccatcttcaaattg-3'（seqidno.14），kasp5-r：5'-ctgccgaacctcactaaactgaa-3'（seqidno.15）；kasp6引物对的序列如下（seita.8g199300）：kasp6-f1：5'-cactgaggtactggatagaggagaga-3'（seqidno.16），kasp6-f2：5'-cactgaggtactggatagaggagagc-3'（seqidno.17），kasp6-r：5'-gacatcggttactttactgggctg-3'（seqidno.18）；kasp7引物对的序列如下（seita.8g199300）：kasp7-f1：5'-acatgatccacaagagtgatgagatat-3'（seqidno.19），kasp7-f2：5'-acatgatccacaagagtgatgagatac-3'（seqidno.20），kasp7-r：5'-caagagtttggagagaataaccactg-3'（seqidno.21）；kasp8引物对的序列如下（seita.8g199800）：kasp8-f1：5'-ggatcgccaggtgaagtcttt-3'（seqidno.22），kasp8-f2：5'-gatcgccaggtgaagtcttg-3'（seqidno.23），kasp8-r：5'-cgtgcttcggggatacatagg-3'（seqidno.24）；kasp9引物对的序列如下（seita.8g199800）：kasp9-f1：5'-cccctccacatctccgtaga-3'（seqidno.25），kasp9-f2：5'-cccctccacatctccgtagc-3'（seqidno.26），kasp9-r：5'-cctcacttcgatggacaggaaag-3'（seqidno.27）。23.实施例1ril群体简化基因组变异检测田间剪取双亲及群体每个株系的叶片1-2g，液氮速冻并采用十六烷基三甲基溴化铵法（ctab）提取谷子基因组dna，经用1%琼脂糖凝胶[(w/v)％，1g琼脂糖加100ml0.5*tbe缓冲液]电泳检测后，使用kasp特异性引物对80份dna模板进行基因分型扩增，pcr扩增体系为10μl：higeno2×ꢀprobemix5μl，引物混合物0.14μl，其中，引物混合物由下述引物混合得到：100μmkasp-f1引物12μl、100μmkasp-f2引物12μl、100μmkasp-r引物30μl、ddh2o46μl;[0024]dna模板1.86μl10ng·μl-1，ddh2o3μl。[0025]pcr扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61-55℃退火和延伸40s，10个循环（每个循环退火和延伸的温度依次降低0.6℃）；95℃变性20s，55℃退火和延伸40s，30次循环。反应结束后进行荧光拍照并保存。[0026]委托深圳市华大农业应用研究院构建158个rils株系和双亲的文库。以豫谷1号“setariaitalicav2.2”（https://data.jgi.doe.gov/refine-download/phytozome?organism=sitalica&expanded=312）为参考序列进行变异检测，各reads比对到参考基组的平均比对率为96.68%，平均覆盖度为22.23，平均覆盖深度为5.8x（如表2所示）。经gatk过滤，最终获得76,210个变异位点，其中8号染色体密度最大，平均每100kb存在52.02个snp位点，密度最小的是1号染色体，平均每100kb仅只10.09个snp（如表3所示）。使用annovar对获得的snp及indel位点进行注释，其中有49,026个snp（70%），3,190个indel（54%）落在基因间隔区，有5,043个snp（7%）和240个indel（4%）落在外显子区域；进一步统计5,043个外显子上的snp，有2,750个为非同义突变，2,251个为同义突变，41个启动子丢失，2个终止子丢失（如表4所示）。[0027]表2测序数据比对情况统计表table2statisticaltableofsequencingdatacomparison[0028]表3遗传群体变异检测统计表table3statisticaltableofgeneticpopulationvariationdetection[0029]表4变异位点注释情况统计表table4statisticaltableofvariationsiteannotation[0030]实施例2谷子白发病抗性qtl定位[0031]采用perl程序构建rils群体bin基因型图。根据母本g1和父本jg21中差异snp以及rils群体中的变异序列来进行连锁分析，映射到相同位置的一组标记构成一个bin标记，最终共获得2,432个bin标记，遗传图谱总长7,940.21cm，每个标记间平均遗传距离为3.27cm（如图1和表5所示）。[0032]使用qtlicimapping的bin、map模块对2,432个bin标记进行分析，去除冗余标记后构建了一个包含1,031个bin标记的遗传图谱（如图2所示），9条染色体上均有分布，其中9号染色体遗传距离最长，为173.89cm，4号染色体遗传距离最短，仅87.51cm，图谱总图距为1,041.66cm，平均每两个标记之间的遗传距离为1.01cm，其中8号染色体标记密度最大，平均标记间距0.84cm（如表6所示）。[0033]表5bin标记信息统计表table5theinformationofbinmarkers[0034]表6遗传连锁群信息table6theinformationofgeneticlinkagegroup[0035]利用qtlicimapping的bip模块，结合基因型和不同环境下rils群体抗病性表型进行qtl定位分析，在lod阈值设定为2.5，在4个环境中共检测到9个谷子白发病抗性qtl位点（如表7所示）。在2020tg组中，分别在谷子3、6、8号染色体的c3m255-c3m262、c6m54-c6m55、c8m257-c8m258标记区间检测到3个qtl位点，命名为qdm3_1、qdm6_1、qdm8_1，lod值分别为4.31、3.29、11.09，可解释8.92%、7.05%、26.16%的表型变异；在2021tg组中，仅在8号染色体的c8m266-c8m268的标记区间检测到1个qtl位点，qdm8_2，位于标记c8m266-c8m268间，lod值为13.13，可解释33.34%的表型变异；在2021dt组中，分别在2、5、8号染色体的c2m75-c2m76、c5m162-c5m164、c8m10-c8m11、c8m260-c8m265标记区间检测到4个qtl位点；命名为qdm2_1、qdm5_1、qdm8_3、qdm8_4，lod值分别为2.69、3.00、2.58、12.01，可解释5.29%、5.86%、5.22%、27.16%的表型变异；在2021yc组中，分别在3、8号染色体的c3m217-c3m219、c8m260-c8m265标记区间检测到2个qtl位点，命名为qdm3_2、qdm8_4，lod值分别为2.88、6.33，可解释7.78%、18.14%的表型变异，其中qdm8_4分别在2021yc、2021dt两组试验中被同时检测到（如表7所示）。[0036]表7不同环境下qtl位点统计分析table7statisticalanalysisofqtllociindifferentenvironments[0037]实施例3候选基因单倍型分析[0038]利用candihap软件结合slaf测序数据，对功能注释关联到的27个与抗病相关候选基因（如表8所示）在构建的rils群体中进行单倍型分析（如图3所示）。结果发现，27个候选基因中有10个基因存在等位变异位点，均为nbs-lrr基因，在8号染色体c8m257-c8m268标记区间0.78mb范围内成串排列，可能为1个潜在抗病基因簇（如图4所示）。在10个nbs-lrr基因中，seita.8g194100存在5种单倍型，其余基因有2-4个单倍型；共检测到42个snp突变及2个indel突变，其中21个突变分别位于upstream、intronic、5’utr、3’utr区域，21个突变在外显子区段，包括9个同义突变snp及12个非同义突变snp，其中12个非同义突变snp分布于seita.8g195900、seita.8g198300、seita.8g199300、seita.8g1998004个基因上。[0039]表8qtl区间基因功能注释table8functionalannotationofqtlintervalgenes[0040]实施例4候选基因在自然群体中基因分型验证[0041]为验证所筛选12个与抗病相关的非同义突变snp在自然群体中的多态性，运用kasp基因分型技术在80个谷子白发病不同抗性品种中进行了分析，结果表明：在seita.8g199800基因上基于4个snp位点开发的kasp标记有2个在抗、感自然群体中存在明显分型。19个抗病品种在34,589,536bp位置的snp为t/t型，3年平均发病率为0.91%，而32个易感品种在该位置的snp为g/g型，3年平均发病率为62.77%；16个抗病品种在34,589,829bp位置的snp为g/g型，3年平均发病率为1.01%，35个易感品种该位置的snp为t/t型，3年平均发病率为64.54%，推测这两个位点可能为优异等位变异基因位点（如图5所示）。另外在seita.8g195900基因上基于4个snp位点开发的kasp标记在自然群体中也存在明显分型，在34,288,211bp、34,288,905bp、34,288,968bp处，基因型为g/g、a/a、c/c品种的发病率显著低于a/a、g/g、c/c的品种；而在34,293,919bp处，由于g突变为a，使得三联密码子tgg突变为终止密码子tag，导致携带a/a等位基因的品种对禾生指梗霉更敏感（如图6所示）。seita.8g198300基因34,450,614bp处携带c/c等位基因株系相较于g/g更抗病（如图7所示），seita.8g199300基因在34,528,861bp、34,528,872bp处，基因型为a/a的品种发病率较低（如图8所示）。[0042]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.谷子抗白发病kasp分子标记引物，包括9对引物对，所述引物对的序列如：seq id no.1～3、seq id no.4～6、seq id no.7～9、seq id no.10～12、seq id no.13～15、seq id no.16～18、seq id no.19～21、seq id no.22～24、seq id no.25～27所示。2.权利要求1所述的谷子抗白发病kasp分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用。3.根据权利要求2所述的谷子抗白发病kasp分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：提取不同品种谷子叶片材料的dna；步骤二：用权利要求1所述seq id no.1～seq id no.27所示的引物对步骤一提取的dna进行竞争性等位基因特异性pcr；步骤三：使用荧光定量pcr仪读取步骤二所得扩增产物的荧光信号值；步骤四：根据荧光信号值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇确定基因型，对谷子品种进行抗病性分析。4.根据权利要求3所述的谷子抗白发病kasp分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用，其特征在于，竞争性等位基因特异性pcr扩增体系为10μl：higeno 2
×ꢀ
probe mix 5μl，引物混合物 0.14μl，ddh2o 3μl，dna 1.86μl 10ng
·
μl-1
；其中，引物混合物由下述引物混合得到：100μm kasp-f1引物12μl、100μm kasp-f2引物12μl、100μm kasp-r引物30μl、ddh2o 46μl。5.根据权利要求3所述的谷子抗白发病kasp分子标记引物在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用，其特征在于，所述pcr扩增的程序为95℃预变性 10min；95℃变性 20s，61-55℃退火和延伸40s，10个循环，每个循环依次降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火和延伸 40s，30次循环。6.谷子抗白发病检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的谷子抗白发病kasp分子标记引物。7.根据权利要求6所述的谷子抗白发病检测试剂盒，其特征在于，还包括higeno 2
×ꢀ
probe mix和基因组提取试剂。8.权利要求6或7所述的谷子抗白发病检测试剂盒在对不同品种谷子抗白发病分析中的应用。

技术总结
本发明公开了一种谷子抗白发病KASP分子标记引物、谷子抗白发病检测试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。本发明的谷子抗白发病KASP分子标记引物包括9对引物对，所述引物对的序列如：SEQ ID No.1～SEQ ID No.27所示。本发明利用群体表型和生物信息学方法从谷子基因组中挖掘抗白发病基因并筛选优异单倍型，开发KASP抗病分子标记，克服了谷子抗白发病分子标记获取困难的技术问题；本发明使用从RILs群体中获取抗病优异单倍型位点，并开发KASP分子标记在自然群体中进行验证，测定结果真实可靠；本发明获取谷子KASP抗病分子标记引物的方法简单，操作简便，获得的分子标记真实可靠，为谷子抗感品种鉴定及谷子抗病育种奠定基础。谷子抗感品种鉴定及谷子抗病育种奠定基础。谷子抗感品种鉴定及谷子抗病育种奠定基础。


技术研发人员：张宝俊 刘旭 孙玉荣 张诺 张天瀚 王金叶 王雪 韩渊怀
受保护的技术使用者：山西农业大学
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/14