烯丙雌醇在提高胚胎体外发育质量上的应用

1.本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一种烯丙雌醇在提高胚胎体外发育质量上的应用。


背景技术：

2.卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,ivm)技术，在农业科学、人类辅助生殖医学以及生物医学等生命科学领域有着十分重要的应用价值。随着近年来不孕不育症的发生率逐年增高，卵母细胞体外成熟是一项新的辅助生殖技术，是指应用少量促性腺激素或者不经过促排卵而直接从卵巢中获取体内未成熟的卵子，经过适当条件的体外培养，促使卵子成熟并具备受精能力，可以因减少刺激或无刺激而降低常规体外受精(ivf)中促排卵过程的高额费用，降低常规促排卵药物引起的卵巢过渡刺激综合征等不良反应的发生率。同时，在农业生产上，使用成熟的卵母细胞作为受体细胞，使用来自活体动物的体细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术可产生大量具有相同遗传信息的后代。这意味着，优秀的种用动物能被短时间内产生大量的克隆个体，扩大生产价值。此外，在科学研究中，体外受精胚胎、孤雌胚胎、体细胞克隆胚胎是一种十分重要的研究材料，对人们理解生命的发生和重编程的机制有着重要的作用。由于体内成熟的卵母细胞数量有限、获取成本高及技术难度大，无法在实际生产和科学研究中大规模应用。相比之下，低成本、可大量获得成熟卵母细胞的ivm技术在实际应用中愈发重要。而卵母细胞体外成熟培养，又是体外获得胚胎的基础，因而如果卵母细胞体外成熟质量可以提高，那么胚胎体外获得和培养的质量也会得到提高，进而可将制备的优质胚胎与其产生的动物用于医学、生命科学、畜牧业等领域的研究，进一步推进生产实践的发展。
3.烯丙雌醇(allylestrenol)在医学上常用于治疗先兆流产、习惯性流产和先兆早产。烯丙雌醇的作用是孕酮的数倍，可使胎盘滋养层的内分泌活性增加，促进内源性孕酮及hcg的分泌，可刺激功能不佳的胎盘，使胎盘功能正常化。但是关于烯丙雌醇与胚胎体外发育的关系却未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种烯丙雌醇作为添加剂或含有烯丙雌醇的培养液在提高胚胎体外发育质量上的应用及提高胚胎体外发育质量的方法，以解决胚胎体外发育的质量问题。
5.根据本发明的第一个方面，提供了一种烯丙雌醇在提高胚胎体外发育质量上的应用。由此，制备的优质胚胎与其产生的动物可用于医学、生命科学、畜牧业等领域的研究，可进一步推进生产实践的发展。
6.在某些实施方式中，该胚胎为体细胞克隆胚胎或孤雌生殖胚胎或体外受精胚胎。
7.在某些实施方式中，该胚胎为猪胚胎。
8.根据本发明的第二个方面，提供了一种含有烯丙雌醇的培养液，该培养液的组分
包括：以tcm-199基础培养液为基础，补充添加0.6mm半胱氨酸，0.1iu/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1iu/ml孕马血清促性腺激素，10％胎牛血清，10％卵泡液及烯丙雌醇。
9.在某些实施方式中，该烯丙雌醇浓度为10-6-10-3
mol/l。
10.在某些实施方式中，该烯丙雌醇浓度为10-5
mol/l。
11.根据本发明的第三个方面，提供了一种含有烯丙雌醇的培养液在卵母细胞体外成熟培养中的应用。
12.根据本发明的第四个方面，提供了一种含有烯丙雌醇的培养液在提高胚胎体外发育质量上的应用。
13.在某些实施方式中，该胚胎为体细胞克隆胚胎或孤雌生殖胚胎或体外受精胚胎。
14.根据本发明的第五个方面，提供了一种提高胚胎体外发育质量的方法，该方法是通过将含有烯丙雌醇的培养液用于卵母细胞的体外培养，然后将体外培养成熟的卵母细胞用于体外胚胎的构建，通过提高体外培养卵母细胞的质量，进而提高胚胎体外发育的质量。
15.本技术的有益效果：公开了一种烯丙雌醇作为添加剂或含有烯丙雌醇的培养液在提高胚胎体外发育质量上的应用及提高胚胎体外发育质量的方法。通过该应用或者该方法，可以提高卵母细胞体外成熟质量。通过提高卵母细胞体外培养的质量，进而应用在卵母细胞体外成熟、体细胞克隆技术、孤雌胚胎、体外受精、辅助生殖等领域上。一方面能促进各物种卵母细胞的体外成熟，并能制备质量更优的体外受精胚胎和克隆胚胎，有助于人类辅助生殖的卵母细胞体外成熟培养；另一方面制备的优质胚胎与其产生的动物用于医学、生命科学、畜牧业等领域的研究，进一步推进生产实践的发展。
附图说明
16.图1为体内成熟时期卵泡液(pmff)、体内未成熟时期卵泡液(piff)、体外成熟时期培养液(pmm)和体外未成熟时期培养液(pim)中烯丙雌醇(allylestrenol)的相对含量，其图中不同上标字母表示p《0.05差异显著。
具体实施方式
17.下面结合附图对发明作进一步详细的说明。
18.1、猪卵母细胞体外成熟培养液的配制
19.为研究烯丙雌醇在卵母细胞的体外成熟中的作用，配制如下培养液：
20.a.基础成熟培养液(对照组)：以tcm-199基础培养液为基础，补充添加0.6mm半胱氨酸，0.1iu/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1iu/ml孕马血清促性腺激素，10％(v/v)胎牛血清，10％(v/v)屠宰场来源的猪卵泡液。
21.b.烯丙雌醇成熟培养液：在基础成熟培养液中分别补充10-6
mol/l、10-5
mol/l、10-4
mol/l、10-3
mol/l的烯丙雌醇。
22.2、卵母细胞的体外成熟培养
23.从3mm-8mm的卵泡中抽出卵母细胞，挑选胞质均匀，并具有三层以上卵丘细胞的卵丘细胞-卵母细胞复合体(cocs)，分别置于含有卵母细胞体外成熟培养液的四孔板中，然后转移至38.5℃培养箱中培养。44h后，使用透明质酸酶处理卵丘细胞-卵母细胞复合体，弃去卵丘细胞，挑选出具有极体，且胞质均匀、形状正常的成熟卵母细胞备用。
24.将新鲜猪cocs置于体外成熟培养液(如“1、猪卵母细胞体外成熟培养液的配制”中对照组培养液)，然后收集该时期ivm培养液(pim)到冷冻储存管中，立即在液氮中淬灭5min保存-80℃备用。将猪cocs在体外培养44h后，收集该时期ivm培养液(pmm)到离心管中，3000rpm离心5min，立即将上清液转移到冷冻管中液氮淬灭5min后保存-80℃备用。ivm是指体外成熟培养。
25.3、猪卵泡液的采集
26.(1)体内成熟时期卵泡液(pmff)的采集
27.对一批体成熟(约10月龄)后的后备杜洛克母猪口服烯丙孕素，每只母猪每日一次，一次20mg，连续饲喂18天。42h后注射1000iu注射用血促性素。80h后开始查情，当同期发情处理的母猪阴户红肿，阴门处有黏液流出，且按背有呆立不动、弓背、双耳竖起等表现时，表明即将排卵。
28.24h后对母猪进行手术。先对母猪进行麻醉，麻醉后使用呼吸式麻醉机维持母猪的状态，为了避免母猪窒息，应用手术钳将母猪的舌头拉出。在母猪最后面的第二对乳头中间划开约15cm长的刀口。沿着两侧子宫，充分暴露卵巢位置，观察卵巢是否有排卵点。
29.若有排卵点，则代表母猪正在排卵，此时对卵巢的主要血管进行结扎，然后摘出卵巢，放入含有37℃dpbs的10cm培养皿上。然后将母猪脏器归位，缝合后用碘伏消毒。用dpbs充分洗去卵巢表面的血液后，使用10ml带粉色的注射器抽出直径超过1.0cm卵泡的卵泡液，置于15ml离心管中，在37℃的金属浴台上静置10min。取出上清液置于15ml离心管中，在冰上继续静置20min；此前的离心管沉淀加入10ml dpbs重悬，继续置于37℃金属浴台上备用。然后，再一次取出上清液置于1.5ml离心管中，1500rpm离心5min。最后吸出上清液打入冻存管中，保存在液氮中备用。
30.若无排卵点则将母猪的脏器归位，缝合后用碘伏消毒。
31.(2)体内未成熟时期卵泡液(piff)的采集
32.对一批体成熟(约10月龄)后的后备杜洛克母猪进行手术，手术程序参考“(1)体内成熟时期卵泡液(pmff)的采集”。待卵巢暴露后，观察卵巢上的卵泡是否有充血膨大等情况，若无则按“(1)体内成熟时期卵泡液(pmff)的采集”的程序摘出卵巢并获取其中的卵泡液。最终保存在液氮中备用。
33.将pim、pmm、pmff和piff进行非靶向代谢组学检测，经过生信分析后，检测出烯丙雌醇在pim、pmm、pmff和piff中的相对表达量。烯丙雌醇在体内成熟前后的卵泡液和体外成熟前后的培养液中的含量结果如图1所示：表明在pmff中烯丙雌醇相对含量显著高于其他组，说明在体内成熟时期卵泡液中烯丙雌醇会大量表达，推测烯丙雌醇有助于卵母细胞的成熟，进而进行后续实验研究。
34.4、猪胚胎的构建及胚胎体外培养
35.a.猪克隆胚胎的构建：提前准备1板6cm培养皿的供体细胞，在细胞长至80％～90％时，吸弃培养液，用dpbs清洗液轻柔清洗2次，然后加入预热的胰蛋白酶消化液，在超净工作台内向孔中加入1ml细胞培养液，用移液枪吹打培养皿底数次，然后将细胞悬液转至15ml离心管中，800rpm离心5min。弃上清，加入1ml培养液，用移液枪吹打使细胞重悬备用。
36.对获得的体外成熟卵母细胞进行去核处理，然后在显微镜下挑选形态较好的供体细胞注入卵母细胞的间隙中，待所有去核的卵母细胞都注射完毕，进行融合激活。设置电融
合仪参数为50v、50μs、2dc，采用融合－激活液清洗电融合槽，加入融合激活液500μl，转移10枚注核卵至电融合槽内，用玻璃细针转动使卵受体－核供体轴线与电极相垂直，进行融合激活。
37.b.猪孤雌胚胎的构建：将获得的体外成熟卵母细胞，放入电激活液中平衡约2min，然后放入加有预先预热好的电激活液的融合槽中，100v、100μs、2dc激活卵母细胞。激活的卵母细胞在pzm胚胎培养液，清洗3遍后放入加有pzm培养液的四孔板中培养。
38.pzm培养液成分如下：nacl 108.00mm、kcl 10.00mm、kh2po40.35mm、mgso4·
7h2o 0.40mm、nahco325.07 mm、na-pyruvate 0.20mm、ca-(lactate)2.00mm、hypotaurine 5.00mm、l-glutamine 1.00mm、必需氨基酸20ml/l、非必需氨基酸10ml/l。
39.c.胚胎体外培养：胚胎构建好后，将胚胎置于放有pzm培养液的四孔板中，转至38.5℃的饱和湿度培养箱中继续培养，分别在培养48h、168h后记录数据。
40.5、实验结果
41.(1)不同浓度烯丙雌醇对卵母细胞体外成熟的影响
42.对于卵母细胞的体外成熟，其成熟率作为一个衡量卵母细胞质量的重要标准之一。所谓成熟率，即卵母细胞排出第一极体的比率。本发明也相应完成该部分实验的验证。卵母细胞体外成熟培养实验分为：对照组(即烯丙雌醇浓度为0)、实验组(烯丙雌醇浓度分别为10-6
、10-5
、10-4
、10-3
mol/l)，具体培养液的配制见“1、猪卵母细胞体外成熟培养液的配制”。结果表明：培养液中添加烯丙雌醇可以提高卵母细胞体外成熟率，最佳浓度组(10-4
mol/l)能使卵母细胞成熟率提高7.76％，其他浓度也得到了不同程度的提高(见表1)：
43.表1烯丙雌醇处理组卵母细胞成熟率
[0044][0045]
注：同一列不同上标字母表示p《0.05差异显著。
[0046]
由此可见，在卵母细胞体外成熟培养液中添加烯丙雌醇，可以提高卵母细胞体外成熟率。
[0047]
(2)不同浓度烯丙雌醇处理后的成熟卵母细胞对胚胎体外培养的影响
[0048]
关于卵母细胞体外成熟过程补充烯丙雌醇对卵母细胞质量的影响。采用添加了烯丙雌醇的“烯丙雌醇成熟培养液(见“1、猪卵母细胞体外成熟培养液的配制”)”培养卵母细胞，并将经烯丙雌醇处理过的成熟卵母细胞制备成体细胞克隆胚胎，并将克隆胚胎进行体外培养。结果表明：相对对照组，10-5
mol/l烯丙雌醇组囊胚率提高了48.50％，囊胚平均细胞数提高了98.99％；此外，补充其他浓度的烯丙雌醇也在不同程度上提高克隆胚胎的囊胚率及囊胚细胞数。详细结果见下表2：
[0049]
表2烯丙雌醇处理组卵母细胞对克隆胚胎的影响结果
[0050][0051]
注：同一列不同上标字母表示p《0.05差异显著。
[0052]
根据上述结果，10-5
mol/l烯丙雌醇组在克隆胚胎实验中为最佳浓度组，可显著提高克隆胚胎的囊胚率和囊胚细胞数。而囊胚率和囊胚细胞数是反应胚胎体外发育质量的重要指标：囊胚率越高，胚胎发育效率越高；囊胚细胞数越高，胚胎发育质量越好。
[0053]
因此，本发明进一步验证了采用10-5
mol/l烯丙雌醇处理后卵母细胞对其孤雌胚胎的影响。在孤雌胚胎实验中，相对对照组，10-5
mol/l烯丙雌醇组卵裂率提高了8.36％，孤雌胚胎的囊胚率提高了11.94％，囊胚平均细胞数提高了28.64％。详细结果见下表3：
[0054]
表3烯丙雌醇处理组卵母细胞对孤雌胚胎的影响结果
[0055][0056]
注：同一列不同上标字母表示p《0.05差异显著。
[0057]
由此可见，添加浓度为10-5
mol/l的烯丙雌醇处理过的成熟卵母细胞制备的孤雌胚胎，其卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数均显著高于对照组。
[0058]
综上所述，在卵母细胞体外成熟培养液中添加烯丙雌醇，并将经烯丙雌醇处理后的成熟卵母细胞用于制备克隆胚胎或孤雌胚胎，均可以提高胚胎的质量。具体表现为，不同浓度烯丙雌醇均可提高克隆胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数，且烯丙雌醇浓度为10-5
mol/l时，克隆胚胎的囊胚率和囊胚细胞数均显著高于对照组；而烯丙雌醇浓度为10-5
mol/l时，孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数均显著高于对照组。说明烯丙雌醇可用于提高胚胎体外发育质量。而胚胎体外发育质量的提高，是由于采用的卵母细胞体外成熟质量的提高，所以烯丙雌醇也可用于提高卵母细胞体外成熟质量。
[0059]
以上所述的内容仅是本发明的一些实施。对本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外，以上所述的本发明的实施方式不但可用于提高猪克隆胚胎的发育出生效率和孤雌胚胎的发育能力，还可以用于提高其它动物，例如小鼠、羊、牛和猫等胚胎的发育出生效率，这些也都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.烯丙雌醇在提高胚胎体外发育质量上的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述胚胎为体细胞克隆胚胎或孤雌生殖胚胎或体外受精胚胎。3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述胚胎为猪胚胎。4.含有烯丙雌醇的培养液，其中，所述培养液的组分包括：以tcm-199基础培养液为基础，补充添加0.6mm半胱氨酸，0.1iu/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1iu/ml孕马血清促性腺激素，10％胎牛血清，10％卵泡液及烯丙雌醇。5.根据权利要求4中所述的培养液，其中，所述烯丙雌醇浓度为10-6-10-3
mol/l。6.根据权利要求5中所述的培养液，其中，所述烯丙雌醇浓度为10-5
mol/l。7.权利要求4-6中任一项所述的培养液在卵母细胞体外成熟培养中的应用。8.权利要求4-6中任一项所述的培养液在提高胚胎体外发育质量上的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述胚胎为体细胞克隆胚胎或孤雌生殖胚胎或体外受精胚胎。10.一种提高胚胎体外发育质量的方法，其中，所述方法是通过将权利要求4-6中任一项所述的培养液用于卵母细胞的体外培养，然后将体外培养成熟的卵母细胞用于体外胚胎的构建，通过提高体外培养卵母细胞的质量，进而提高胚胎体外发育的质量。

技术总结
本发明公开了一种烯丙雌醇作为添加剂或含有烯丙雌醇的培养液在提高卵母细胞及其胚胎体外发育质量上的应用及提高卵母细胞及其胚胎体外发育质量的方法。通过该应用或者该方法，可以提高卵母细胞体外成熟质量。通过提高卵母细胞体外培养的质量，进而应用在卵母细胞体外成熟、体细胞克隆技术、孤雌胚胎、体外受精、辅助生殖等领域上。一方面能促进各物种卵母细胞的体外成熟，并能制备质量更优的体外受精胚胎和克隆胚胎，有助于人类辅助生殖的卵母细胞体外成熟培养；另一方面制备的优质胚胎与其产生的动物用于医学、生命科学、畜牧业等领域的研究，进一步推进生产实践的发展。进一步推进生产实践的发展。进一步推进生产实践的发展。


技术研发人员：吴珍芳 招华兴 何晓桦 李紫聪 蔡更元 张贤君 郑恩琴 顾婷 洪林君
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/14