一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记及其获得方法和应用

1.本发明属于分子遗传标记技术领域。更具体地，涉及一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记及其获得方法和应用。


背景技术：

2.现代生猪生产体系中，优秀公猪的基因可以通过人工授精技术快速扩散到群体中，高效改善商品猪生产性能，在猪肉保供方面发挥巨大作用。杜洛克公猪在当前广泛使用的“杜-长-大”或“杜-大-长”三元杂交商品猪生产体系中作为终端父本使用，商品猪含杜洛克血统比例达50％，因而杜洛克种猪在生猪产业中具有举足轻重的地位。常规的育种方案一般是对杜洛克公猪的生长速度、背膘厚和饲料效率等性状进行选育，忽略了对公猪繁殖性能的选育。因此，在对杜洛克公猪生长速度等常规性状进行持续改良的过程中，有必要同时对精液品质进行选育。尤其在“后非瘟”时代，社会化供精模型逐步兴起并被多数大型养殖企业广泛采用，大型公猪站的兴起已成为养猪业的必然趋势。通过育种技术提高公猪精液品质必将成为社会化供精模式和大型公猪站经济效益的重要保障。
3.研究表明，公猪精液属中低遗传力性状，具有遗传改良的潜力。然而，由于此前单一群体种公猪数量较少、精液品质检测数据少等因素。目前为止，全球鲜见针对公猪精液性状的遗传改良计划。公猪精液性状遗传解析是实施遗传改良的重要基础。通过解析公猪精液性状遗传机理，挖掘可用于公猪精液性状改良的分子遗传标记，有望为我国种公猪繁殖性能遗传改良提供依据，解决大型种公猪站生产公猪因精液品质不良而被大量淘汰(占比40％～61％)的这一关键问题。此外，通过提高公猪产精能力，也可有效减少公猪饲养量，大大降低公猪站生产成本。
4.近年来，高通量测序技术和高密度snp(single nucleotide porlymorphism)芯片的商业化应用，使得研究人员可以快速、廉价地获得覆盖全基因组的高密度snp甚至dna序列数据。基于高密度snp数据和畜禽重要性状表型记录，对复杂性状进行基因定位并尝试将这些信息应用于畜禽遗传改良成为畜禽育种领域新的研究热点。全基因组关联分析已成为qtl(quantitative trait loci)定位的一项常规技术，被广泛应用于人类复杂疾病和畜禽重要经济性状关键基因的定位。
5.基于覆盖全基因组的高密度snp数据和大群体的性状表型记录，可通过全基因组关联分析技术(genome wide association study，gwas)准确定位候选基因，但该技术存在一些缺陷。经典的gwas一般基于plink等软件对所有标记逐个进行单标记回归分析，继而设定一个显著阈值来筛选显著位点，因此存在计算强度大、过高估计标记效应、显著性阈值设定具有一定随意性等问题。为了进一步提高gwas的效率，新方法和软件不断被开发出来。其中，一步法全基因组关联分析(weighted single step genome-wide association study，wssgwas)同时利用系谱、历史个体表型记录和基因型数据进行关联分析，适用于大量个体拥有表型记录而只有少量个体拥有基因型数据的情况，尤其适用于畜禽重要经济性状的全
基因组关联分析。此外，通过序列填充，可将snp芯片数据填充到序列水平，获得序列水平的超高密度snp变异数据，通过gcta软件开展序列水平的关联分析。
6.精子发生过程包含有丝分裂、减数分裂和精子形成三个重要步骤，涉及到生精小管中许多基因和细胞的协同过程。相关基因的突变和相应细胞的状态变化可能会影响精子质量和雄性繁殖能力。从遗传机理解析和动物育种的角度出发，定位与精子质量和繁殖能力相关的候选基因是至关重要的一步。现虽已有研究人员定位到了部分影响公猪精液性状的候选基因或者基因组区域，但因研究群体遗传背景、公猪群体大小、标记密度等存在很大差异，不同研究报道的基因定位结果有所不同，缺乏可用于公猪精液性状改良的分子遗传标记。现已报道的与公猪精液性状关联的候选基因也存在标记的密度不足、qtl定位方法单一等问题。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记及其获得方法和应用。
8.本发明的第一个目的是提供一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记。
9.本发明的第二个目的是提供所述分子遗传标记的获得方法。
10.本发明的第三个目的是提供所述分子遗传标记在评估公猪精液质量或选育精子畸形率低的公猪方面的应用。
11.本发明的第四个目的是提供一种用于检测所述分子遗传标记的试剂。
12.本发明的第五个目的是提供所述试剂在评估公猪精液质量方面的应用。
13.本发明的第六个目的是提供所述试剂在制备用于评估公猪精液质量的产品中的应用。
14.本发明的第七个目的是提供所述试剂在选育精子畸形率低的公猪方面的应用。
15.本发明的第八个目的是提供所述试剂在制备用于选育精子畸形率低的公猪的产品中的应用。
16.本发明的第九个目的是提供一种选育精子畸形率低的公猪的方法。
17.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
18.本发明通过收集杜洛克公猪精液性状表型数据，检测关键个体重测序数据遗传变异，基于snp芯片序列进行数据填充，对杜洛克公猪精液性状关键基因进行挖掘，再基于精液性状表型-基因组序列数据，采用gcta软件挖掘影响公猪精子畸形率的关键基因，定位到了1号染色体133.1～134.2mb(nc_010443.5:c133383696-133291660sus scrofa isolate tj tabasco breed duroc chromosome 1,sscrofa11.1)范围内的tmco5a基因，该基因全长92kb，为公猪精子畸形率候选基因。在所述tmco5a基因的基础上，本发明还获得了一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记。基于该分子遗传标记的不同基因型公猪的精子畸形率有极显著差异，可利用其对公猪精液质量进行评估，选育公猪精子畸形率低的公猪。因此，本发明请求保护所述分子遗传标记及其获得方法和应用。
19.本发明提供了一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记，所述分子遗传标记为tmco5a基因的snp位点，所述snp位点位于猪基因组的1号染色体的第133586233位，该位点的碱基为a或g。
20.具体地，所述猪为杜洛克公猪，参考猪基因组为sscrofa11.1，所述tmco5a基因的序列信息为：nc_010443.5:c133383696-133291660sus scrofa isolate tj tabasco breed duroc chromosome 1,sscrofa11.1。
21.本发明还提供了所述的分子遗传标记的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：
22.s1.采集公猪精液性状表型数据；统计完整系谱种猪的每次采集公猪的精液体积、密度、活力、精子畸形率4个性状的表型数据，根据4个性状的表型数据计算得到公猪单次采精有效精子数；
23.s2.关键个体重测序数据遗传变异检测；基于种猪的全基因组重测序原始数据，使用bwa软件将全基因组重测序原始数据去掉低质量序列后得到的数据比对到参考基因组，获得.sam文件；使用samtools将.sam文件转化为.bam文件；通过标记重复序列去除.bam文件中出现的重复序列，最终获得.bam文件用于开展snp检测；
24.s3.snp芯片—序列数据填充；以重测序数据检测的snp为参考，将大群体基因芯片数据填充到序列水平，通过个体重测序，获得种猪超高密度的基因组序列数据，用于公猪精液性状关键基因挖掘；
25.s4.公猪精液性状关联分析；基于精液性状表型-基因组序列数据，挖掘影响公猪精子畸形率的关键基因；先基于混合线性模型方程组估计个体育种值，继而将育种值转换为逆回归育种值drp，将drp作为依变量进行全基因组关联分析，定位影响公猪精子畸形率的分子遗传标记。
26.本发明还请求保护所述的分子遗传标记在评估公猪精液质量或选育精子畸形率低的公猪方面的应用。
27.具体地，通过检测本发明所述分子遗传标记的基因型即可对公猪精液质量进行评估；当基因型为aa或ag时，公猪精子的畸形率高，公猪精液质量低；当基因型为gg时，公猪精子的畸形率低，公猪精液质量高。
28.本发明还提供了一种用于检测所述分子遗传标记的试剂。
29.可选地，所述试剂为引物或引物和探针组合，可通过引物扩增得到含所述分子遗传标记核苷酸位点的序列，通常测序获得其基因型。
30.本发明还请求保护检测所述分子遗传标记的试剂在评估公猪精液质量方面的应用。
31.本发明还请求保护检测所述分子遗传标记的试剂在制备用于评估公猪精液质量的产品中的应用。
32.本发明还请求保护检测所述分子遗传标记的试剂在选育精子畸形率低的公猪方面的应用。
33.本发明还请求保护检测所述分子遗传标记的试剂在制备用于选育精子畸形率低的公猪的产品中的应用。
34.本发明还提供了一种选育精子畸形率低的公猪的方法，所述方法为：提取待测公猪基因组dna，检测其1号染色体的第133586233位核酸位点，确定其基因型；选择基因型为gg的公猪进行下一步选种或育种。
35.基于本发明所述的分子遗传标记，aa与gg基因型公猪个体间畸形率相差1.64％，g等位基因显著降低公猪精子畸形率。故可通过检测本发明所述分子uan标记基因型辅助种
公猪选育，通过选留gg纯合公猪进入公猪站，降低公猪精子畸形率，提高种公猪利用效率。
36.本发明具有以下有益效果：
37.本发明提供了一种公猪精子畸形率候选基因：tmco5a基因，本发明同时还提供了一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记，所述分子遗传标记为tmco5a基因的snp位点，所述snp位点位于猪基因组的1号染色体的第133586233位，该位点的碱基为a或g。在其对应的三种基因型中，gg基因型公猪个体的精子畸形率低，与aa基因型公猪个体间畸形率相差1.64％，g等位基因显著降低公猪精子畸形率，可通过检测所述公猪精子畸形率相关的分子遗传标记对公猪精液质量进行评估，选育精子畸形率低的公猪，降低公猪精子畸形率，提高种公猪利用效率。
38.本发明不仅提供了可用于育精子畸形率低的公猪的分子遗传标记，同时还提供了所述分子遗传标记的获得方法和选育精子畸形率低的公猪的方法，有利于我国种公猪繁殖性能遗传改良，解决大型种公猪站生产公猪因精液品质不良而被大量淘汰的问题。
附图说明
39.图1为精子畸形率高密度芯片和重测序数据全基因组关联分析结果。
40.图2为tmco5a基因表达模式分析结果。
41.图3为tmco5a基因在精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子3个发育阶段的表达量。
具体实施方式
42.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
43.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
44.实施例1杜洛克公猪精液性状关键基因挖掘及精液性状关联分析
45.本发明提供了一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记，其获得过程如下所示：
46.(1)公猪精液性状表型数据收集
47.基于大型生猪遗传改良种公猪站日常采精数据，收集整理2253头杜洛克公猪的28万次采精数据，主要包括精液体积、密度、活力和畸形率4个性状的表型数据，根据4个性状的表型数据计算得到公猪单次采精精子有效数，得到杜洛克公猪精液性状表型数据集。精子有效数的计算公式为：精子有效数＝体积
×
密度
×
活力
×
(1-畸形率)；畸形率采用ultimatetm casa系统分析新鲜精液获得。
48.(2)关键个体重测序数据遗传变异检测
49.基于种猪全基因组重测序原始数据(short reads)，使用bwa软件将全基因组重测序原始数据去掉低质量序列后得到的数据(clean reads)比对到参考基因组，获得.sam文件；使用samtools将.sam文件转化为.bam文件；使用picard中的markduplicates(标记重复序列)去除.bam文件中可能因pcr反应而出现的重复序列，最终获得.bam文件用于gatk软件开展snp检测。
50.(3)snp芯片—序列数据填充
51.基于2000头杜洛克种猪的ggp 50k snp(geneseek，us)芯片数据和其中95头猪超高密度snp数据，以重测序数据检测的snp为参考，将大群体基因芯片数据(5万个基因位点)填充到序列水平(千万个基因位点)，通过少量关键个体重测序，获得2000头以上杜洛克种猪超高密度的基因型数据，用于杜洛克公猪精液性状关键基因挖掘。
52.(4)gcta软件全基因组关联分析
53.通过对具有重复观测值的公猪大量采精数据计算育种值，继而将育种值转化为逆回归育种值，并以逆回归育种值作为依变量，采用gcta的线性模型进行全基因组关联分析，获得所有遗传标记与公猪精子畸形率关联显著性p值，并从中筛选出关联性最强的遗传变异，通过功能注释、连锁不平衡分析和大数据表达量分析，鉴定显著关联区域内的主效基因。
54.实施例2分子标记的验证
55.(1)公猪精液性状关联分析
56.基于实施例1中得到的公猪精液性状表型数据和2000头以上种猪超高密度的基因组序列数据，组成精液性状表型-基因组序列数据，采用gcta软件挖掘影响公猪精子畸形率的关键基因。首先基于混合线性模型方程组来估计个体育种值，继而将育种值转换为逆回归育种值(de-regressed proofs，drp)，将drp作为依变量进行全基因组关联分析，定位影响公猪精子畸形率的分子遗传标记。本发明采用的育种值计算混合线性模型如下：
57.y＝xb+za+wp+age+intv+e
58.其中，y为性状观测值向量；x，z和w为设计矩阵；b为固定效应向量(总体均值、年-季效应和采精员效应)；为育种值向量；为个体永久环境效应；age和intv分别为公猪采精时的月龄和采精频率(天)，为协变量；为残差。
59.h为同时整合系谱和snp标记的亲缘关系矩阵，其逆矩阵计算公式如下：
[0060][0061]
其中，a为基于系谱的亲缘关系矩阵；a
22
为a中有基因型个体对应的分块矩阵；gw＝0.9g+0.1a
22
，为基于全基因组序列数据的亲缘关系矩，z为小等位基因频率(minor allele frequency，maf)校正后的基因型矩阵，其中0-2p，1-2p和2-2p分别代表aa，aa和aa三种基因型，p为小等位基因频率；d为对角线矩阵，表示snp的权重；pi为第i个标记的小等位基因频率；m为标记数量。
[0062]
对于上述混合线性模型，采用ai-reml(average information restricted maximum likelihood)法估计方差组分，并通过求解混合线性模型方程组获得育种值。计算逆回归育种值(de-regressed proofs，drp)，将drp作为依变量，通过gcta软件进行序列水平的全基因组关联分析，定位影响公猪精子畸形率的分子遗传标记。获得序列水平snp变异与公猪精子畸形率关联p值后，画出曼哈顿图展示显著关联区域，对显著关联区域1mb范围内的所有snp标记开展连锁不平衡分析，获得该区域的单倍型。通过与ncbi数据库对比，获得显著关联区域的关键候选基因。进一步分析最显著突变位点对公猪精子畸形率的效应，以及关键候选基因的表达模式，验证候选基因。
[0063]
序列水平全基因组关联分析曼哈顿图、显著关联区域单倍型、以及关联区域主效基因如图1所示。由图1可知，通过序列水平的全基因组关联分析可准确定位到1号染色体133.1～134.2mb(nc_010443.5:c133383696-133291660sus scrofa isolate tj tabasco breed duroc chromosome 1,sscrofa11.1)范围内的tmco5a基因，该基因全长92kb，位于该基因组区段中心位置(p值最小的snp)上游202kb处。
[0064]
实施例3tmco5a基因表达模式分析
[0065]
本发明利用piggtex项目(http://piggtex.farmgtex.org/)数据对猪tmco5a基因的组织表达模式进行了作图分析。
[0066]
猪tmco5a基因的表达模式分析结果如图2所示。猪gtex基于公共数据库大样本rnaseq数据分析结果表明，tmco5a基因在猪睾丸组织高度特异表达(图2)，在其余组织几乎无表达，表明该基因极有可能在公猪精子发生过程中发挥独特功能。
[0067]
另本发明利用zhang等(single-cell rna-sequencing reveals the dynamic process and novel markers in porcine spermatogenesis，journal of animal science and biotechnology，2021)公开的单细胞转录组测序对精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子3个发育阶段精细胞转录组的测序数据，统计了tmco5a基因在上述3个发育阶段精细胞的表达量，结果如图3所示，结果表明tmco5a基因在精原细胞中低表达，在粗线期精母细胞中表达量增加，圆形精子细胞中表达量显著升高，即该基因在精子变态发育启动时特异高表达，表明该基因可能在精子变态发育过程中发挥重要功能。
[0068]
实施例4不同基因型个体精子畸形率差异
[0069]
基于上述结果，进一步对tmco5a基因进行分析，发现了与公猪精子畸形率相关的分子遗传标记，所述分子遗传标记为tmco5a基因的snp位点，所述snp位点位于杜洛克公猪基因组(sscrofa11.1)的1号染色体的第133586233位核酸位点，该位点的碱基为a或g。
[0070]
具体地，本发明通过方差分析、f检验和多重比较分析了1号染色体上第133586233位碱基对杜洛克公猪精液指标的影响，根据该位点基因型对所有公猪个体进行分组，然后采用单因素方差分析和f检验来检验该基因位点与公猪精子畸形率是否显著关联。分析结果发现，杜洛克公猪1号染色体上第133586233位位点的基因型显著影响杜洛克公猪精子畸形率(p＝0.0000218)。不同基因型公猪精子畸形率及多重比较结果如下表1所示，由表1可知，g等位基因可显著降低公猪精子畸形率，aa基因型公猪精子畸形率比gg基因型公猪高1.64％(p＝0.0000023)。
[0071]
表1猪1号染色体显著关联位点不同基因型个体精子畸形率差异
[0072][0073]
上述结果表明，本发明所述位点可作为分子遗传标记，利用其对公猪精液质量进行评估，选育公猪精子畸形率低的公猪。
[0074]
实施例5用于选育精子畸形率低的公猪的方法
[0075]
基于本发明公开的分子遗传标记，本领域技术人员很容易设计出用于扩增该分子标记的引物或鉴定所述分子标记的探针，从而用于该遗传标记的检测，例如通过pcr扩增得到所述分子遗传标记，再通过克隆测序得到相应的序列，或者通过bsm-rflp多态性进行检测。因此，本发明还包括用于扩增所述分子遗传标记的引物或鉴定所述分子遗传标记的探针，以及含有所述引物或探针的试剂盒。
[0076]
利用本发明所述遗传分子标记或检测所述遗传分子标记的试剂盒，还可评估公猪精液质量或用于选育精子畸形率低的公猪。
[0077]
本发明还提供了一种选育精子畸形率低的公猪的方法，所述方法为：提取待测公猪基因组dna，检测其1号染色体的第133586233位核酸位点，确定其基因型；选择基因型为gg的公猪进行下一步选种或育种。
[0078]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记，其特征在于，所述分子遗传标记为tmco5a基因的snp位点，所述snp位点位于猪基因组的1号染色体的第133586233位，该位点的碱基为a或g。2.根据权利要求1所述的分子遗传标记，其特征在于，所述猪为杜洛克公猪，参考猪基因组为sscrofa11.1。3.权利要求1所述的分子遗传标记的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.采集公猪精液性状表型数据；统计完整系谱种猪的每次采集公猪的精液体积、密度、活力、精子畸形率4个性状的表型数据，根据4个性状的表型数据计算得到公猪单次采精有效精子数；s2.关键个体重测序数据遗传变异检测；基于种猪的全基因组重测序原始数据，使用bwa软件将全基因组重测序原始数据去掉低质量序列后得到的数据比对到参考基因组，获得.sam文件；使用samtools将.sam文件转化为.bam文件；通过标记重复序列去除.bam文件中出现的重复序列，最终获得.bam文件用于开展snp检测；s3.snp芯片—序列数据填充；以重测序数据检测的snp为参考，将大群体基因芯片数据填充到序列水平，通过个体重测序，获得种猪超高密度的基因组序列数据，用于公猪精液性状关键基因挖掘；s4.公猪精液性状关联分析；基于精液性状表型-基因组序列数据，挖掘影响公猪精子畸形率的关键基因；先基于混合线性模型方程组估计个体育种值，继而将育种值转换为逆回归育种值drp，将drp作为依变量进行全基因组关联分析，定位影响公猪精子畸形率的分子遗传标记。4.权利要求1所述的分子遗传标记在评估公猪精液质量或选育精子畸形率低的公猪方面的应用。5.一种用于检测权利要求1所述分子遗传标记的试剂。6.权利要求5所述试剂在评估公猪精液质量方面的应用。7.权利要求5所述试剂在制备用于评估公猪精液质量的产品中的应用。8.权利要求5所述试剂在选育精子畸形率低的公猪方面的应用。9.权利要求5所述试剂在制备用于选育精子畸形率低的公猪的产品中的应用。10.一种选育精子畸形率低的公猪的方法，其特征在于，所述方法为：提取待测公猪基因组dna，检测权利要求1所述的分子遗传标记，确定其基因型；选择基因型为gg的公猪进行下一步选种或育种。

技术总结
本发明公开了一种公猪精子畸形率相关的分子遗传标记及其获得方法和应用。本发明所述分子遗传标记为TMCO5A基因的SNP位点，所述SNP位点位于猪基因组的1号染色体的第133586233位，该位点的碱基为A或G。在其对应的三种基因型中，GG基因型公猪个体的精子畸形率低，与AA基因型公猪个体间畸形率差异显著，可通过检测所述公猪精子畸形率相关的分子遗传标记对公猪精液质量进行评估，选育精子畸形率低的公猪，降低公猪精子畸形率，提高种公猪利用效率。本发明有利于我国种公猪繁殖性能遗传改良，解决大型种公猪站生产公猪因精液品质不良而被大量淘汰的问题。大量淘汰的问题。大量淘汰的问题。


技术研发人员：高宁 刘小红 陈瑶生
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/14