一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法与流程

1.本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法。


背景技术：

2.血药浓度监测是以药代动力学原理为指导，分析测定药物在血液中的浓度，用以评价疗效或确定给药方案，使给药方案个体化，以提高药物治疗水平，达到临床安全、有效、合理的用药。血药浓度监测通常用于治疗窗窄、毒性强、服药周期长、服药后个体差异大的药物。
3.传统血药浓度监测的方法学是以免疫学为主，即通过研究生物体对抗原物质的免疫应答(机体对抗原刺激的反应，也是对抗原物质进行识别和排除的一种生物学过程)及其方法，具有特异性高，操作简便、快速，影响因素相对较少且容易控制等优点。然而，利用免疫学进行血药浓度监测时，也存在受到药物抗体种类限制、无法同时测定多个药物或单个药物上下游代谢物等缺点。
4.另外，有的机构还会采用高效液相色谱法(hplc)进行血药浓度监测，但高效液相色谱法灵敏度低，无法检测出一些灵敏度要求比较高的药物，同时其前处理方法学也相对复杂。
5.因此，针对上述技术问题，有必要提供一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，以解决上述的问题。
7.为了实现上述目的，本发明一实施例提供的技术方案如下：
8.一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，包括以下步骤：
9.s1、确定待检测药物，所述待检测药物包括伊立替康，卡培他滨，紫杉醇，多西他赛，他莫昔芬，甲氨蝶呤和来曲唑；
10.s2、制备校准品及质控品，并配制工作曲线浓度表；
11.s3、对s2中获得的校准品及质控品进行前处理；
12.s4、将前处理后的液体进行液相色谱串联质谱检测；
13.s5、对检测的结果进行性能验证。
14.进一步地，所述s2具体包括以下步骤：
15.s201、按1:50的比例将校准品及质控品中间液和空白基质混合；
16.s202、以2500rpm/min涡旋震荡5min，获得标准品j1-j7，并绘制标准品j1-j7中各药物浓度，获得工作曲线浓度表。
17.进一步地，所述s201中的空白基质为20μl校准品与980μl空白基质。
18.进一步地，所述s3具体包括以下步骤：
19.s301、移取血清样本/校准品/质控品100μl加入至2ml离心管中，加入20μl内标，再加入280μl含1％甲酸的甲醇-乙腈(1+1)溶液；
20.s302、先以2000rpm/min涡旋震荡5min，混合均匀后于4℃温度下，再以14000rpm/min离心5min；
21.s303、移取s302中200μl上清液加入到96孔板中，以4000rpm/min转速下离心5min，获得待检测药液。
22.进一步地，所述s4中包括质谱参数设置和液相参数设置。
23.进一步地，所述液相设置参数包括：色谱柱：aglient eclipse plus c18，3.5μm(100*3.0mm)，流动相：a相为2mm甲酸铵水溶液(含0.1％甲酸)；b相为0.1％甲酸乙腈，流速：0.6ml/min，进样体积：20μl，柱温：40℃。
24.进一步地，所述s4中还包括梯度洗脱过程。
25.进一步地，所述s5中的性能验证包括基质曲线验证和不精密度验证。
26.进一步地，所述基质曲线验证的方法为：分别取7个浓度点各100μl，经过s3和s4步骤进行处理，以待测物浓度值为横坐标，以待测物与内标的面积比为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归计算。
27.进一步地，所述不精密度验证的方法为：分别对低、中、高3个浓度的样本进行6次平行测定，重复测定3个批次，以area ratio值计算各浓度的批内及批间cv值，中高浓度准确度cv＜15％，低浓度cv＜20％即为可接受。
28.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
29.1、本发明使用液相色谱串联质谱法，并采用高效液相色谱分离和质谱分析的结合方式，可以克服血液样本中的复杂背景干扰，提高信噪比，对于体内浓度较小的药物，包括抗肿瘤药物可达到高灵敏度，方便检出。
30.2、通过液相色谱串联质谱法可以进一次样品，检测多种物质，在抗肿瘤治疗中会有多种治疗方案组合，同时服用多种药物，而且一种药物可能会有不同的活性代谢物，使用液相色谱串联质谱法可以对这些药物/代谢物同时进行检测，提高检测效率，对临床意义更大。
31.3、对液相色谱串联质谱法前处理进行优化，简单几个步骤处理后即可上机检测，减少样本等待时间。
附图说明
32.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
33.图1为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的工作曲线浓度表；
34.图2为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的质谱设置参数表；
35.图3为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的离子对信息表；
36.图4为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的洗脱梯度表；
37.图5为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的基质曲线验证数据表；
38.图6为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的准确度验证数据表；
39.图7为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的精密度验证数据表；
40.图8为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的特异性验证数据表；
41.图9为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的残留验证数据表；
42.图10为本发明一实施例中一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法的重复进样验证数据表。
具体实施方式
43.以下将结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细描述。但该等实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据该等实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
44.本发明公开了一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，参图1-图10所示，包括以下步骤：
45.s1、确定待检测药物，待检测药物包括伊立替康，卡培他滨，紫杉醇，多西他赛，他莫昔芬，甲氨蝶呤和来曲唑；
46.s2、制备校准品及质控品，并配制工作曲线浓度表；
47.s3、对s2中获得的校准品及质控品进行前处理；
48.s4、将前处理后的液体进行液相色谱串联质谱检测；
49.s5、对检测的结果进行性能验证。
50.其中，s2具体包括以下步骤：
51.s201、按1:50的比例将校准品及质控品中间液和空白基质混合，空白基质为20μl校准品与980μl空白基质；
52.s202、以2500rpm/min涡旋震荡5min，获得标准品j1-j7，并绘制标准品j1-j7中各药物浓度，获得工作曲线浓度表。
53.另外，s3具体包括以下步骤：
54.s301、移取血清样本/校准品/质控品100μl加入至2ml离心管中，加入20μl内标，再加入280μl含1％甲酸的甲醇-乙腈(1+1)溶液；
55.s302、先以2000rpm/min涡旋震荡5min，混合均匀后于4℃温度下，再以14000rpm/min离心5min；
56.s303、移取s302中200μl上清液加入到96孔板中，以4000rpm/min转速下离心5min，获得待检测药液。
57.具体地，液相色谱串联质谱检测的方法为：首先将样本使用有机试剂进行沉淀蛋白，使用震摇装置对样本进行震摇，然后使用高速冷冻离心机进行离心，接着使用移液器转移上清液于96孔板中，最后将96孔板上质谱检测。
58.优选的，震摇要求转速：2000rpm/min，时间：5min；高速冷冻离心机转速：14000rpm/min，时间：5min，温度：4℃。
59.通过震摇装置使得样本与有机试剂充分混匀，促进蛋白沉淀。通过高速冷冻离心使得溶液中的沉淀物快速沉淀至下层，4℃低温使得溶液与沉淀物充分分离。
60.s4中包括质谱参数设置和液相参数设置。
61.其中，质谱参数按单个化合物全部进行优化，包括dp、ce、ep、cxp等优化，更能匹配机器且相关化合物响应有所提高，
62.通过液相参数设置使得进样量更小，对于机器的污染风险降低，梯度时间更短，提高质谱通量。
63.优选的，质谱设置参数如图2所示。
64.液相设置参数为：色谱柱：aglient eclipse plus c18，3.5μm(100*3.0mm)，流动相：a相为2mm甲酸铵水溶液(含0.1％甲酸)；b相为0.1％甲酸乙腈，流速：0.6ml/min，进样体积：20μl，柱温：40℃。
65.此外，s4中还包括梯度洗脱过程，梯度洗脱的参数表参图4所示。
66.基于此，本技术是通过使用沉淀蛋白方法使血样中抗肿瘤药物萃取出来，再使用液相色谱-串联质谱系统进行检测，采集质谱信号，通过建立已知浓度分析物(标准品)与目标分析物响应值(目标峰面积与对应同位素内标物的峰面积比)之间的函数关系，实现对样本中目标药物的定量检测。
67.再者，为了验证本技术检测方法是否适配ab sciex triple quad 4500液相色谱质谱联用仪，满足抗肿瘤药物浓度监测的临床检测要求，需要对检测的数据进行性能验证。
68.其中，检测数据性能验证包括基质曲线验证和精密度验证。
69.具体地，基质曲线验证的方法为：分别取7个浓度点各100μl，经过s3和s4步骤进行处理，以待测物浓度值为横坐标，以待测物与内标的面积比为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归计算，计算的结果参图5所示。
70.根据图5的数据可知，伊立替康，卡培他滨，紫杉醇，多西他赛，他莫昔芬，甲氨蝶呤和来曲唑7种抗肿瘤药物线性r值均大于0.99，表明7种抗肿瘤药物范围内线性关系良好。
71.另外，精密度验证的方法为：分别对低、中、高3个浓度的样本进行6次平行测定，重复测定3个批次，以area ratio值计算各浓度的批内及批间cv值，中高浓度准确度cv＜15％，低浓度cv＜20％即为可接受，精密度验证结果参图7所示。
72.根据图7的数据可知，7种抗肿瘤药物浓度的批内及批间精密度均cv≤15％，满足性能验证要求。
73.此外，为了进一步提高检测数据结果的准确性，还需要对检测数据进行准确度验证，特异性、选择性验证，残留验证以及重复进样稳定性验证。
74.其中，准确度验证的操作过程如下：
75.(1)准确度验证实验样本的基本要求和制备方法如下：
76.选择合适浓度的常规检测样本，分为体积相同的3份；在其中3份样本中加入不同量的待测物标准，制成3个不同加入浓度的回收样本(如基质高、中、低质控点)，计算加入的待测物的浓度；在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶剂，制成基础样本。
77.(2)准确度验证实验过程
78.用待评价方法对回收样本和基础样本进行测定，通常对样本进行3次重复分析，取其均值进行计算。
79.(3)准确度验证数据处理及结果报告
80.计算回收率：回收率1＝(回收样本浓度1-基础样本浓度)/加入浓度
×
100％；
81.计算平均回收率：
82.平均回收率＝(回收率1+回收率2)/2
×
100％；
83.可接受判断：平均回收率在85％-115％。
84.(4)准确度验证验证过程如下：
85.配制低、中、高浓度3水平的质控品，添加到未知血清中去混匀后进行测试，每个浓度重复测定3次，同时测定加入了等量甲醇的未知血清即基础样本，验证结果如图6所示。
86.根据图6的数据可知，所有药物的各浓度加标回收均在85％-115％之间，满足准确度性能验证要求。
87.另外，特异性、选择性验证的测定方法为：检测空白(含内标样本基质)样本，结果要求为：无背景峰或背景峰小于llmi峰面积的20％。
88.基于此，获得的特异性、选择性验证的结果参图8所示。
89.根据图8可知，各分析物的空白峰面积均小于llmi峰面积的20％，满足特异性要求。
90.具体地，残留验证的验证方法为：分析高浓度样本后立刻进样1份或多份空白样本，空白样本的检测信号应远远低于llmi。
91.在分析完曲线最高点s6后立即进空白样本，重复测定6次，其峰面积与llmi即s1的峰面积结果对比如图9所示。
92.根据图9可知，最高浓度样品(s7)之后在双空白样品中的残留均小于定量下限(s1)的20％，满足性能验证要求。
93.此外，重复进样稳定性验证是将低质控连续进样20针，将测定结果的平均值进行计算，要求cv≤15％，并记录相关数据。
94.重复进样稳定性验证的结果参图10所示。
95.根据图10可知，7种抗肿瘤药物分析物的低浓度重复性进样均cv≤15％，满足验证要求。
96.综上，根据基质曲线验证，精密度验证，准确度验证，特异性、选择性验证，残留验证以及重复进样稳定性验证本技术的检测数据结果可知，本技术公开的检测方法是基于ab sciex triple quad 4500液相色谱质谱联用仪下，可对7种抗肿瘤药物进行准确定量，其中线性可满足r》0.99，最低标准点偏差
±
20％以内，其余标准点偏差在
±
15％以内，质控准确度满足re≤
±
15％，批内及批间精密度满足cv≤15％。即本产品适配于ab sciex triple quad 4500液相色谱质谱联用仪，满足临床对于7种抗肿瘤药物浓度的检测要求。
97.由以上技术方案可以看出，本发明具有以下有益效果：
98.1、本发明使用液相色谱串联质谱法，并采用高效液相色谱分离和质谱分析的结合方式，可以克服血液样本中的复杂背景干扰，提高信噪比，对于体内浓度较小的药物，包括抗肿瘤药物可达到高灵敏度，方便检出。
99.2、通过液相色谱串联质谱法可以进一次样品，检测多种物质，在抗肿瘤治疗中会有多种治疗方案组合，同时服用多种药物，而且一种药物可能会有不同的活性代谢物，使用液相色谱串联质谱法可以对这些药物/代谢物同时进行检测，提高检测效率，对临床意义更大。
100.3、对液相色谱串联质谱法前处理进行优化，简单几个步骤处理后即可上机检测，减少样本等待时间。
101.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
102.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施例加以描述，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、确定待检测药物，所述待检测药物包括伊立替康，卡培他滨，紫杉醇，多西他赛，他莫昔芬，甲氨蝶呤和来曲唑；s2、制备校准品及质控品，并配制工作曲线浓度表；s3、对s2中获得的校准品及质控品进行前处理；s4、将前处理后的液体进行液相色谱串联质谱检测；s5、对检测的结果进行性能验证。2.根据权利要求1所述的一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，所述s2具体包括以下步骤：s201、按1:50的比例将校准品及质控品中间液和空白基质混合；s202、以2500rpm/min涡旋震荡5min，获得标准品j1-j7，并绘制标准品j1-j7中各药物浓度，获得工作曲线浓度表。3.根据权利要求2所述的一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，所述s201中的空白基质为20μl校准品与980μl空白基质。4.根据权利要求1所述的一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，所述s3具体包括以下步骤：s301、移取血清样本/校准品/质控品100μl加入至2ml离心管中，加入20μl内标，再加入280μl含1％甲酸的甲醇-乙腈(1+1)溶液；s302、先以2000rpm/min涡旋震荡5min，混合均匀后于4℃温度下，再以14000rpm/min离心5min；s303、移取s302中200μl上清液加入到96孔板中，以4000rpm/min转速下离心5min，获得待检测药液。5.根据权利要求1所述的一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，所述s4中包括质谱参数设置和液相参数设置。6.根据权利要求5所述的一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，所述液相设置参数包括：色谱柱：aglient eclipse plus c18，3.5μm(100*3.0mm)，流动相：a相为2mm甲酸铵水溶液(含0.1％甲酸)；b相为0.1％甲酸乙腈，流速：0.6ml/min，进样体积：20μl，柱温：40℃。7.根据权利要求5所述的一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，所述s4中还包括梯度洗脱过程。8.根据权利要求1所述的一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，所述s5中的性能验证包括基质曲线验证和不精密度验证。9.根据权利要求8所述的一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，所述基质曲线验证的方法为：分别取7个浓度点各100μl，经过s3和s4步骤进行处理，以待测物浓度值为横坐标，以待测物与内标的面积比为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归计算。10.根据权利要求8所述的一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，其特征在于，所述不精密度验证的方法为：分别对低、中、高3个浓度的样本进行6次平行测定，重复测定3个批次，以area ratio值计算各浓度的批内及批间cv值，中高浓度准确度cv＜15％，低浓度cv＜20％即为可接受。

技术总结
本发明公开了一种同时检测7种抗肿瘤药物血药浓度的方法，包括以下步骤：S1、确定待检测药物，待检测药物包括伊立替康，卡培他滨，紫杉醇，多西他赛，他莫昔芬，甲氨蝶呤和来曲唑；S2、制备校准品及质控品，并配制工作曲线浓度表；S3、对S2中获得的校准品及质控品进行前处理；S4、将前处理后的液体进行液相色谱串联质谱检测；S5、对检测的结果进行性能验证，S2具体包括以下步骤：S201、按1:50的比例将校准品及质控品中间液和空白基质混合。本发明通过使用液相色谱串联质谱法，并采用高效液相色谱分离和质谱分析的结合方式，具有抗背景干扰能力强，信噪比高，灵敏度高，检测效率快，样本等待时间少的优点。的优点。的优点。


技术研发人员：孔彬 邹珍珍 杨毅 徐高军 杨曹骅
受保护的技术使用者：江苏瑞质生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/14