一种愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法及其在抗植物病原真菌方面的应用

1.本发明属于抗菌活性研究技术领域，具体涉及一种愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法及其在抗植物病原真菌方面的应用。


背景技术：

2.这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
3.宽叶山蒿artemisia stolonifera为菊科蒿属真艾系植物，主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、山东、湖北等省区，多生于低海拔湿润地区的林缘、疏林下、路旁及荒地与沟谷等处。经过系统本草考证，认为宋代《本草图经》和明代《本草蒙筌》所记载的药材“九牛草”基原为宽叶山蒿，为古代中药材艾叶的重要基原之一，目前已从宽叶山蒿中鉴定了32个化学成分，包含黄酮、黄酮苷及酚酸类化合物，但尚没有从宽叶山蒿中分离出单体化合物。
4.油菜菌核病sclerotinia sclerotiorum是由核盘菌引起的一种广谱性真菌病害,是我国油菜的三大病害之一，严重降低油菜的产量和品质。玉米小斑病菌helminthosporium maydis是由长蠕孢菌侵染引起的病害，为玉米产区重要病害之一,造成玉米产量的严重损失。马铃薯黄萎病菌verticillium dahliae kleb是由大丽轮枝孢菌侵染引起的系统侵染的土传病害，严重的为害马铃薯的产量和品质。目前常见的防治3株植物病原真菌的化学药剂有多菌灵、菌核净、咪鲜胺、托布津、苯菌灵等，这些化学药剂具有广谱、高效等特点，使用范围广泛，但均有一定的危害性如多菌灵的残留能引起肝病和染色体畸变，对哺乳动物有毒害；苯菌灵能刺激呼吸系统和皮肤引起过敏等，且由于化学药剂没有选择性，可能作用于有益微生物，污染环境。
5.因此，为了能够有效地防治农作物真菌感染性疾病，同时降低危害，减少环境污染，发现和开发高效、低毒、污染少的植物源农药已成为当今抗植物病原真菌研究领域的重点之一。目前，已经分离出多种愈创木烷型倍半萜类化合物，但主要用于抗肿瘤方面，行业内尚未在数量众多的天然植物中分离出对植物病原真菌具有较好抑制效果的愈创木烷型倍半萜类化合物。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法及其在抗植物病原真菌方面的应用，所述愈创木烷型倍半萜类化合物在低浓度的情况下可有效抑制油菜菌核菌sclerotinia sclerotiorum、玉米小斑病菌helminthosporium maydis和马铃薯黄萎病菌verticillium dahliae kleb的生长，具有非常大的应用潜能。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供了一种愈创木烷型倍半萜类化合物，选自具有以下结构式的化合物：
[0009][0010]
本发明的第二个方面，提供了一种愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，包括：
[0011]
将宽叶山蒿清洗、干燥后，采用60-80％乙醇加热浸提，将提取液浓缩，得到粗提物；
[0012]
将所述粗提物用水溶解后，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液浓缩，得粗浸膏；
[0013]
将所述粗浸膏经柱层析和高效液相色谱法制备，即得。
[0014]
本发明经过试验发现，目标化合物在乙酸乙酯萃取物中，而先采用石油醚进行萃取时，可以对粗提物进行预除杂，提高乙酸乙酯中目标化合物的纯度。
[0015]
本发明的第三个方面，提供了上述的愈创木烷型倍半萜类化合物在抗植物病原真菌方面的应用，所述植物病原真菌包括：油菜菌核菌sclerotinia sclerotiorum、玉米小斑病菌helminthosporium maydis和马铃薯黄萎病菌verticillium dahliae kleb。
[0016]
本发明的有益效果
[0017]
(1)本发明提供的愈创木烷型倍半萜类化合物moxartenolide、artemdubolide c、artemvulactone f在油菜菌核菌、玉米小斑病菌和马铃薯黄萎病菌3株植物病原真菌方面的应用，所述的愈创木烷型倍半萜类化合物能够在低浓度的情况下，抑制所述3株植物病原真菌的生长。由此可见，所述的愈创木烷型倍半萜类化合物在开发防治植物病原真菌的植物源农药方面具有非常大的应用潜能。
[0018]
(2)本发明提供该化合物的制备方法操作简单，可控性较强，稳定性良好。
附图说明
[0019]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0020]
图1为化合物1的1h-nmr谱图。
[0021]
图2为化合物1的
13
c-nmr谱图。
[0022]
图3为化合物2的1h-nmr谱图。
[0023]
图4为化合物2的
13
c-nmr谱图。
[0024]
图5为化合物3的1h-nmr谱图。
[0025]
图6为化合物3的
13
c-nmr谱图。
具体实施方式
[0026]
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0027]
一种愈创木烷型倍半萜类化合物，其选自具有以下结构式的化合物：
[0028][0029]
所述化合物moxartenolide对3株植物病菌(油菜菌核菌sclerotinia sclerotiorum、玉米小斑病菌helminthosporium maydis和马铃薯黄萎病菌verticillium dahliae kleb)的最小抑菌浓度mic分别为6.25、12.5、12.5μg/ml；artemdubolide c最小抑菌浓度mic分别为12.5、12.5、12.5μg/ml；artemvulactone f最小抑菌浓度mic分别为12.5、12.5、12.5μg/ml。
[0030]
一种愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0031]
将宽叶山蒿清洗、干燥后，采用60-80％乙醇加热浸提，将提取液浓缩得到粗提物；
[0032]
将粗提物用水充分溶解后，依次采用石油醚、乙酸乙酯分别萃取6-8次，收集乙酸乙酯萃取液浓缩得粗浸膏(即：将粗提物水溶液先用石油醚萃取多次，除去小极性组分；再将粗提物水溶液用乙酸乙酯萃取多次，收集乙酸乙酯萃取液)；
[0033]
将粗浸膏经柱层析和高效液相色谱法制备得到目的化合物，高效液相色谱采用反相c18柱，洗脱体系为甲醇-水或乙腈-水，流速为2-3ml/min。
[0034]
在一些实施例中，所述加热浸提的温度为55-65℃，加热提取的时间为8-12h。
[0035]
优选的，加热浸提的次数为2-4次。
[0036]
在一些实施例中，所述柱层析包括正相硅胶柱层析、反相d101型大孔树脂柱层析和凝胶柱层析中的一种或两种。
[0037]
优选的，柱层析的洗脱体系为甲醇、二氯甲烷-甲醇、石油醚-乙酸乙酯或甲醇-水。
[0038]
优选的，柱层析的方法具体为：首先将乙酸乙酯萃取部分用其1～1.5倍质量80-100目的硅胶吸附拌样后干法上样至正相硅胶柱，然后采用二氯甲烷-甲醇体系按100:0、100:1、70:1、50:1、30:1、10:1、0:100梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并合并，得到6个组分fr.1-6；
[0039]
fr.2用其1～1.5倍质量的d101型大孔树脂吸附拌样后干法上样至反向大孔树脂柱，然后按20％、40％、60％、80％、100％乙醇溶液进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液，浓缩后tlc点板合并，得到5个组分fr.4-1至fr.4-5；
[0040]
fr.4-4用其1～1.5倍质量80-100目干法上样至正相硅胶柱，然后采用石油醚-乙酸乙酯体系20:1、10:1、8:1、5:1、1:1进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并合并，得到4个组分fr.4-4-1至fr.4-4-4；fr.4-4-3上样至凝胶柱，采用甲醇或二氯甲烷-甲醇＝1：1洗脱体系洗脱，收集洗脱液并合并，得到2个亚组分，第1个亚组分进行hplc制备色谱纯化，得到化合物1-3。
[0041]
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
[0042]
以下实施例中，乙醇的浓度为体积浓度。
[0043]
实施例1化合物的制备
[0044]
(1)将宽叶山蒿清洗、干燥后，采用70％乙醇加热浸提，将提取液浓缩得粗提物；
[0045]
(2)将粗提物用水充分溶解后，按粗提物水溶液与萃取剂1:1体积比依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩得到粗浸膏；
[0046]
(3)首先将乙酸乙酯粗浸膏用其1.5倍质量80-100目硅胶吸附拌样后干法上样至正相硅胶柱，然后采用二氯甲烷-甲醇体系按100:0、100:1、70:1、50:1、30:1、10:1、0:100梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并合并，得到6个组分fr.1-6；
[0047]
fr.2用其1.5倍质量d101型大孔树脂吸附拌样后干法上样至反向d101大孔树脂柱，然后按20％、40％、60％、80％、100％乙醇溶液进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液，浓缩后tlc点板合并，得到5个组分fr.4-1至fr.4-5；
[0048]
fr.4-4用其1.5倍质量干法上样至正相硅胶柱，然后采用石油醚-乙酸乙酯体系20:1、10:1、8:1、5:1、1:1进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并合并，得到4个组分fr.4-4-1至fr.4-4-4；fr.4-4-3上样至凝胶柱，采用二氯甲烷-甲醇＝1:1洗脱体系洗脱，收集洗脱液并合并，得到2个亚组分，第1个亚组分进行hplc制备色谱(乙腈:水＝50:50，流速＝3ml/min)纯化，得到化合物1-3。
[0049]
实施例2化合物结构鉴定
[0050]
所有化合物经核磁鉴定后，所得化合物的性状和波谱数据如下：
[0051]
化合物1：moxartenolide，无色油状物，分子式为c
20h22
o5。1h nmr(500mhz,cdcl3)δh:6.21(1h,d,j＝2.3hz,h-3),3.73(1h,t,j＝10.2hz,h-6),3.34(1h,tt,j＝10.4,3.1hz,h-7),5.02(1h,td,j＝10.6,2.2hz,h-8),2.75(1h,dd,j＝10.7,13.4hz,h-9a),2.52(1h,dd,j＝2.3,13.3hz,h-9b),5.64(1h,d,j＝2.9hz,h-13a),6.20(1h,d,j＝2.9hz,h-13b),2.48(3h,s,h-14),2.34(3h,brs,h-15),6.24(1h,dq,j＝7.4,1.6hz,h-3
′
),2.04(3h,dq,j＝7.3,1.7hz,h-4
′
),1.92(3h,s,h-5
′
)；
13
cnmr(126mhz,cdcl3)δc:133.7(c-1),195.2(c-2),136.2(c-3),169.4(c-4),51.7(c-5),81.6(c-6),55.4(c-7),68.8(c-8),44.6(c-9),145.0(c-10),136.3(c-11),168.6(c-12),122.0(c-13),21.5(c-14),20.1(c-15),166.5(c-1
′
),126.9(c-2
′
),141.2(c-3
′
),16.2(c-4
′
),20.7(c-5
′
)。以上数据与文献对照，故鉴定化合物1为moxartenolide。
[0052]
化合物2：artemdubolide c，无色油状物，分子式为c
20h24
o5。1h nmr(500mhz,cdcl3):δ
h 6.20(1h,s,h-3),3.51(1h,brd,j＝10.6hz,h-5),3.73(1h,dd,j＝10.2,7.5hz,h-6),3.28(1h,tt,j＝10.3,6.2hz,h-7),4.94(1h,td,j＝10.6,2.2hz,h-8),2.70(1h,dd,j＝10.6,13.1hz,h-9a),2.40(1h,dd,j＝3.2,10.3hz,h-9b),5.67(1h,d,j＝2.9hz,h-13a),6.21(1h,d,j＝3.1hz,h-13b),2.34(3h,s,h-14),2.45(3h,s,h-15),2.42(1h,m,h-2
′
),1.75(1h,m,h-3
′
a),1.51(1h,m,h-3
′
b),0.96(1h,t,j＝7.4hz,h-4
′
),1.21(3h,d,j＝7.1hz,h-5
′
)；
13
c nmr(126mhz,cdcl3):δ
c 133.7(c-1),195.1(c-2),136.2(c-3),169.5(c-4),51.6(c-5),81.6(c-6),55.3(c-7),69.0(c-8),44.4(c-9),144.8(c-10),136.3(c-11),168.52(c-12),121.9(c-13),21.4(c-14),20.1(c-15),175.6(c-1
′
),144.8(c-2
′
),26.5(c-3
′
),12.0(c-4
′
),17.0(c-5
′
)。以上数据与文献对照，故鉴定化合物2为artemdubolide c。
[0053]
化合物3：artemvulactone f，无色油状物，分子式为c
20h24
o5。1h nmr(500mhz,
cdcl3):δ
c 6.20(1h,m,h-3),3.50(1h,d,j＝10.2hz,h-5),3.71(1h,t,j＝10.2hz,h-6),3.26(1h,tt,j＝3.1,10.3hz,h-7),4.92(1h,td,j＝10.6,2.1,h-8),2.71(1h,dd,j＝13.4,10.7hz,h-9a),2.47(1h,d,j＝2.2hz,h-9b),5.65(2h,d,j＝3.0hz,h-13a),6.22(d,j＝3.1hz,h-13b),2.46(s,h-14),2.33(3h,s,h-15),2.27(1h,m,h-2
′
a),2.30(1h,m,h-2
′
b),2.16(1h,m,h-3
′
),1.01(6h,d,j＝6.6hz,h-4
′
,5
′
)；
13
c nmr(126mhz,cdcl3):δ
h 133.7(c-1),195.2(c-2),136.2(c-3),169.4(c-4),51.7(c-5),81.6(c-6),55.2(c-7),69.2(c-8),44.5(c-9),144.8(c-10),136.2(c-11),168.5(c-12),122.0(c-13),20.1(c-14),21.4(c-15),172.0(c-16),44.5(c-17),25.7(c-18),22.6(c-19),22.5(c-20)。以上数据与文献对照，故鉴定化合物3为artemvulactone f。
[0054]
实施例3抗菌活性实验
[0055]
实验方法：将实施例2中得到的化合物1-3和酮康唑用dmso配制成10mg/ml的测试液，置于4℃保存，含菌液不含待测样品为空白孔，含菌液与待测样品的试验孔，含菌液和dmso为阴性对照孔，含菌液和酮康唑为阳性对照孔。采用二倍稀释法检测样品对2株植物病原真菌的mic，每个样品浓度均设置3个复孔。
[0056]
具体操作步骤：将油菜菌核菌、玉米小斑病菌和马铃薯黄萎病菌作为测试菌株，取pdb(马铃薯葡萄糖肉汤)粉末35g(奥博星，北京)，加蒸馏水至1000ml，分装至锥形瓶中，每瓶装入200ml培养基，121℃高压灭菌后晾凉，将3株植物病原真菌接种至pdb培养基中，28℃，160r/min振摇培养3d。取锥形瓶中培养好的真菌液1ml加入100ml pdb培养基中稀释100倍。在96孔板的第一排加入198μl稀释后的菌液，第二至八排中加入100μl稀释后的菌液。第一排孔中分别加入样品、空白、阴性对照、阳性对照2μl，每孔重复3次，混合均匀后吸取100μl混合液至第二排，将其混合均匀后吸取100μl混合液至第三排，依次操作，最终使每排样品的浓度依次为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml。将处理好的96孔板置于28℃的恒温培养箱中培养24h，待阴性对照组长满真菌记录活性结果，将最后一排澄清的孔所对应的样品浓度定为该化合物的最小抑菌浓度(mic)。
[0057]
按上述方法得到的结果如表1所示。
[0058]
表1为化合物1～3对植物病原真菌的抑制活性结果，mic表示最小抑制浓度。
[0059]
表1
[0060]
[0061]
由此可知，化合物1-3对能够在低浓度的情况下，抑制所述3株植物病原真菌(油菜菌核菌sclerotinia sclerotiorum、玉米小斑病菌helminthosporium maydis和马铃薯黄萎病菌verticillium dahliae kleb)的生长。
[0062]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种愈创木烷型倍半萜类化合物，其特征在于，选自具有以下结构式的化合物：2.如权利要求1所述的愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括：将宽叶山蒿清洗、干燥后，采用60-80％乙醇加热浸提，将提取液浓缩，得到粗提物；将所述粗提物用水溶解后，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液浓缩，得粗浸膏；将所述粗浸膏经柱层析和高效液相色谱法制备，即得。3.如权利要求2所述的愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述加热浸提的温度为55-65℃，加热提取的时间为8-12h。4.如权利要求2所述的愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述加热浸提的次数为2-4次。5.如权利要求2所述的愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述柱层析采用正相硅胶柱层析、反相d101型大孔树脂柱层析和凝胶柱层析中的一种或两种。6.如权利要求2所述的愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述柱层析的洗脱体系为甲醇、二氯甲烷-甲醇、石油醚-乙酸乙酯或甲醇-水。7.如权利要求2所述的愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述柱层析的方法具体步骤为：首先将乙酸乙酯萃取部分用其1～1.5倍质量80-100目的硅胶吸附拌样后干法上样至正相硅胶柱，然后采用二氯甲烷-甲醇体系按100:0、100:1、70:1、50:1、30:1、10:1、0:100梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并合并，得到6个组分fr.1-6；fr.2用其1～1.5倍质量的d101型大孔树脂吸附拌样后干法上样至反向大孔树脂柱，然后按20％、40％、60％、80％、100％乙醇溶液进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液，浓缩后tlc点板合并，得到5个组分fr.4-1至fr.4-5；fr.4-4用其1～1.5倍质量80-100目干法上样至正相硅胶柱，然后采用石油醚-乙酸乙酯体系20:1、10:1、8:1、5:1、1:1进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并合并，得到4个组分fr.4-4-1至fr.4-4-4；fr.4-4-3上样至凝胶柱，采用甲醇或二氯甲烷-甲醇＝1:1洗脱体系洗脱，收集洗脱液并合并，得到2个亚组分，第1个亚组分进行hplc制备色谱纯化，得到化合物1-3。8.如权利要求2所述的愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，高效液相色谱采用反相c18柱，洗脱体系为甲醇-水或乙腈-水，流速为2-3ml/min。9.权利要求1所述的愈创木烷型倍半萜类化合物在抗植物病原真菌方面的应用。10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物病原真菌包括：油菜菌核菌sclerotinia sclerotiorum、玉米小斑病菌helminthosporium maydis和马铃薯黄萎病菌verticillium dahliae kleb。

技术总结
本发明属于抗菌活性研究领域，公开了一种愈创木烷型倍半萜类化合物的制备方法及其在抗植物病原真菌方面的应用。本发明首先将宽叶山蒿Artemisia stolonifera的叶片干燥、浸提、浓缩后，通过萃取得到粗馏分，进一步采用正向硅胶、葡聚糖凝胶、反相大孔树脂等柱层析法进行纯化，最后通过液相制备得到3个愈创木烷型倍半萜类化合物。本发明的化合物可有效抑制油菜菌核菌、玉米小斑病菌和马铃薯黄萎病菌的生长，moxartenolide最小抑菌浓度MIC分别为6.25、12.5、12.5μg/mL，artemdubolide C最小抑菌浓度MIC分别为12.5、12.5、12.5μg/mL，artemvulactone F最小抑菌浓度MIC分别为12.5、12.5、12.5μg/mL，在抗植物病原真菌方面具有非常大的应用潜能。具有非常大的应用潜能。具有非常大的应用潜能。


技术研发人员：刘大会 吴婷 杨小龙 王文静 李双鸽 计荣盛
受保护的技术使用者：湖北中医药大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/14